HEMOSTASIA Y TROMBOSIS

Síndrome de Pool de depósito
Revisión. Presentación de estudios de laboratorio

Storage Pool Disease.
Review. Clinical and laboratory assays

María Isabel Vizcargüénaga^1*

^1. Licenciada en Química
^* Laboratorio Diagno-Lab.

Resumen

El término Síndrome de Pool de Depósito (SPD) define un grupo heterogéneo de anormalidades plaquetarias congénitas que se caracterizan por deficiencia de gránulos citoplasmáticos en megacariocitos y plaquetas. Los pacientes presentan sangrado que puede variar de leve a moderada severidad. Se presenta como una trombopatía aislada o asociada a otras enfermedades hereditarias conocidas o a procesos adquiridos. Las plaquetas contienen cuatro tipos de gránulos citoplasmáticos clasificados de acuerdo con sus respectivas ultraestructuras, densidades y contenidos: gránulos a, gránulos densos, lisosomas y peroxisomas. Las plaquetas en el Síndrome de Pool de Depósito-a (a-SPD) o Síndrome de las plaquetas grises tienen disminución o ausencia de gránulos a y su contenido. Las plaquetas aparecen grises en el extendido de sangre periférica o en aspirados de médula ósea cuando se colorean con colorantes de Wright-Giemsa. El Síndrome de Pool de Depósito-d (d-SPD) se caracteriza por ausencia de gránulos densos en plaquetas y megacariocitos y el Síndrome de Pool de Depósito-ad (ad-SPD) no contiene gránulos densos y posee cantidad variable de gránulos a. Se presentan los estudios de laboratorio realizados a 4 pacientes. Se destaca la necesidad de realizar el estudio plaquetario por microscopía electrónica para llegar al diagnóstico de SPD.

Palabras clave: síndrome de Pool de depósito * gránulos a * gránulos densos * microscopía electrónica

Summary

The term Storage Pool Disease (SPD) defines a heterogeneous group of congenital abnormality of platelets characterized by deficiency of granules in megakaryocytes and platelets. The disorder is associated with mild or severe bleeding symptoms. It may present as an isolated platelet function defect, or be associated with a variety of congenital or acquired disorders. Platelets contain four main types of cytoplasmic granules classified according to their respective ultrastructures, densities and content: the a-granules, the dense bodies (or dense granules), the lysosomes and the peroxisomes. Platelets in the Storage Pool Disease-a (a-SPD) or Gray Platelet syndrome lack a-granules and their constituents. They appear gray on Wright-Giemsa stained blood smears. Storage Pool Disease d (d-SPD) is defined as a deficiency of dense bodies in megakaryocytes and circulating platelets and Storage Pool Disease ad (ad-SPD) is characterized by a deficiency of dense granules and a variable deficiency of platelet a-granules. Laboratory results from four (4) SPD patients are described. SPD platelets require the use of electron microscopy for reaching a definitive diagnosis.

Key words: storage Pool disease * a-granules * dense granules * electron microscopy

El término "Síndrome de Pool de Depósito" (SDP) describe un grupo heterogéneo de desórdenes hemorrágicos congénitos y/o adquiridos causados por deficiencia de los gránulos plaquetarios en cantidad y/o contenido.
Incluye: Síndrome de las plaquetas grises o Síndrome de Pool de Depósito-a (a-SPD): plaquetas con deficiencia en gránulos a en contenido y/o cantidad; Síndrome de Pool de Depósito-d (d-SPD): plaquetas con déficit en contenido y/o cantidad de gránulos densos; Síndrome de Pool de Depósito-ad (ad-SPD): plaquetas con déficit en contenido y/o cantidad en forma variable de gránulos a y densos.
El Síndrome de Pool de Depósito se puede presentar aislado como trombopatía exclusivamente o asociado a otras enfermedades hereditarias conocidas o a procesos adquiridos.

INTRODUCCIÓN

Las plaquetas circulan en estado de reposo en el vaso sanguíneo con endotelio normal. Cuando se produce injuria tisular, las plaquetas se adhieren al subendotelio expuesto (adhesión plaquetaria), se activan (activación plaquetaria), mecanismo que involucra un rápido cambio de forma seguido de la liberación del contenido granular (reacción de liberación) por ejemplo ADP, serotonina, que al interactuar con receptores específicos plaquetarios contribuyen al reclutamiento y posterior agregación plaquetaria.
Una de las funciones relevantes de la plaqueta en hemostasia y trombosis está relacionada a su rol como célula secretora de moléculas proteicas e inorgánicas en el sitio de injuria(1)(2), mecanismo mediado por los gránulos citoplasmáticos plaquetarios. Por lo tanto en esta revisión se realizará la descripción de los gránulos citoplasmáticos plaquetarios, cuya deficiencia en cantidad y/o contenido da origen al Síndrome de Pool de Depósito.

GRÁNULOS SECRETORES

Las plaquetas contienen principalmente cuatro tipos de gránulos citoplasmáticos clasificados de acuerdo con sus respectivas ultraestructuras, densidades y contenido en: gránulos a, cuerpos densos o gránulos densos, lisosomas y peroxisomas (3).
Los gránulos a y los densos se forman en el aparato de Golgi durante la etapa temprana de maduración del megacariocito y se transportan por la periferia del mismo a los microtúbulos y filamentos de actina (4)(5). A lo largo de este camino, los gránulos están en contacto con un cuerpo multivesicular que es la llave del almacenamiento y el compartimento de salida involucrado en la biogénesis de los gránulos a y densos (6).

gránulos a

Es la población granular más numerosa, con un promedio de 50 a 80 gránulos por plaqueta. Almacenan principalmente proteínas secretoras multifuncionales: proteínas adhesivas, factores de coagulación, factores de crecimiento, proteasas, proteoglicanos e inmunoglobulinas.
Se pueden dividir en dos grandes grupos: a) proteínas específicas plaquetarias ausentes en el plasma: Factor 4 plaquetario (F4P), b-tromboglobulina; b) proteínas idénticas a las del plasma, algunas sintetizadas por el megacariocito: Factor von Willebrand (FvW), factor V, trombospondina, entre otras y aquellas no sintetizadas por el megacariocito e incorporadas desde el plasma: fibrinógeno, albúmina. En la Tabla I se resume la información de las proteínas secretadas por los gránulos a.
La membrana del gránulo a tiene moléculas receptoras, alguna de ellas específicas como la P-selectina, ausente de la membrana plasmática de la plaqueta en reposo y que se transforma en un marcador cuando se expresa en la superficie celular luego de la activación plaquetaria (7).
Otros receptores, como la GPIIbIIIa, están presentes tanto en la membrana del gránulo a como en la membrana celular de la plaqueta en reposo.

Tabla I. Contenido de gránulos a.

Gránulos densos (cuerpos densos)

Las plaquetas tienen normalmente de 3 a 8 gránulos densos por plaqueta. Miden aproximadamente entre 200 a 300 nm de diámetro, con un pH luminal de 6.1.
Por observación en el microscopio electrónico presentan una morfología característica distinta de los otros gránulos citoplasmáticos: exhiben un centro denso rodeado por un halo claro. Esta alta densidad electrónica está dada por el elevado contenido de calcio y fósforo inorgánico (50% del total).
También se pueden visualizar por microscopía de fluorescencia, debido a la habilidad de incorporar colorantes fluorescentes derivados de la quinidina.
Estos gránulos contienen serotonina, Pool no-metabólico de ADP y ATP, calcio, pirofosfato.
La serotonina no se sintetiza en plaquetas y se incorpora activamente del plasma. Al liberarse produce vasoconstricción y facilita la unión de proteínas adhesivas a sus respectivos receptores.
Luego de la exocitosis, el ADP del Pool no-metabólico que no puede volver a sintetizarse, actúa como agonista sobre otras plaquetas a través de sus receptores específicos (P2Y1, P2Y12 y P2X1) (8) favoreciendo la agregación en el sitio de injuria. Existe otro Pool metabólico de adenin-nucleótidos localizado en el citoplasma que no se libera, pero es capaz de resintetizar ADP.
El ATP liberado se remueve rápidamente del plasma por enzimas a AMP y adenosina.
En la membrana se han identificado receptores como CD63, específicos del gránulo denso y lisosomas, y otros como la GPIIbIIIa y en menor concentración, GPIb (9).
Luego de la activación plaquetaria, el contenido granular se secreta y las proteínas de la membrana granular se traslocan a la membrana plasmática.

Lisosomas

Son los gránulos más pequeños, menos de 300 nm de diámetro al microscopio electrónico. Se presentan pocos gránulos por plaqueta con una estructura homogénea. Contienen enzimas: fosfatasa ácida, arilsulfatasa, b-glucuronidasa, entre otras. El rol de estas enzimas durante la activación plaquetaria está relacionado a la interacción con la pared vascular y la digestión de componentes de la matriz (3).

Peroxisomas

Además de los gránulos secretores descriptos previamente, se puede demostrar en plaquetas con una técnica citoquímica que detecta catalasa, la presencia de gránulos pequeños que son similares a los peroxisomas encontrados en otros tejidos (10).

SÍNDROME DE POOL DE DEPÓSITO CONGÉNITO

a) Síndrome de las plaquetas grises o Síndrome de Pool de Depósito-a
Fue descripto por primera vez en 1971 por Raccuglia G. (11). Se caracteriza por anormalidades morfológicas en megacariocitos y en plaquetas que aparecen grises en extendidos de sangre periférica o en aspirados de médula ósea cuando se colorean con colorantes Wright-Giemsa. Esto se debe a la ausencia de gránulos a en megacariocitos y en el citoplasma plaquetario (12). Por tal motivo, las plaquetas grises manifiestan ausencia y/o disminución de las proteínas sintetizadas en ellas (F4P, FvW, b-TG, etc) e incorporadas a ellas (fibrinógeno, albúmina, factor V, etc). Los otros gránulos plaquetarios (densos, lisosomas, peroxisomas) están en número normal.
La mielofibrosis medular que se presenta en esta patología se atribuye a la espontánea liberación de factores de crecimiento PDGF (Factor de crecimiento derivado de las plaquetas) y TGF-b-1(Factor de crecimiento transformador-b-1) del megacariocito maduro.
La P-selectina está distribuida en forma anormal en membranas intracelulares del megacariocito maduro (13). Estudios ultraestructurales han demostrado la presencia de pequeños gránulos de alrededor de 0.1 mm de diámetro en el megacariocito de plaquetas grises los cuales serían los precursores de los gránulos a (14) y la P-selectina estaría localizada en las membranas de estos pequeños gránulos.
Las bases moleculares de este síndrome no se conocen pero podría involucrar a un receptor de selección cuando dejan el aparato de Golgi (15). En las familias estudiadas, la herencia es principalmente autosómica recesiva.
El mecanismo de sangrado en esta trombopatía no está claramente definido desde el nivel molecular. Se sugiere que puede estar asociado a la falta de proteínas adhesivas como FvW, trombospondina y fibronectina que son necesarias para el contacto celular, la generación de trombina y posteriormente la agregación plaquetaria.
Los pacientes que presentan esta trombopatía relatan historia de sangrado mucocutáneo desde la infancia, caracterizado por hematomas fáciles y petequiado, epistaxis, menorragia y particularmente sangrado post-operatorio y post-trauma que puede variar desde leve a moderada severidad.
Cursan con tiempo de sangría alterado asociado a una trombocitopenia moderada (el recuento plaquetario puede variar desde 80 x 103/mm³ hasta normal). La respuesta de la agregación plaquetaria es variable: algunos pacientes cursan con alteración en colágeno, trombina y ADP y otros presentan agregación plaquetaria normal con adrenalina y ADP.
Los niveles plasmáticos de Factor 4 plaquetario y b-tromboglobulina se encuentran elevados indicando que el defecto no es la síntesis de éstos en el megacariocito sino el almacenamiento de los mismos en los gránulos a.
El examen de las plaquetas por microscopía electrónica es de suma utilidad para confirmar el diagnóstico. Las plaquetas presentan mayor tamaño que el normal. En el citoplasma se observan gránulos densos y mitocondrias, pero hay una marcada disminución o ausencia de gránulos a (16).
Las patologías plaquetarias asociadas al Síndrome de las Plaquetas Grises son Síndrome Quebec y Síndrome Jacobsen o París-Trousseau.

Síndrome Québec
Es una anormalidad plaquetaria autosómica recesiva, caracterizada por sangrados importantes post-trauma que no responden a las transfusiones plaquetarias. La agregación plaquetaria es deficiente sobre todo usando adrenalina como inductor.
Las plaquetas contienen proteasas que degradan las proteínas del gránulo a, inclusive la P-selectina, pero la ultraestructura del mismo está conservada.
Se ha descripto que el gránulo a almacena mayor concentración del activador del plasminógeno tipo uroquinasa el cual puede desencadenar una activación intracelular espontánea de la cascada fibrinolítica generando plasmina (17)(18). En trabajos recientes se ha postulado el uso de inhibidores de la fibrinolisis para controlar el sangrado en esta patología (19).

Síndrome Jacobsen o París-Trousseau
Es un síndrome raro asociado a una diátesis hemorrágica leve caracterizado por trombocitopenia congénita, vida media plaquetaria normal y número aumentado de megacariocitos en médula; algunos de ellos presentan maduración anormal. En circulación se encuentran plaquetas con gránulos a gigantes, que son incapaces de liberar su contenido a la estimulación con trombina (20).

b) Síndrome de Pool de Depósito-d
El término Síndrome de Pool de Depósito-d (d-SPD) define una alteración congénita plaquetaria que se caracteriza por la ausencia y/o disminución en cantidad y/o contenido de gránulos densos en megacariocitos y plaquetas. Se puede presentar como trombopatía aislada o asociada a una serie de enfermedades congénitas. El gen responsable de esta patología no está identificado aún y el modo de herencia todavía no se conoce.
En la literatura están descriptas familias con herencia autosómica recesiva y familias con herencia autosómica dominante (21) (22).
Se ha identificado recientemente un transportador de nucleótidos MRP4 (ABCC4) (multidrug resistance protein) que se expresa en plaquetas y se encuentra en gránulos densos y se lo postula como posible gen implicado en esta patología cuando está afectado el almacenamiento de nucleótidos (23).
Las manifestaciones hemorrágicas características son: epistaxis, hematomas fáciles y/o espontáneos, hemorragia post-parto, sangrado post-cirugía o en extracciones dentarias
Los pacientes presentan tiempo de sangría prolongado y algunos autores relacionan este resultado como inversamente proporcional al contenido de ADP o serotonina almacenado en los gránulos densos (24).
En el estudio de función plaquetaria por agregación, la respuesta es variable o sea no hay una curva de reacción característica para cada inductor. Dado que existen trombopatías con una respuesta de agregación plaquetaria similar al Síndrome de Pool de Depósito, la microscopía electrónica es de particular ayuda para llegar al diagnóstico.
Las patologías asociadas con el d-SPD son los Síndromes de Hermansky-Pudlak (HPS) y Chediak-Hygashi (CHS).
El Síndrome de Hermansky-Pudlak es una enfermedad de organelas subcelulares que involucran anormalidades en melanosomas, gránulos d plaquetarios y lisosomas con herencia autosómica recesiva. Se caracteriza por albinismo oculocutáneo, diátesis hemorrágica debido al d-SPD y almacenamiento de un complejo lípido-proteico lipofucsina ceroide de etiología desconocida (25).
Se han identificado 7 genes involucrados en esta patología (HPS1, HPS2 (ADTB3A) y HPS3-7) (18). La subunidad b3A del complejo adaptador AP-3 está relacionada al tráfico vesicular intracelular, mientras que las proteínas HPS son componentes de complejos activos de la biogénesis de las organelas (26).
El Síndrome de Chediak-Hygashi es una patología caracterizada por diversos grados de albinismo oculocutáneo, abundantes gránulos citoplasmáticos peroxidasa positivos en neutrófilos y en células no hematopoyéticas, facilidad en sangrado caracterizado por el d-SPD e infecciones recurrentes asociadas a neutropenia, chemotaxia y actividad bactericida alterada. Este síndrome es letal principalmente en la primera década de la vida. La herencia es autosómica recesiva. El gen responsable del CHS codifica una proteína LYST caracterizada por distintos dominios que está involucrada en el "tráfico" de proteínas en las organelas subcelulares (18).
El síndrome de Wiskott-Aldrich y la Trombocitopenia de Ausencia de Radio (Síndrome de Tar) son dos tipos de trombocitopenias hereditarias asociadas al d-SPD (20).

c) Síndrome de Pool de Depósito -ad (ad SPD)
Este síndrome está caracterizado por alteración en contenido y/o cantidad de gránulos a y densos (d). Las características clínicas y las alteraciones en la función plaquetaria son similares a las que presentan los pacientes con d-SPD.

Síndrome de Pool de depósito adquirido
Este síndrome se puede presentar asociado a otras trombopatias adquiridas como resultado de dos mecanismos diferentes.
Uno de ellos se debe a activación in vivo de plaquetas y liberación parcial de contenido granular, tanto a como densos, en el contexto de daño o alteración vascular.
El segundo tipo de SPD adquirido está asociado a mielodisplasia, síndrome mieloproliferativo y leucemias crónicas como resultado de megacariopoyesis anormal asociado a mielodisplasia o malignidad (27).

ESTUDIO DE LOS PACIENTES

MATERIALES Y MÉTODOS

Se trabajó con los siguientes reactivos: adrenalina 10-6M (BioPool, St Louis, EE.UU.). Colágeno 2-5 mg/mL (Horm Nycomed, Alemania). Los siguientes reactivos son de SIGMA (St Louis, MO, EE.UU.); ADP 3,3 10-6M, ácido araquidónico 2,5 mM, ristocetina 1,5 mg/mL, luciferin-luciferasa 2 mg/mL, ATP 1,8 mg/mL, trombina 2-5 U/mL. Se usaron además tromboplastina (BioPool, St Louis, EE.UU.); Suspensión de cefalina: extracto de Bell y Antón, extracto clorofórmico de tromboplastina de cerebro de conejo; plaquetas liofilizadas (BioPool, St Louis, EE.UU.); Reactivo de von Willebrand (STAR Lia-Test vWF, Diagnostica Stago, Francia); Factor VIII (BioPool, St Louis, EE.UU).
Se realizaron las siguientes pruebas de laboratorio: Tiempo de Sangría, técnica de Mielke (28); adhesividad plaquetaria, técnica in vivo (método de Borchgrevik) (28); Recuento de plaquetas por cámara y observación de frotis periférico; agregación plaquetaria en plasma rico (método de Born) (28) en un agregómetro Chrono-log de doble canal modelo 440; Reacción de liberación de ATP (28) realizada en un Lumi Agregómetro Chrono-log, modelo 660 (Havertown, EE.UU.); microscopía electrónica plaquetaria (16)(29): fijación en glutaraldehido, post fijación en tetróxido de osmio e inclusión en epoxirresinas del centrifugado de plasma rico en plaquetas. Se realizaron con Microscopio Electrónico Zeiss EM 900 (Jena, Alemania); cofactor de ristocetina, técnica de MacFarlane modificada (30); dosaje de Factor von Willebrand, método inmunoturbidimétrico de Lia-Test (31); tiempo de protrombina (método de Quick) (32), Tiempo de tromboplastina parcial activado, método de Proctor y Rapaport (32), tiempo de trombina (32), Factores II, V, VII-X, VIII, IX, XI XII (32).
Etapa preanalítica
Los pacientes no ingirieron medicación que alterara la función plaquetaria durante 7-10 días previos a los estudios.

Antecedentes hemorrágicos

Paciente 1
JG., sexo masculino, 32 años. Llega al laboratorio por consulta médica a raíz del nacimiento de su hija con plaquetopenia (30.000/mm³) y hematomas. Al interrogatorio familiar surgen resultados previos de plaquetopenia en el padre (propósito) y en la abuela paterna. Antecedentes hemorrágicos del propósito: hematomas espontáneos, hematomas muy importantes por pequeños golpes, gingivorragias, epistaxis, antecedentes que hasta ese momento no le habían llamado la atención, aunque recuerda que eran problemas desde la infancia. El paciente hasta ese momento no había tenido extracciones dentarias ni operaciones.

Paciente 2
MM, sexo femenino, 34 años. Consulta al médico hematólogo por hematomas fáciles y espontáneos, sangrado muy importante post-extracción dentaria. La paciente no tuvo partos ni operaciones previas. Relata varias consultas médicas previas y estudios sin llegar a un diagnóstico.

Paciente 3
NT, sexo femenino, 15 años. Derivada al laboratorio por posible enfermedad de von Willebrand. Antecedentes: hematomas fáciles y espontáneos, epistaxis. No relata operaciones ni extracciones dentarias hasta ese momento.
El padre no presenta ningún antecedente de sangrado. La madre, LT (Paciente 4) relata antecedentes de sangrado.

Paciente 4
LT, sexo femenino, 45 años. Relata hematomas fáciles y espontáneos, epistaxis, sin sangrado en los partos. Hasta el momento del estudio de la hija estaba diagnosticada como posible enfermedad de von Willebrand.

RESULTADOS

En la Tabla II se muestran los resultados de laboratorio de las pruebas realizadas a los pacientes.
Además de las pruebas presentadas se realizaron a todos los pacientes tiempo de Quick, APTT, tiempo de trombina y dosaje de Factores II, V, VII, IX, XI y XII, dando valores normales (datos no presentados).

Tabla II. Resultados de las pruebas de laboratorio

Microscopía electrónica plaquetaria

Paciente 1
Plaquetas con disminución de gránulos a (40%) (Figura 1), gránulos densos muy escasos (Figura 2), marcada variación en forma y tamaño plaquetario (Figura 3). Existe variación en el desarrollo de las expansiones citoplasmáticas, disminución de granos de glucógeno. Para comparar, plaquetas normales (Figura 4).
Confirma el resultado de Síndrome de Pool de Depósito-ad.

Figura 1. Plaquetas con disminución de gránulos a. (GD: Gránulo denso), (GA: Gránulo a).
(x 20000).

Figura 2. Plaquetas con gránulos densos muy escasos. (GD: Gránulo denso), (GA: Gránulo a).
(x 20000).

Figura 3. Marcada variación en forma y tamaño plaquetario.
(x 20000).

Figura 4. Plaquetas normales (GD:Gránulo denso), (GA: Gránulo a).
(x 20000).

Paciente 2
En el estudio ultraestructural se observan tres poblaciones de plaquetas: una normal, otra con ausencia total de gránulos a y densos y la restante con marcada disminución de los mismos.
La imagen ultraestructural es compatible con la deficiencia Síndrome de Pool de Depósito-ad.

Paciente 3
Plaquetas de tamaño y formas conservadas, con plasmalema, red de filamentos subplasmales, granos de glucógeno y sistema de endomembranas sin alteraciones. El número, dimensión y densidad electrónica de los gránulos a se encuentran dentro de límites normales. Ausencia casi total de gránulos densos. En las escasas plaquetas en que son visibles los gránulos densos, aparecen de mayor tamaño que lo normal y ocupando totalmente la cavidad de la membrana envolvente. Conclusión: las alteraciones halladas son compatibles con el Síndrome de Pool de Depósito-d.

Paciente 4
Ausencia de gránulos densos compatible con el Síndrome de Pool de Depósito-d.

CONCLUSIÓN

Cuando el estudio de laboratorio y el interrogatorio del paciente lleven a pensar que se está en presencia de Síndrome de Pool de Depósito, es necesario confirmar el diagnóstico con microscopía electrónica plaquetaria y/o reacción de liberación.

Agradecimientos

Al Dr. Rubén Pedro Laguens, Dra. Patricia Laguens y grupo de trabajo en el Servicio de Anatomía Patológica de la Fundación Favaloro por la realización de los estudios de microscopía electrónica plaquetaria.

Correspondencia

DRA. MARÍA ISABEL VIZCARGÜÉNAGA
Diagno-Lab.
Charcas 4167
1425 CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES. Argentina

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Aceptado para su publicación el 28 de agosto de 2006