HEMOSTASIA Y TROMBOSIS

Diagnóstico molecular de factores de riesgo protrombóticos en pacientes dializados

Molecular diagnostic of prothrombotic risk factors in dialysed patients

Alejandra Larregina^1*, Niels Suldrup^2*, Noemí Mutti^2*, Enrique Reimer^3*, Nélida Nora Polini^4**

^1. Médica hematóloga.
^2. Bioquímico.
^3. Licenciado en Bioquímica.
^4. Doctora en Bioquímica.

* IACA Laboratorios. Bahía Blanca. Argentina.
** Cátedra de Análisis Clínicos II. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, UNS. Bahía Blanca, Argentina.

Resumen

La enfermedad tromboembólica es un desorden multifactorial que resulta de la interrelación entre factores adquiridos y factores genéticos. Los estados hipercoagulables o trombofilia causan aumento en el riesgo de desarrollar trombosis. El objetivo de este trabajo fue evaluar en 100 pacientes hemodializados crónicos, 29 mujeres y 71 varones, la presencia de tres factores de riesgo protrombóticos: el factor V Leiden, la protrombina 20210 y la metilén tetrahidrofolato reductasa termolábil. Del estudio de las mutaciones puntuales surgió que un paciente fue homocigota para el factor V Leiden; otro, homocigota para la protrombina 20210 y por último, 14 enfermos presentaron la mutación de la metilén tetrahidrofolato reductasa termolábil, de los cuales 6 fueron homocigotas y 8 heterocigotas. Estos hallazgos deben ser tenidos en cuenta al indicar el tratamiento anticoagulante en aquellos pacientes donde peligren sus accesos venosos, ya que de ello depende su mejor calidad de vida.

Palabras clave: factores de riesgo protrombóticos * pacientes dializados crónicos

Summary

Thromboembolic disease is a multifactorial disorder that results from existing relations between acquired and genetic factors. Hypercoagulation states or thrombophilia increase the risk of thrombosis development. The aim of this study was to evaluate the occurrence of three prothrombotic risk factors: factor V Leiden, prothrombin 20210 and methylenetetrahydrofolate reductase thermolability in 100 chronic hemodialysed patients, 29 women and 71 men. Point mutation study showed that one patient was homozygote for factor V Leiden, another was heterozygote for prothrombin 20210, and finally 14 patients presented mutated methylenetetrahydrofolate reductase thermolability, 6 homozygote and 8 heterozygote. Those findings must be kept in mind when anticoagulant treatment is indicated to those patients having venous access danger, considering their best quality of life.

Key words: prothrombotic risk factors * chronic hemodialysed patients

INTRODUCCIÓN

La enfermedad tromboembólica es una entidad multifactorial que resulta de la interrelación entre factores adquiridos y factores genéticos (1-3).
La trombofilia o los estados de hipercoagulabilidad son trastornos de la hemostasia en los cuales existe tendencia a desarrollar trombosis. Los pacientes tienen eventos trombóticos a edad temprana (antes de los 45 años), espontáneos y en territorios poco frecuentes (cerebral, mesentérico y vena cava inferior) (4).
En 1965 Egeberg describió por primera vez una condición heredada de trombofilia, el déficit de antitrombina III. Posteriormente, en la década de los 80 se describieron los déficits de proteína C y proteína S y recién en 1993, la resistencia a la proteína C activada (5).
Durante los últimos años se han identificado dos alteraciones genéticas ligadas en forma directa a las trombofilias: el factor V Leiden (FV) y la protrombina 20210, y un factor de riesgo protrombótico independiente como la metilén tetrahidrofolato reductasa termolábil (MTHFR-tl) (6)(7).
En el factor V Leiden se produce una mutación puntual por sustitución específica de guanina por adenina en el nucleótido 1691 del gen del factor V de la coagulación. Esto provoca un reemplazo del aminoácido arginina 506 por glutamina, siendo éste el principal de los tres sitios de clivaje de la Proteína C activada (PCa) sobre el FV (8)(9).
La protrombina 20210 o G20210A es una mutación puntual sobre el gen de la protrombina ubicado en el cromosoma 11 (p11-q12) con 14 exones separados por 13 intrones. Se trata de un trastorno hereditario autosómico dominante caracterizado por una sustitución de guanina por adenina en la posición 20210 de la región 3' no traducida, manifestándose fenotípicamente en un aumento en los niveles de protrombina (10)(11).
La hiperhomocisteinemia es un factor de riesgo trombótico independiente para la trombosis venosa profunda, probablemente por acción directa de la homocisteína sobre las células endoteliales, por interferencia con la Proteína C activada o en la expresión de la trombomodulina. Puede haber formas adquiridas o heredadas. En las heredadas está alterada la enzima metilén tetrahidrofolato reductasa que provoca la variante termolábil. La mutación más frecuente es la sustitución de una citosina por timina en el nucleótido 677 (12).
Los pacientes en plan de hemodiálisis crónica constituyen una población con riesgo de complicaciones trombóticas, entre las cuales se encuentran las asociadas a las trombofilias heredadas y adquiridas, que inciden en la morbilidad de estos enfermos (13)(14).
El objetivo de este trabajo fue evaluar en pacientes hemodializados crónicos, la presencia de tres estados protrombóticos a través del estudio de las mutaciones para el factor V Leiden (R506Q), la protrombina 20210 (G20210A) y la metilén tetrahidrofolato reductasa termolábil (MTHFR-tl; C677T).

MATERIALES Y MÉTODOS

Se extrajeron muestras de sangre periférica anticoaguladas con EDTA (sistema Vacutainer) a 100 pacientes hemodializados crónicos que concurrieron al Centro de Diálisis FRESSENIUS MEDICAL CARE de la ciudad de Necochea.
En las muestras se determinó la presencia de las mutaciones puntuales para el factor V Leiden, la protrombina 20210 y la MTHFR-tl. Todos los procedimientos realizados concordaron con las normas éticas según la Declaración de Helsinki (15).

Extracción de ADN
El ADN genómico fue extraído por un método comercial no orgánico (Wizard, Promega, Madison, USA). El material fue conservado a -20 ºC hasta la realización de las PCR respectivas.

Primers
Las secuencias de los primers fueron sintetizadas por Invitrogen, California, EE.UU.

Reacciones de Amplificación
Las reacciones de PCR se realizaron utilizando la enzima Taq ADN polimerasa (Invitrogen) en un termociclador Gene Amp PCR System 2400 Perkin Elmer (Norwalk. CT (06859) USA), siguiendo las especificaciones del inserto. Los productos de amplificación fueron conservados en heladera a 4 ºC durante un lapso no mayor a 24 horas, antes de proceder al análisis de restricción.

Estudio molecular del Factor V Leiden (16)
El producto de amplificación obtenido de 267 pb fue digerido a 37 ºC por un período no menor a 3 horas con la enzima de restricción Mnl I (New England Biolabs).

Estudio molecular de la mutación G20210A (11)
El producto de amplificación obtenido de 506 pb fue digerido a 37 ºC por un período no menor a 3 horas con la enzima de restricción Hind III (Promega).

Estudio molecular de la mutación C677T (17)(18)
El producto de amplificación obtenido de 198 pb fue digerido a 37 ºC por un período no menor a 3 horas con la enzima de restricción Hinf I (Promega).

Análisis de los productos de digestión
Fue realizado mediante una corrida electroforética en gel de agarosa al 3% y visualización por coloración con bromuro de etidio. Los resultados se registraron por sistema de visualización fotográfica.

RESULTADOS

La edad promedio de los 100 pacientes analizados en este estudio fue de 62,3 años. La distribución por sexos fue de 29 mujeres y 71 varones.
Del estudio de las mutaciones puntuales surgió que un paciente fue homocigota para el factor V Leiden; otro, homocigota para la protrombina 20210 y por último, 14 enfermos presentaron la MTHFR-tl, de los cuales 6 fueron homocigotas y 8 heterocigotas (Fig. 1).

Figura 1. Presencia de mutaciones puntuales en la población estudiada.

La Figura 2 muestra en las calles 1, 2, 3, 5, 7 y 8 bandas provenientes de pacientes normales en donde la enzima corta en 2 fragmentos de 163 y 104 pb, respectivamente. En la calle 4 se ve el producto de la PCR sin digerir (control de amplificación). La calle 6 presenta las bandas de un paciente homocigota para el factor V Leiden de 200 y 67 pb.

Figura 2. Fotografía de la electroforesis en gel de agarosa coloreada con bromuro de etidio para el factor V Leiden.

La Figura 3 muestra en las calles 1, 5 y 8 bandas provenientes de pacientes normales en donde la enzima corta en 2 fragmentos de 406 y 100 pb, respectivamente. En la calle 2 se ven las bandas de 383 y 100 pb del paciente homocigota para la mutación de la protrombina 20210. La banda restante de 23 pb no se aprecia en la corrida electroforética por su tamaño y por la resolución que permite el gel de agarosa. La calle 4 muestra producto de la PCR sin digerir (control de amplificación).

Figura 3. Fotografía de la electroforesis en gel de agarosa coloreada con bromuro de etidio para la protrombina 20210.

La Figura 4 muestra en las calles 2 y 6 bandas provenientes de pacientes normales. Las calles 1, 3 y 5 muestran bandas de 175 pb provenientes de pacientes homocigotas. La banda restante de 23 pb no se aprecia en la corrida electroforética por su tamaño y por la resolución que permite el gel de agarosa. En la calle 4 se muestran las bandas de 198 y 175 pb del paciente heterocigota para la mutación MTHFR-tl.
No se pudo correlacionar estos datos con episodios trombóticos por no tener acceso a las historias clínicas de los pacientes.

Fig 4. Fotografía de la electroforesis en gel de agarosa coloreada con bromuro de etidio para la MTHFR-tl.

DISCUSIÓN

En los últimos 10 años el número de pacientes en hemodiálisis crónica se ha incrementado en forma exponencial. En los Estados Unidos este aumento es del 7 al 9% por año. A pesar del mejoramiento del proceso dialítico y de los tratamientos asociados, la mortalidad por año de los enfermos con insuficiencia renal crónica, relacionada con las complicaciones cardíacas, de los accesos vasculares e infecciosas alcanza al 25% (19)(20).
La enfermedad tromboembólica constituye una causa importante de morbilidad y mortalidad por su alta prevalencia. En los Estados Unidos la embolia de pulmón causa más muertes que el tromboembolismo venoso. Se diagnostican 355.000 pacientes por año que causan aproximadamente 240.000 muertes (21). Las formas de enfermedad son: trombosis venosa profunda y embolia pulmonar (22).
Los estados trombofílicos son una de las causas de la enfermedad troemboembólica y deben sospecharse en los pacientes en plan de hemodiálisis que presenten fenómenos trombóticos de los accesos vasculares y/o en sitios inusuales.
La prevalencia del factor V Leiden en la población general es bastante alta y en la raza caucásica se halló entre el 2 y el 15% (23)(24). Para la protrombina 20210 es de alrededor del 2% (25) y para metilén tetrahidrofolato reductasa termolábil, del 1,4 al 15% de la población (26).
En la población en estudio la prevalencia de las mutaciones estudiadas y en especial la MTHFR-tl es semejante a la descrita en la bibliografía para la población general (4). El 50% de los episodios trombóticos en pacientes con trombofilia se asocian a uno o más factores desencadenantes. En el caso de los enfermos en diálisis debe tenerse en cuenta la constante agresión al endotelio vascular, la liberación de citoquinas inflamatorias y la polimedicación. Por todo ello, el conocimiento de que un paciente en diálisis es portador de las mutaciones mencionadas debe sugerir la posibilidad de tratamiento profiláctico específico. El aumento de riesgo de sufrir episodios trombóticos disminuye el rendimiento del tratamiento y, por lo tanto, la calidad de vida de los enfermos que no pueden acceder a un transplante renal.

Correspondencia

DRA. ALEJANDRA LARREGINA
IACA Laboratorios
San Martín 68. 1er Piso
8000 BAHÍA BLANCA, Prov. de Bs. As., Argentina
Tel: 54-291-4881270
E-mail: hemato@hmabb.gov.ar

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Aceptado para su publicación el 14 de julio de 2006