ENDOCRINOLOGÍA

Análisis del desempeño de seis inmunoensayos para gonadotrofina coriónica humana
Estudio en Enfermedad Trofoblástica Gestacional

Performance analysis of six immunoassays for human chorionic gonadotropin measurement
Follow up during Gestational Trophoblastic Disease

Elsa Filgueira¹, María Teresa Pessacq², Mónica Saavedra³, Jorge Schweizer⁴, María Inés Portillo⁵, María de Luján Calcagno⁶, Cecilia Fenili⁷

^1. Bioquímica, Especialista en Bioquímica Clínica, Área Endocrinología, UBA. Lab. Hospital Santojanni. Pilar 950, Ciudad Autónoma de Buenos Aires. CP 1408.
^2. Bioquímica, Dra en Ciencias Químicas, Orientación Biológica, UNLP. Lab. Pessacq. Calle 7 1557, La Plata, Provincia de Buenos Aires. CP 1900.
^3. Bioquímica, Especialista en Bioquímica Clínica, Área Endocrinología, UBA. Lab. Centro Gallego de Bs. As. Av. Belgrano 2199, Ciudad Autónoma de Buenos Aires. CP 1094.
^4. Bioquímico, Especialista en Bioquímica Clínica, Área Endocrinología, UBA. Lab. Hospital B. Houssay. Hipólito Irigoyen 1757, Florida, Provincia de Buenos Aires. CP 1602.
^5. Bioquímica, Especialista en Bioquímica Clínica, Área Endocrinología, UBA. Lab. Clínica y Maternidad Suizo-Argentina. Av. Pueyrredón 1461, Ciudad Autónoma de Buenos Aires. CP 1118.
^6. Bioquímica, UBA, Cátedra de Matemática y Estadística, FFyB, UBA. Junín 950, Ciudad Autónoma de Buenos Aires. CP 1113.
^7. Bioquímica, Especialista en Bioquímica Clínica, Área Endocrinología, UBA. Lab. Bioanalítica. Junín 933 1° A, Ciudad Autónoma de Buenos Aires. CP 1113.

Resumen

El dosaje sérico de la hormona gonadotrofina coriónica (hCG) tiene potencial valor diagnóstico en distintas patologías como la Enfermedad Trofoblástica Gestacional (ETG). Se evaluó el desempeño de los inmunoensayos: hCGStat y hCG+b Elecsys2010; hCG ACS-180; hCGTotal AxSYM y hCG Access, frente a hCG Immulite, método que reconocería todas las formas moleculares relacionadas a la hCG. Las mediciones se efectuaron en 77 muestras séricas de 8 pacientes obtenidas durante el seguimiento post-legrado uterino de ETG. Se hallaron diferencias significativas entre las medias de los 6 inmunoensayos (p < 0,0001). Al evaluar los desvíos relativos porcentuales promedio (DRPp) de las muestras de cada paciente y los de cada muestra (DRPm) por cada inmunoensayo frente al método hCG Immulite, se observaron DRPp desde (-46%) hasta (+76%), según el método, y DRPm entre (-82%) y (+105%). Se concluye que las diferencias entre los DRPp reflejan las importantes discrepancias entre los resultados de hCG obtenidos por los diferentes métodos evaluados. Las diferencias entre los DRPm hallados con un mismo inmunoensayo durante el seguimiento de una misma paciente reflejarían la capacidad del método para reconocer las formas moleculares presentes en las distintas muestras a lo largo del seguimiento, atribuibles principalmente a la diferente especificidad, estandarización y calibración de los inmunoensayos.

Palabras clave: gonadotrofina coriónica humana* formas moleculares de gonadotrofina coriónica humana * enfermedad trofoblástica gestacional* mola hidatiforme* mola invasiva* coriocarcinoma* inmunoensayos* análisis de desempeño

Summary

A wide variety of human chorionic gonadotropin (hCG) related molecules, which are the product of hormones synthesis and metabolization circulate in biological fluids (molecular heterogeneity). The proportion of the different molecular forms of hCG varies in sera samples of patients under different clinical situations. The results of hCG dosed in sera samples corresponding to patients during follow-up of Gestational Trophoblastic Disease (ETG) with hCGStat and hCG+b, Elecsys2010; hCG ACS-180; hCGTotal AxSYM, hCG Access against hCG Immulite have been compared. Significant differences between hCG results were found (p < 0.0001). The mean relative bias of all the samples results from a patient (DRPp) in the different immunoassays was from (-46%) to (+76%), and the relative bias of samples results of the same patient obtained by each method (DRPm) against Immulite was from (-82%) to (+105%). Important differences for the same method in different samples during the same patient's follow up were found. In conclusion: the significant differences between the methods could be attributed to the molecular heterogeneity of hCG during ETG follow-up, to the specificity of the methods, their standardization and calibration. Therefore, hCG monitoring must be made with the same method.

Key words: human chorionic gonadotropin * molecular forms of human chorionic gonadotropin * gestational trophoblastic disease * hydatidiform mole * invasive mole * choriocarcinoma * immunoassays * performance analysis

INTRODUCCIÓN

La gonadotrofina coriónica humana (hCG) es sintetizada por el tejido trofoblástico normal (en el embarazo) y patológico (mola hidatiforme y coriocarcinoma). Además, es producida en la hipófisis de hombres y mujeres sanos, como así también por tumores de origen no trofoblástico. Presenta un PM ~ 36,7 kD y forma parte de la familia de las glicoproteínas heterodiméricas hipofisarias junto con LH, FSH y TSH.
En los fluidos biológicos circula una gran variedad de moléculas relacionadas a la hCG, producto de su síntesis y metabolismo. Las moléculas clínicamente importantes, descriptas según la nomenclatura recomendada por la IFCC (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine) y la CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute [ex NCCLS] (National Committee Chemistry Laboratory Standard) (1) son:
• hCG intacta (hCGi), de alta estabilidad y máxima actividad biológica, compuesta por dos subunidades, a y b. La subunidad a, común a LH, FSH y TSH, está compuesta por 92 aminoácidos y presenta dos sitios de unión "N" para oligosacáridos. La subunidad b, que le confiere la especificidad biológica a la hormona está compuesta por 145 aminoácidos, posee dos sitios de unión "N" y cuatro sitios de unión "O" para oligosacáridos en la región carboxilo terminal.
• hCG hiperglicosilada (H-hCG), forma molecular en la cual el 35% de su peso molecular corresponde a hidratos de carbono. También se denomina "Antígeno Trofoblástico Invasivo" (ITA) y está asociado al proceso de implantación en el embarazo temprano y a la invasividad y persistencia en la Enfermedad Trofoblástica Gestacional (ETG).
• hCG nicked (hCGn), forma parte de hCG con un corte enzimático sin pérdida de aminoácidos en las posiciones 47-48 ó 44-45 ó 51-52 de la subunidad b, parte de la región involucrada en la unión al receptor.
• Subunidad b Libre (hCG+b).
• Subunidad b Libre nicked (hCG+bn).
• hCG clivada (hCG+bCTP minus), molécula con pérdida parcial o total de aminoácidos en posiciones 115-145 de la región carboxilo terminal de la subunidadb.
• Fragmento b core (hCG+bcf), subunidad b degradada que está formada por dos péptidos (b 6-40 y b 55-92 unidos por uniones disulfuro), presente mayoritariamente en orina.
Las isoformas de hCG tienen diferentes epitopes o sitios antigénicos, que a veces están presentes en todas las formas moleculares de la hormona, y otras veces son exclusivos de alguna de ellas (2). El desarrollo de anticuerpos (Ac) monoclonales ha aumentado la especificidad de los inmunoensayos (IE), pero se observan discrepancias entre los resultados obtenidos por diferentes métodos (3-5). En el diseño de los IE se usan al menos un Ac dirigido a la hCG+by un segundo Ac a otro epitope estéricamente disponible (6). Lo importante es que, según a cuál de los epitopes estén dirigidos los Ac, serán las formas moleculares que se puedan detectar. Se han desarrollado métodos con capacidad para detectar sólo la hCGi, o la hCG Total (nicked y no nicked), o todas las formas moleculares relacionadas a la hCG. También hay métodos que detectan sólo la hCG+bo el hCG+bcf, que se utilizan como marcadores tumorales y en el screening prenatal de Síndrome de Down. Se ha demostrado que IE de supuesta capacidad para detectar todas las formas moleculares pueden sobreestimar o subestimar alguna de las variantes (7). Por otra parte, en la práctica cotidiana el término "dosaje de subunidadb" no discrimina entre los IE que dosan sólo la hCG+b de aquellos que miden hCG+hCG+b (hCG total).
Otro de los mayores inconvenientes que presentan los IE empleados para la determinación de hCG (común a los que miden péptidos y proteínas) es su estandarización (8). Las dificultades pueden atribuirse a las características del estándar internacional, IRP 75/537, empleado por la mayoría de los equipos comerciales, que es una preparación urinaria parcialmente purificada (9). Existen informes que afirman que esta solución de referencia contiene un 91% de hCGi y un 9% de hCGn (10). Esta solución no sería la adecuada para la calibración de los diferentes IE; además, los calibradores parcialmente purificados utilizados por los fabricantes (calibradores secundarios) también contienen diferentes proporciones de hCGn, hCG+bCTP minus, hCG+bo de hCG+bcf, que constituyen la mayor fuente de variación entre métodos (11). Inconvenientes inherentes a los IE también contribuyen a generar discrepancias en los resultados, como por ejemplo, rangos acotados de trabajo de los IE que obligan a realizar diluciones de las muestras, efectos "matriz" e interferencia de Ac heterófilos.
El dosaje de las diferentes formas moleculares de hCG tiene potencial valor diagnóstico en distintas patologías. La medición de la hCG es crucial en pacientes con ETG para determinar la masa tumoral, el éxito del tratamiento, la recurrencia y/o la persistencia de la enfermedad. En ETG la forma predominante de hCG presente tanto en suero como en orina es la intacta. En la Mola Hidatiforme (MH) se observa un ligero aumento de hCG+b de 1 a 10% del nivel de hCGi y puede detectarse una pequeña pero significativa proporción de H-hCG de hasta 10% de los niveles de hCGi. Post legrado uterino se produce un marcado descenso en los niveles de hCGi con aumento de las formas nicked en respuesta al tratamiento (12). En la ETP (Enfermedad Trofoblástica Persistente) hay niveles variables de hCGi en suero y orina, dependiendo de la cantidad de tejido trofoblástico remanente y se asocia a una mayor proporción de hCG+b (entre 2 y 10% de hCGi) y de H-hCG (hasta aproximadamente 40% de hCG). También se observa una alta proporción de formas nicked (hasta 100%) luego de la cirugía y la quimioterapia debido al metabolismo de la hCGi. En coriocarcinomas, tanto post-molares como post-gestacionales, las formas nicked y las formas hiperglicosiladas son las variantes que predominan en suero y en orina. En algunos casos de coriocarcinoma puede detectarse una alta proporción de hCG+b (5 a 40% de hCGi) (12)(13).
Al comparar los resultados de la medición de hCG por diferentes IE se hallaron diferencias significativas en muestras correspondientes al primer trimestre de un embarazo normal, donde la forma predominante es la hCGi (hCG+b alrededor del 1% de la hCG total y la hCGn aproximadamente 9%) (5).
El objetivo del presente trabajo es analizar el desempeño de 6 inmunoensayos para la medición de hCG en muestras de pacientes con diagnóstico de Enfermedad Trofoblástica Gestacional que presentan diferente composición de formas moleculares durante el seguimiento post-legrado uterino.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se determinó la hCG en 77 muestras séricas durante el seguimiento post-legrado uterino de ocho pacientes de las cuales cuatro presentaron diagnóstico de Mol Hidatiforme (MH), dos Mola Invasiva (MI) y dos Coriocarcinoma (CC), a las que se les solicitó consentimiento para ser incluídas en este estudio. Estas pacientes se separaron en dos grupos: el primero (G1) correspondiente a aquellas que alcanzaron valores de negativización (hCG < 2 mUI/mL) durante el seguimiento (MH1; MH2 y MH3); el segundo (G2) correspondiente a las pacientes que no resolvieron la enfermedad en el período evaluado y que presentaron valores de hCG > 200 mUI/mL (MH4, MI5, MI6, CC7, CC8).
Se emplearon 6 IEs (Tabla I): hCGStat (M2) y hCG+b (M3) Elecsys 2010 (Roche, Basilea, Suiza), hCG ACS-180 (Bayer, Tarrytown, New York, EE.UU.) (M4); hCG Total AxSYM (Abbott, Chicago, Illinois, EE.UU.) (M5), hCG Access (Beckman Coulter, Fullerton, California, EE.UU.) (M6). Se utilizó como inmunoensayo de referencia para la evaluación al equipo hCG Immulite (DPC, Los Angeles, California) (M1), método que según el Informe del año 2002 del Centro de Referencia de hCG (USA), reconocería todas las formas moleculares de la hormona presentes en ETG (7)(13).
Se calculó el porcentaje de hCG intacta (% hCGi) en cada muestra a partir de los resultados obtenidos con los métodos hCG Stat (M2) que detecta sólo hCGi y hCG+b (M3) que detecta hCGi, hCGn, hCG+by hCG+bcf.
Estadística: Se aplicó el Test de Friedman (ANOVA no paramétrico para medidas repetidas) con test a posteriori de Dunn. Desvío Relativo Porcentual Muestral (DRPm) = [(hCG (mUI/mL) medida por un método dado (Mx) - hCG (mUI/mL) medida por M1) / hCG (mUI/mL) medida por M1] x 100, para cada muestra. Se determinó para cada paciente por cada método el promedio de los DRPm y se lo denominó Desvío Relativo Porcentual Promedio (DRPp). Coeficiente de correlación por rangos de Spearman. En todos los casos se consideró significativo un nivel de significación menor que 0,05. El software usado fue: SPSS 10.0, InfoStat. GraphPad Instat (3.01).

Tabla I. Descripción de las características de los inmunoensayos evaluados.

RESULTADOS

Se hallaron diferencias significativas entre las medias de los 6 IE (Test de Friedman, F = 233,35; p < 0,0001). El test de Dunn reveló diferencia significativa entre hCG Stat y todos los demás métodos, entre hCG Access y hCG ACS 180, y entre hCG AxSYM y todos los métodos. Las medias, medianas y desviaciones estándar se muestran en la Tabla II.
En las Figuras 1A a 8A se presentan para cada paciente en cada muestra los resultados de hCG (mUI/mL) obtenidos por los diferentes IE durante su seguimiento, expresado en semanas post-legrado uterino (SPE).
En las Figuras 1B a 8B se representan en barras los DRPm para cada muestra por cada IE respecto de M1 en el seguimiento de cada paciente y el % hCGi para cada muestra con su respectivo valor en la parte superior del mismo. Al evaluar los desvíos relativos porcentuales promedio (DRPp) de las muestras de cada paciente y los rangos de DRPm para cada IE frente al M1 (Tabla III), se observó que los resultados de M2 presentaron DRPp menores o iguales a 46% y DRPm todos negativos y con valores de hasta 82%, atribuibles a que este IE detecta solamente a la hCG intacta. En el caso de M3 los DRPp fueron menores o iguales a 20%, lo que no reflejaría diferencias metodológicas de este IE con M1, aunque algunos DRPm fueron de hasta 50%, lo mismo que para M6, cuyos DRPp fueron menores o iguales a 21% y con DRPm de hasta 82%. En el caso de M4 en 6/8 pacientes el DRPp fue menor o igual a 11% pero en 2/8 pacientes el DRPp fue de 26 y 30%, respectivamente, con DRPm menores o iguales a 51%. Todos los DRPp de M5 fueron positivos con valores de 4 a 76% y con DRPm de hasta 105%.
Al analizar el % hCGi presente en las muestras en función de los DRPm de M2 (el único método que detecta exclusivamente a la hCGi) se halló un coeficiente de correlación de Spearman: r = 0,631 (P < 0,0001).

Tabla II. Estadísticos descriptivos de las mediciones de hCG (mUI/mL).

Tabla III. Desvíos relativos porcentuales promedio y rango de desvíos relativos porcentuales muestrales correspondientes al seguimiento de cada paciente por cada método.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Los métodos comerciales para la medición de hCG cuentan con el aval de la FDA (Food and Drugs Administration) sólo para su aplicación en diagnóstico y seguimiento del embarazo normal. Sin embargo, también son ampliamente utilizados a nivel internacional en el diagnóstico y seguimiento de ETG (13).
De los seis IE evaluados en este trabajo, cinco están diseñados para detectar el mayor número de variantes de hCG presentes en suero, a pesar de utilizar diferentes combinaciones de anticuerpos monoclonales. Sólo M2 tiene la capacidad de detectar exclusivamente a la hCGi y su fabricante aconseja su empleo únicamente en el diagnóstico y seguimiento del embarazo normal. La distinta especificidad de los IE justificaría en parte las diferencias halladas en los resultados de los cinco métodos respecto de M1.
En ETG las diferencias en la composición de las formas moleculares asociadas a hCG en distintas etapas del seguimiento de las pacientes hace que cada muestra en particular sea diferente de las demás. En algunas pacientes esto se debería a la desaparición del tejido productor de hCG en respuesta al tratamiento, al clivaje y a la disociación de hCG circulante durante su metabolismo. En otras pacientes se debería a la persistencia de tejido trofoblástico y al cambio de composición de las formas en respuesta a los diferentes tratamientos a los que son sometidas. Esto llevó a realizar un estudio de cada muestra (DRPm) de manera independiente, a pesar de que durante el seguimiento de cada paciente se observa un perfil de evolución de los valores de hCG similar para los distintos métodos (Figuras 1A a 8A).
El método hCG STAT (M2) siempre es el que arroja los menores resultados y en las pacientes del G1 se hallan mayores diferencias en las últimas muestras, alcanzado valores de negativización (< 2 mUI/mL) antes que con los otros IE estudiados y por lo tanto se pone en evidencia su ineficacia para el seguimiento de ETG.
De los cinco métodos, M3, M4 y M6, que utilizan los anticuerpos anticommon b1 y anticommon b2, dos de los tres anticuerpos recomendados en el Workshop de hCG del año 2002 (14), fueron los tres métodos que presentaron las menores diferencias metodológicas con el método de referencia, con los menores DRPp (Tabla III, Figs. 1B a 8B). Al analizar los DRPm, obtenidos aun con estos IE, se puede observar que el comportamiento de los métodos fue diferente en algunas de las muestras en particular, arrojando DRPm de hasta 82%. Esto reflejaría diferentes capacidades para el reconocimiento de algunas formas moleculares presentes a lo largo del seguimiento.
El M5 (AxSYM) tuvo DRPp positivos en todas las muestras respecto al método M1 (Immulite) (Tabla III, Figs. 1B a 8B). Esto sería atribuible a un desvío sistemático debido a una diferente estandarización secundaria del método.
El método M2 (hCG STAT) tuvo DRPp negativos en todas las muestras respecto al método M1 (Tabla III). En las Figuras 1B a 8B se observa que, al disminuir el % de hCGi, los DRPm negativos son mayores, reflejando gráficamente su especificidad para reconocer exclusivamente a la molécula intacta.
La estandarización de los IE que miden analitos heterogéneos como la hCG es un problema difícil de resolver (8)(15). El estándar internacional, IRP 75/537, empleado por la mayoría de los equipos comerciales para la medición de hCG, es una preparación urinaria parcialmente purificada. Se han utilizado bioensayos para determinar su potencia que se ha expresado en unidades internacionales arbitrarias (9), designándola como Preparación de Referencia Internacional (IRP), con un valor de 650 UI/vial (1 µg de hCG pura = 9,3 UI). Existen informes que afirman que esta solución de referencia contiene un 9% de hCG nicked (10)(16). Por consiguiente, esta solución no sería la adecuada para la calibración de los diferentes IE.
En estos últimos años, un grupo de trabajo de la IFCC se abocó a la obtención de nuevas y caracterizadas preparaciones de referencia para hCGi, hCG+b, hCGa y tres formas parcialmente degradadas: hCGn, hCG+bn y hCG+bcf. Se determinó la concentración molar de la proteína pura por análisis del contenido de aminoácidos y se expresaron las concentraciones de estas soluciones en el Sistema Internacional de Unidades (mol/L).
Estas seis preparaciones fueron adoptadas por la OMS (Organización Mundial de la Salud) como nuevos primeros Reactivos de Referencia Internacionales para IE de hCG, con los siguientes códigos: hCG 99/688, hCG+b99/650; hCGa 99/720; hCGn 99/642, hCG+bn 99/692 y hCG+bcf 99/708 (1)(17). Estos nuevos estándares permitirían a los fabricantes determinar la reactividad cruzada de estas seis moléculas relacionadas de hCG en los IE e incluir esta información en los insertos.
Por otro lado, a pesar de que los fabricantes calibran sus ensayos frente al mismo IS 75/538, los calibradores secundarios –que contienen distintas proporciones de hCG clivada, hCG+by de hCG+bcf– no siempre son apropiados al diseño y la especificidad del IE. Por ejemplo, si la estandarización secundaria de dos métodos que utilizan la misma combinación de Ac (y que por lo tanto tendrían la misma especificidad) se realizara con dos materiales de calibración con diferentes proporciones de las formas moleculares, los resultados de hCG Total que arrojarían estos dos métodos podrían ser diferentes.
Por lo tanto, las diferencias observadas en los resultados de hCG no pueden ser sólo atribuibles a la presencia de variantes estructurales de la hormona en las muestras, sino también fundamentalmente a la especificidad de los IE (capacidad de los Ac de reconocer en un ciento por ciento todas y cada una de las formas moleculares) y a la composición de los calibradores secundarios utilizados por cada fabricante, contrastados con el mismo estándar internacional.
Los estándares puros de hCG para ser utilizados como estándares internacionales, que estarán disponibles en breve tiempo, no resolverán la totalidad de las discrepancias observadas entre los resultados. También se requerirá la utilización del mismo calibrador secundario por parte de todos los fabricantes de IE, que deberán, además, informar sobre las especificidades de los Ac empleados y finalmente expresar los valores de hCG en mol/L.
En conclusión, es importante la detección de todas las formas moleculares de hCG en el manejo de ETG, por lo cual un método que mida sólo la molécula intacta de hCG no sería un inmunoensayo adecuado para tal fin.
Las diferencias entre los DRPp reflejan las importantes discrepancias entre los resultados de hCG obtenidos por los diferentes métodos evaluados.
Los DRPm reflejan la capacidad del método de reconocer las formas moleculares presentes durante el seguimiento.
Además de hCG DPC Immulite, los métodos hCG+b Roche Elecsys 2010, hCG Bayer ACS-180, hCG Total Abbott AxSYM y hCG Beckman Access podrían ser utilizados en el diagnóstico de ETG pero, debido a las diferencias observadas, el seguimiento debería realizarse siempre con un mismo método.

Figura 1. Paciente 1 (MH).

Figura 2. Paciente 2 (MH).

Figura 3. Paciente 3 (MH).

Figura 4. Paciente 4 (MH).

Figura 5. Paciente 5 (MI).

Figura 6. Paciente 6 (MI).

Figura 7. Paciente 7 (CC).

Figura 8. Paciente 8 (CC).

Agradecimientos

A las empresas: Abbott División Diagnóstica, Bayer División Diagnóstica, Biodiagnóstico S.R.L., Roche Diagnostics Argentina y Tokatlian S.R.L. que proveyeron los reactivos empleados en este trabajo.

Correspondencia

Cecilia Andrea Fenili
Tacuarí 1389 7° B
1139 Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
E-mail: cecifenili@ciudad.com.ar

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Aceptado para su publicación el 9 de junio de 2006