HEMATOLOGÍA

Haplotipos de los genes bA y bS globina en la población de Campoma, Estado Sucre, Venezuela

bA and bS globin gene haplotypes in Campoma, Estado Sucre, Venezuela

Raquel Salazar Lugo^1*, María González^2*, Dinorah Castro-Guerra^3**, Anabel Arends^4***

^1. Doctora en Ciencias Biológicas .
^2. Licenciada en Biología.
^3. Doctora en Genética Humana.
^4. Médico-Hematólogo.

* Departamento de Bioanálisis, Escuela de Ciencias, Universidad de Oriente, Cumaná, Venezuela.
** Laboratorio de Genética Humana, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Caracas 1020A, Venezuela.
*** Laboratorio de Hemoglobinas Anormales "Dr. Tulio Arends", Hospital Universitario, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

Resumen

Los haplotipos del gen b-globina fueron empleados como marcadores genéticos en la población mestiza de Campoma, Estado Sucre, Venezuela. Se evaluaron 74 cromosomas, 70 para estudiar el gen bA y 4 para el gen bS; En el gen bA se observaron 11 haplotipos, donde los más frecuentes fueron el 2 (37,5%), seguido del 3 (20,7%) y el 5 (10,2%); los demás presentaron una frecuencia menor al 10%. El gen bS se encontró asociado al haplotipo Benin (50%) seguido del haplotipo Sen y de un haplotipo atípico. Cuando los resultados de los haplotipos bA fueron comparados con otros 17 grupos usando el árbol filogenético, se encontró que Campoma se agrupa con poblaciones mestizas que tienen alto componente africano, estando más cerca de la población negra norteamericana.

Palabras clave: haplotipos * genes bA y bS * Campoma (Venezuela) * anemia drepanocítica

Summary

b-globin gene cluster haplotypes were analysed in 70 bA and 4 bS globin gene-bearing chromosomes in a Venezuelan mixed population. Eleven haplotypes were observed in bA chromosomes, the three most common being 2 (37.5%), 3 (20.7%) and 5 (10.2%); all others showed prevalences below 10%. The bS gene cluster showed association with Benin haplotype (50%) and Sen haplotypes (25%) and an atypical haplotype (25%). When bA haplotypes were compared with those of 17 groups, using the phylogenetic tree, it was found that Campoma clustered with half-breed populations that have a high African component, being closer to the North American black population.

Key words: haplotypes * bA and bS globin gene * Campoma (Venezuela) * sickle-cell anemia

INTRODUCCIÓN

El análisis de los haplotipos del gen b-globina ha servido para interpretar y detectar el flujo de genes en una población, en estudios de evolución humana y en el diagnóstico prenatal de enfermedades relacionadas con estos genes. La asociación de los haplotipos con el gen bS ha permitido determinar un origen múltiple de este gen en África (1). Al respecto, se han identificado varios haplotipos relacionados con áreas específicas de África y Asia, llamados Benin (Ben), Bantú (CAR por las siglas en inglés Central America Republic), Senegal (Sen), Cameron (Cam) y Arabia Saudí (Árabe-Asiático); estos haplotipos coheredados con el gen bS explican parcialmente la heterogeneidad clínica de la drepanocitosis (2). En Venezuela se ha reportado que individuos homocigotos y portadores del gen bS presentan este cromosoma ligado mayoritariamente a los haplotipos Benin y Bantú (3).
En el caso del gen bA se han trazado relaciones entre africanos, euroasiáticos y las poblaciones de las islas del Pacifico (4)(5). Los trabajos de Long JC et al. (6), en particular, han servido de base para interpretar la distribución de los haplotipos en poblaciones americanas nativas y mestizas. En el país, los estudios de haplotipos ligados al gen bA son escasos, según destacan los trabajos de Olivero R et al. (7) y de Castro-Guerra D et al. (8) en las poblaciones mestizas de Maracay (Estado Aragua) y Panaquire (Estado Miranda), respectivamente, donde encontraron una frecuencia de 21 y 23,7% para el haplotipo 3. En cuanto a poblaciones autóctonas, Chacín M (9) realizó un estudio en individuos de la etnia Warao e identificó como haplotipos más frecuentes el 2 (26%) y el 6 (22%).
En este trabajo se presentan los resultados del estudio de los haplotipos de los genes bA y bS en la población de Campoma, Estado Sucre, y su relación con otras poblaciones del mundo, como una contribución al conocimiento genético de las poblaciones mestizas venezolanas.

MATERIALES Y MÉTODOS

La población estudiada es Campoma, localizada en el Estado Sucre, al noreste de Venezuela (10° 30' 10" de latitud norte y 63° 30' 45" de longitud oeste) (Fig. 1). El pueblo se estructuró muy probablemente a partir de individuos provenientes de un cumbe de negros insurrectos que se estableció en la región para el siglo XVII (10), consolidándose por la presencia de pequeños núcleos familiares que se ubicaron alrededor de la laguna de Campoma para mediados del siglo XIX. El crecimiento de la población se vio estancado a fines del siglo XIX y principios del XX debido a la inestabilidad geológica de la zona y a la alta incidencia de paludismo (11). La población actual es de aproximadamente 1.500 habitantes que viven de la agricultura de subsistencia (Según Censo Oficina de estadística y control del Estado Sucre, 1990).
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente. Además, se contó con el permiso y la aprobación por escrito del paciente o representante y se siguieron las normas de ética establecidas para trabajos de investigación en humanos, por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la declaración de Helsinki ratificada por la 29^th World Medical Assembly, Tokio, 1975.
Para el estudio se tomaron al azar simple, un total de 100 individuos a los que se les descartó la presencia de variantes hemoglobínicas por electroforesis a pH 8,6. De estos individuos el 6% presentó fenotipo AS. Tomando en cuenta esta frecuencia del gen bS se realizó el cálculo de la frecuencia de homocigotos que debería existir en la población dando por resultado dos individuos; estos fueron localizados, se les tomó una muestra de sangre y se les verificó el fenotipo por electroforesis, se les determinaron los parámetros hematológicos (Hb), Hematocrito (Hto) de acuerdo a Wintrobe M (12); se les cuantificó la HbF por el método de Betke KI et al. (13) y la hemoglobina A2 por cromatografía de intercambio iónico empleando el sistema comercial Helena laboratorios (Helena Laboratories, Beaumont, Texas, USA). Los haplotipos b-globina asociados con el gen bS fueron estudiados en estos dos homocigotos SS.
De los individuos con fenotipo HbAA se escogieron 35 para la determinación del haplotipo bA; estos individuos no estaban relacionados en primer grado y se les verificó que al menos un padre fuese de Campoma.

Figura 1. Ubicación geográfica de la población de Campoma, Estado Sucre, Venezuela.

Determinación de los haplotipos

Para la determinación de los haplotipos, el ADN fue obtenido a partir de glóbulos blancos utilizando el reactivo DNAzol (GibcoBRL). El análisis de los cinco sitios polimórficos (HindII 5' b, HindIII gE, HindIII gA, HincII yb y HincII3' yb) se realizó por amplificación de un fragmento de 50Kb del gen b-globina por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando los iniciadores y las condiciones descritas por Bavilaquia LRM et al. (14).
La asignación de los haplotipos en los heterocigotos se hizo suponiendo que los individuos portan al menos un haplotipo común reportado en la zona y el resto de los sitios de restricción constituyen el segundo haplotipo. La presencia o ausencia de los sitios de restricción se determinó visualizándolos por coloración con bromuro de etidio y se denotó con los signos más (presencia) o menos (ausencia) (+/-). La designación de los haplotipos se hizo de acuerdo con Long JC et al. (6).

Análisis estadístico

Para determinar si existía homogeneidad entre las poblaciones comparadas se hizo una prueba de Chi cuadrado (15); con el programa SATFILES (Prof. I. Barrai, Universidad de Ferrara, Italia) se probó la hipótesis de que las frecuencias genotípicas se ajustaban al equilibrio de Hardy-Weinberg y se estimó la heterocigosis del sistema. La matriz de distancia genética entre Campoma y las 17 poblaciones humanas comparadas, fue calculada usando la distancia DA (16)(17) la cual tiene un mayor poder discriminatorio entre grupos cercanamente relacionados. Las frecuencias del gen b-globina en las 17 poblaciones comparadas con Campoma para la determinación de la distancia genética fueron tomadas de los trabajos de Guerreiro JF et al. (18)(19); Long JC et al. (6); Castro-Guerra D et al. (8); Olivero R (7) y Pante-De-Souza G et al. (20). Con la distancia genética se construyó un árbol filogenético a través del método UPGMA (21) y del programa DISPAN (22).

RESULTADOS

Los dos individuos con anemia drepanociítica (fenotipo SS) tenían valores de Hb de 6,9 ± 0,61 g/dL y Hto 22 ± 1,16%; la hemoglobina fetal fue de 2,23 ± 1,69% y los valores de HbA2 de 3,19 ± 0,08% y presentaron un curso moderado de la enfermedad. Los cuatro cromosomas S evaluados presentaron el gen bS asociado con el haplotipo Ben (50%) en forma heterocigota, en un caso con el haplotipo CAR y en el otro con un haplotipo atípico.
De los 70 cromosomas estudiados para el gen bA se encontraron 9 haplotipos de los referidos por Long JC et al. (6) y dos haplotipos atípicos reportados por Villalobos-Arámbula AR et al. (23) en una población indígena mestiza mexicana (Tabla I). El haplotipo más frecuente fue el 2 (37,5%) seguido del 3 (20,7%) y el 5 (10,2%). El haplotipo africano más frecuente en esta población fue el 3; también se encontraron 2 haplotipos que se observan en mayor frecuencia en poblaciones africanas, el 13 y el 16, con una frecuencia menor de 10%. Los análisis de homogeneidad realizados entre Campoma y las poblaciones africanas (2 = 80,29 p < 0,0005 grados de libertad = 20); Campoma y poblaciones europeas (2 = 53,96 p < 0,005 grados de libertad = 10) y Campoma y poblaciones asiáticas (2 = 134,9 p < 0,0005 grados de libertad = 12) resultaron altamente significativos indicando que existía heterogeneidad entre esas poblaciones para la frecuencia de los alelos estudiados. La heterocigosis fue de 0,79 (p > 0,8) lo cual indica que el sistema se ajusta al equilibrio de Hardy-Weinberg.
Entre las poblaciones mestizas con alto componente africano, Campoma mostró menor distancia genética (0,0799) con los negros de EE.UU. Con respecto a las poblaciones africanas, Campoma mostró menor distancia genética con la Bantú (0,1579) y con las poblaciones europeas la menor distancia genética se observó con Alemania (0,1175) (Tabla II). En la Figura 2 se puede observar la agrupación de Campoma con poblaciones africanas y derivadas de africanos. A diferencia de las otras dos poblaciones mestizas venezolanas (Panaquire y Maracay) Campoma forma un subgrupo con la población negra norteamericana.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Tabla I. Frecuencia de los haplotipos del bloque de genes b-globina en Campoma, Estado Sucre, Venezuela.

Tabla II. Heterocigosis (x100, en diagonal) y distancia genética basada en la frecuencia de haplotipos del bloque de genes b-globina en 18 poblaciones humanas.

Figura 2. Árbol filogenético que muestra la posición relativa de Campoma en relación a otras poblaciones del mundo, considerando el bloque de genes b-globina.

La asociación del gen bS con el haplotipo Benin es similar a reportes ya hechos en individuos con anemia drepanocítica de otras regiones del país (3), diferenciándose de lo reportado por Vívenes - Lugo M et al. (24) para el Estado Sucre. Asimismo, las características clínicas de los dos pacientes homocigotos SS coinciden con la condición intermedia con que se relaciona el haplotipo Ben en la severidad de la anemia drepanocítica (2); sin embargo, cabe señalar que el fenotipo de esta enfermedad es el producto de muchos genes los cuales ejercen un efecto epistático que contribuye a la variación interindividual característica de estos pacientes (25).
Se encontró el haplotipo Ben en forma heterocigota en un caso coheredado con el haplotipo Sen y en el otro con un haplotipo atípico. El haplotipo Ben es junto con el Bantú, el más frecuente en Cuba, Colombia, Brasil y México (20)(26-28). La presencia de un haplotipo atípico ha sido reportada entre el 5-10% de los pacientes drepanocíticos y se explica por el dinamismo molecular del bloque de genes betaglobínicos; además, se ha determinado una heterogeneidad molecular del gen Beta S/Ben (29)(30).
El haplotipo en el gen bA que presentó la mayor frecuencia fue el 2, que coincidió con lo reportado en poblaciones europeas, en Melanesia y Polinesia, también en tribus brasileñas y en otras poblaciones venezolanas (3)(5)(8)(10)(18); este haplotipo es el segundo en frecuencia en poblaciones mexicanas de raíces africanas (28). Su presencia en Campoma es un indicio de mezcla con poblaciones europeas y/o amerindias.
Por otro lado, el haplotipo africano más frecuente en Campoma fue el 3, al igual que lo encontrado por Castro-Guerra D et al. (8) en la población de Panaquire, Estado Miranda, por Olivero R et al., (7) en Maracay (Estado Aragua) y por Vívenes-Lugo M et al. (24) en pobladores de los estados Sucre, Monagas y Anzoátegui. El haplotipo 3 es muy frecuente en poblaciones africanas de origen Benin (56,7%); de Nigeria (60%) y Bantú (40,6%). En Venezuela se puede afirmar que la cultura negro-africana predominante fue quizás la Bantú (10), la misma que se conoce para Cuba, Guadalupe y toda la zona del Caribe, regiones que estuvieron implicadas en el arribo de barcos esclavistas desde África a las colonias en América durante la época de auge de la colonización (3).
Por otro lado, la presencia en Campoma de dos haplotipos (el 13 y el 16) que mayoritariamente se han encontrado en las poblaciones Bantú y Benin, así como la frecuencia de 6% de la hemoglobina S confirman el aporte africano en esta población. Como es conocido, la hemoglobina S es la variante de la hemoglobina humana más frecuente; es originaria de África y fue introducida al continente americano con la llegada de los esclavos (3).
El análisis de distancia genética determinó que Campoma presenta menor distancia genética con poblaciones negras de los Estados Unidos con respecto a las poblaciones mestizas venezolanas, lo cual sugiere que esta población, a pesar de ser mestiza, tiene menor grado de mezcla que las otras poblaciones venezolanas estudiadas.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Dr. Alvaro Rodríguez-Larralde del Laboratorio de Genética Humana del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas por el apoyo en las determinaciones estadísticas.

Correspondencia

DRA. RAQUEL SALAZAR LUGO
Postgrado de Biología Aplicada
Laboratorio de Proteínas e Inmunotoxicidad
Cerro del Medio, Núcleo de Sucre, Universidad de Oriente,
Cumaná, Venezuela
Tel. +582934302270.
E-mail: raquelugove@yahoo.com

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Aceptado para su publicación el 12 de mayo de 2006