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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. v.40 n.4 La Plata oct./dic. 2006

 

BIOQUÍMICA CLÍNICA

Aplicación de un método de electroforesis capilar al estudio de la glicosilación de albúmina in vitro

Capillary Zone Electrophoresis study of the in vitro albumin glycation process

María Mercedes Castañón1*, Noemí Steyerthal2*, Juan Miguel Castagnino2**, Graciela Garbossa2*

1. Lic. en Ciencias Químicas.
2. Dra./Dr. en Ciencias Químicas.

* Departamento de Química Biológica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Int. Güiraldes 2160. Pabellón II. Piso 4. Ciudad Universitaria. C1428EHA Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina.
** Laboratorio de Análisis Clínicos de Alta Complejidad Dres. Castagnino. Sarmiento 69. Piso 1. 1870 Avellaneda. Buenos Aires. Argentina.

Resumen

Los azúcares reductores como la glucosa pueden reaccionar no enzimáticamente con los grupos amino libres de las proteínas generando productos de glicosilación avanzados (AGEs). El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método de electroforesis capilar de zona (ECZ) para estudiar albúmina glicosilada in vitro. Se realizaron incubaciones de albúmina bovina y suero humano con glucosa (0,5 M) durante 12, 24 y 60 días. Como inhibidor de la glicosilación se utilizó aminoguanidina (AG; 0,5 M). Al finalizar la incubación la albúmina sérica fue separada por precipitación fraccionada y redisuelta en buffer fosfato-salino. La detección de AGEs fluorescentes (lexcitación=338 nm, lemisión 20 °C; ldet=200 nm) se observó prolongación de los tiempos de migración y ensanchamiento de los picos con el aumento del tiempo de incubación. Estos parámetros se redujeron sólo parcialmente en presencia de AG. En conclusión, la ECZ presenta mayor sensibilidad para discriminar estadios intermedios del proceso de glicosilación, resultando un método complementario al análisis por fluorometría utilizado para el estudio de AGEs.

Palabras clave: productos finales de glicosilación avanzada* electroforesis capilar * fluorometría * albúmina sérica bovina * albúmina sérica humana * aminoguanidina

Summary

Reducing sugars (such as glucose) can interact non-enzymatically with free amino-groups of proteins to form advanced glycation endproducts (AGEs). The objective of this work was to study the process of albumin glycation in vitro by Capillary Zone Electrophoresis (CZE). Bovine albumin (BSA; 50 mg/mL) and human serum (HS) were incubated with glucose (0.5 M) at 37 °C for 12, 24 and 60 days. Aminoguanidine (AG) was used as inhibitor (0.5 M). Afterwards, HS-albumin was separated by precipitation and redissolved in phosphate-saline buffer. Fluorescent AGEs (lexcitation=338 nm, lemission=442 nm) were detected after 12, 24 and 60 days of incubation. Fluorescence increased proportionally to the incubation times and AG was effective to inhibit the formation of fluorescent compounds. By CZE (boric acid 350 mM; pH 9,9; fused-silica gel capillary 50 µm x 50 cm; 25 kV; 90 µA; 20 °C; ldetection=200 nm) longer migration times (MT) and wider peaks (PW-50) were observed, as the incubation time was prolonged. MT and PW-50 were partially reduced in the presence of AG. It can be concluded that CZE is a highly sensitive method to detect intermediate products during the protein glycation process. This procedure can be considered complementary to the fluorometric analysis used in AGEs' study.

Key words: advanced glycation endproducts * capillary electrophoresis * fluorometric analysis * bovine serum albumin * human serum albumin * aminoguanidine

INTRODUCCIÓN

La reacción de Maillard constituye una cascada compleja de reacciones de condensación, reordenamiento, fragmentación y modificaciones oxidativas que ocurren durante el procesamiento de alimentos proteicos y su posterior almacenamiento en presencia de un alto contenido de azúcares reductores. Esta reacción descripta hace ya casi un siglo (1) genera productos heterogéneos cuyas estructuras, salvo algunas excepciones, no han sido aún completamente establecidas.
Básicamente, los azúcares reductores que poseen un grupo funcional aldehído, como la glucosa, se condensan con los grupos a-amino o e-amino libres de las proteínas formando un aducto o base de Schiff. Esta reacción, no enzimática y reversible, es seguida por un reordenamiento lento que genera los denominados productos modificados de Amadori. Éstos, luego de una serie de reacciones oxidativas y no oxidativas, forman productos de glicosilación avanzada (advanced glycation endproducts, AGEs), polímeros nitrogenados fluorescentes de color marrón que son el resultado de entrecruzamientos intra e intermoleculares.
Fuera del estudio de la química de los alimentos, la glicosilación no enzimática in vivo de la hemoglobina constituyó el primer hallazgo que, posteriormente, permitió explorar las reacciones de Maillard en sistemas biológicos (2). La síntesis de productos tempranos de glicosilación transcurre a una velocidad dependiente de la concentración de glucosa en el medio y la formación de aductos de Amadori alcanza el equilibrio luego de algunas horas o pocos días de contacto entre proteínas y glucosa. in vivo, esta reacción abarca el período de vida media de la mayoría de las proteínas plasmáticas y celulares. La formación de AGEs, en cambio, requiere períodos de semanas o meses para completarse. La naturaleza irreversible de la reacción favorece el aumento de su concentración en relación directa con la concentración de productos de Amadori y con la vida media de la proteína. Por este motivo, in vivo, la reacción es crucial para las proteínas (3), ácidos nucleicos (4) y lípidos (5) que poseen una vida media prolongada, sobre todo cuando se encuentran bajo condiciones de elevada concentración de glucosa como en la diabetes mellitus.
En los últimos años se ha identificado la estructura de algunos AGEs incluyendo carboximetil-lisina (6), pentosidina (7), pirralina (8) e imidazolona (9), los cuales coexisten en diferentes proteínas. El 90% de la carboximetil-lisina y de la pentosidina que se detectan en circulación están unidos a albúmina y su concentración aumenta en relación directa con la edad en pacientes diabéticos o con insuficiencia renal crónica tanto como en sujetos con función renal normal (10).
Algunos investigadores han postulado que la determinación de albúmina glicosilada podría utilizarse como marcador biológico de las complicaciones observadas en pacientes con diabetes, a diferencia de la hemoglobina glicosilada que sólo es un marcador biológico del estado glucémico. La albúmina glicosilada ya formada continuaría ejerciendo su influencia nociva durante toda su vida media, aún cuando se restableciera la normoglucemia (9). Si bien en la actualidad la detección y cuantificación de AGEs se realiza por métodos inmunohistoquímicos (11), fluorométricos (12), cromatográficos (13) y ELISA (14), aún no se ha propuesto y adoptado un método de referencia. En los últimos diez años la electroforesis capilar de zona (ECZ) ha mostrado ser una técnica de gran potencialidad para el laboratorio clínico. Entre sus principales ventajas cabe mencionar la rapidez con la que pueden llevarse a cabo las determinaciones, además de la posibilidad de emplear pequeñas cantidades de muestra y reactivos y su versatilidad para separar analitos de muy diverso peso molecular, neutros o cargados. Las aplicaciones de la ECZ incluyen el fraccionamiento de proteínas séricas, urinarias y de líquido cefalorraquídeo, la demostración de variantes de hemoglobinas, cuantificación de lipoproteínas, screening de drogas y diagnóstico molecular de enfermedades genéticas (15). El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método de electroforesis capilar de zona para estudiar albúmina glicosilada in vitro.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Formación de AGEs
Se incubó albúmina bovina sérica (BSA, 50 mg/mL, Sigma A 0281) con dos concentraciones de glucosa (0,05 y 0,5 M) durante 60 días. Se incluyó una solución control de BSA que fue mantenida en idénticas condiciones. Las soluciones de BSA y glucosa fueron preparadas en PBS 0,05 M (NaCl 0,15 M en Na2HPO4/NaH2PO4 0,05 M, pH 7,4) y esterilizadas por filtración a través de membranas de 0,22 µm de diámetro de poro (Millipore). Las incubaciones fueron realizadas a 37 °C con agregado de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1,5 nM, EDTA 1 mM, penicilina 100 µg/mL y gentamicina 40 µg/mL. Finalizado el período de incubación, el exceso de glucosa no covalentemente unido a BSA fue removido por ultrafiltración en tubos Centricon YM-10 (Amicon, Millipore, cut-off 10.000) que fueron centrifugados a 5.000 g, 1 hora a 4 °C. La solución de BSA fue lavada dos veces con PBS estéril. La concentración proteica fue determinada según el método de Lowry (16) y ajustada a 100 µg/mL con PBS estéril.

2. Evaluación de la formación de AGEs
2.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE): Las soluciones proteicas fueron sometidas a fraccionamiento electroforético en gel de poliacrilamida (T=7%) en condiciones desnaturalizantes con dodecil-sulfato de sodio (SDS), aplicando un sistema discontinuo de buffers según Laemmli UK (17). La tinción de las proteínas se realizó con azul brillante de Coomassie R250 (0,2% en metanol:ácido acético:agua 25:10:65). El peso molecular fue estimado por comparación con marcadores de peso molecular (Kaleydoscopio, Bio-Rad).
2.2 Isoelectroenfoque (IEF): El punto isoeléctrico (pI) de las proteínas se determinó por un método en placa horizontal de poliacrilamida (T=5%), utilizando un equipo Multiphor II (LKB, Bromma, Estocolmo, Suecia). El gradiente de pH de rango 3-10 fue producido con una mezcla de anfolitos (Pharmalyte 3-10, Amersham Pharmacia) y se emplearon NaOH 1 M y ácido aspártico 0,04 M como soluciones electródicas. Las condiciones eléctricas aplicadas fueron: voltaje máximo 2.000 V, intensidad máxima 15 mA y potencia constante 8 Watt. Finalizado el IEF se constató el gradiente de pH por elución de zonas continuas del gel de poliacrilamida (0,5 cm de longitud x 1 cm de ancho) en agua desionizada y medición de pH en un equipo Acid-Base Analyser PHM 71 (Radiometer, Copenhagen, Dinamarca). Luego se procedió a la fijación (solución de ácido sulfosalicílico 5% y ácido tricloroacético 10%) y tinción de las proteínas (azul brillante de Coomassie R250 0,2% en metanol: ácido acético: agua 25:10:65). Se utilizaron marcadores de pI de rango 4,45 a 9,6 (Bio-Rad # 161-0310).
2.3 Espectrofluorometría (EF): Se utilizó un espectrofluorómetro Aminco Bowman (Silver Spring, Maryland, EE.UU.) cuyas longitudes de onda (
l) de excitación y de emisión fueron calibradas empleando bisulfato de quinina (ICN #102791 RT) 5 µM en ácido sulfúrico 0,2 M (18). Las condiciones de operación para la evaluación de AGEs fueron establecidas utilizando una solución de BSA (50 mg/mL) incubada con glucosa (0,5 M) durante 90 días. En esta solución, la máxima emisión de fluorescencia se obtuvo a l=442 nm por excitación con luz de l=338 nm. Las mediciones de fluorescencia se expresaron como porcentaje relativo de aumento de fluorescencia respecto a la solución control. Cada medición de fluorescencia fue normalizada para una concentración proteica de 1 mg/mL.
2.4 Electroforesis Capilar de Zona (ECZ): Se utilizó un equipo de electroforesis capilar P-ACE SYSTEM 5.000 (Beckman, California, EE.UU.), provisto de un detector UV con arreglo de diodos (registro entre 190 y 500 nm). Las condiciones óptimas para el fraccionamiento de albúmina con distinto grado de glicosilación fueron establecidas considerando el efecto del diámetro interno del capilar, la fuerza iónica del buffer y las condiciones eléctricas aplicadas (19)(20). Se utilizaron capilares de sílica fundida de 50 µm ¥ 50 cm y de 75 µm ¥ 50 cm. Como buffer de separación se emplearon soluciones de ácido bórico entre 150 y 350 mM, tituladas hasta pH 9,9 con NaOH y se aplicaron voltajes entre 10 y 30 kV con intensidades de corriente resultantes entre 70 y 200 µA. La inyección de las muestras fue realizada en la porción anódica del capilar aplicando presión (50 mbar) durante 2 a 4 segundos. La temperatura de operación se fijó en 20 °C y la detección de las muestras se realizó a l=200 nm (ventana de detección 100 µm x 200 µm). Al finalizar cada desarrollo electroforético el capilar fue lavado con solución de NaOH 0,1 M, agua desionizada y luego regenerado con buffer de separación. Cada muestra fue evaluada por triplicado y se registró el tiempo de migración (TM) y el ancho a media altura de cada pico (A½) utilizando el programa CE-System Gold Software (Beckman Instruments). Todas las muestras y soluciones fueron filtradas previamente a través de membranas de 0,22 µm de diámetro de poro (Millipore).

3. Formación de AGEs en función del tiempo de incubación y en presencia del inhibidor.
3.1 Albúmina bovina: Para evaluar el proceso de glicosilación en función del tiempo se incubaron soluciones de BSA 50 mg/mL con glucosa 0,5 M durante 12, 24 y 60 días. Para estudiar la inhibición de la reacción de formación de AGEs se repitió el mismo esquema de incubación con el agregado de aminoguanidina (AG, 0,5 M, Sigma). Se incluyeron dos controles: BSA sin agregado de glucosa y BSA sin glucosa pero con agregado de AG. Las condiciones experimentales utilizadas fueron las previamente descriptas en 1. Formación de AGEs. En las soluciones finales se determinó la concentración proteica por el método de Lowry (16).
3.2 Albúmina humana: Se incubó suero humano (SH) diluido 1:2 con PBS y esterilizado por filtración (Millipore 0,22 µm) con glucosa 0,5 M a 37 ºC durante 12, 24 y 60 días. El esquema de incubación se repitió con el agregado de AG 0,5 M. Se incluyeron muestras controles de SH sin agregado de glucosa y otras con agregado de AG. Al finalizar la incubación se efectuó una precipitación fraccionada de albúmina (Alb-SH). Para ello, las globulinas del SH fueron precipitadas con solución saturada de sulfato de amonio (21). El sobrenadante, separado luego de centrifugar 15 min a 1.400 g, fue acidificado con HCl 0,1 M hasta pH 4,3 para precipitar la Alb-SH, la cual fue separada por centrifugación a 1.400 g, durante 15 min a 4 °C y resuspendida en PBS 10¥. Finalmente, las muestras fueron dializadas con PBS utilizando membranas Centricon YM-10 (cut-off 10.000) y su concentración proteica fue determinada por el método de Lowry (16). La efectividad de la precipitación fraccionada fue evaluada mediante SDS-PAGE y ECZ (17) (22). Por SDS-PAGE se observó la aparición de una banda proteica con movilidad electroforética y peso molecular similares al control de albúmina (66,5 kDa) (23), acompañada por tres componentes menores, de pesos moleculares comprendidos en el rango 150 a 200 kDa. El perfil obtenido por ECZ reveló la presencia mayoritaria de albúmina (90-96%) acompañada por escasa concentración de globulinas, probablemente fracciones a-2 y g-globulina.

4. Métodos estadísticos
Los datos obtenidos para cada esquema de incubación de BSA y Alb-SH por electroforesis capilar de zona (TM y A1/2) y por espectrofluorometría fueron analizados mediante un análisis de la varianza (ANOVA). Las diferencias entre las medias de los distintos grupos fueron comparadas utilizando el test de Tukey, con un nivel de significación a = 0,05.
Se utilizó el programa estadístico Statistica for Windows 2000 (StatSoft Inc., USA).

RESULTADOS

Estudio del proceso de glicosilación in vitro de albúmina bovina (BSA) en función de la concentración de glucosa
Con el propósito de estudiar el proceso de glicosilación proteica in vitro, se emplearon diferentes métodos para poner de manifiesto alteraciones físicoquímicas en las proteínas, tales como variaciones en el peso molecular (PM), punto isoeléctrico (pI), emisión de fluorescencia y movilidad electroforética.
En primera instancia, la BSA fue caracterizada por los mismos métodos que serían utilizados en los ensayos subsiguientes para investigar la progresión de la glicosilación in vitro. El análisis por SDS-PAGE reveló la presencia mayoritaria de una banda de 67 kDa correspondiente a albúmina, acompañada por dos bandas muy tenues con pesos moleculares de 85 y 60 kDa. El análisis por IEF mostró una banda proteica asociada a pI=4,8 que se corresponde con el pI de albúmina bovina. La solución de BSA (50 mg/mL) no reveló fluorescencia y por ECZ se observó un único pico agudo (TM = 10,0 ± 0,2 min; A1/2 = 0,21 ± 0,03 min).
La glicosilación proteica fue examinada en soluciones de BSA incubadas durante 60 días en ausencia (M-1 = BSA control) y en presencia de glucosa (M-2 = BSA+glucosa 0,05 M; M-3 = BSA+glucosa 0,5 M), las cuales fueron finalmente analizadas por SDS-PAGE, IEF, EF y ECZ.
La incubación prolongada a 37 °C (M-1) no modificó el PM, el pI, la movilidad electroforética ni la fluorescencia basal de BSA, datos que sugieren que la proteína no habría sufrido alteraciones como consecuencia de ese tratamiento térmico.
Luego de la incubación con baja concentración de glucosa (M-2), la proteína no mostró variaciones detectables de su PM ni de su pI, así como tampoco presentó emisión de fluorescencia. En cambio, la incubación con elevadas concentraciones de glucosa (M-3), produjo alteraciones estructurales de la proteína que, si bien no modificaron su PM aparente, dieron origen a dos bandas proteicas con diferente pI, una minoritaria correspondiente a BSA (pI=4,8), y otra mayoritaria con pI=4,7. Llamativamente, esta solución exhibía coloración amarilla y fluorescencia que podía ser observada a simple vista.
La Figura 1 reproduce los registros de absorbancia relativa en función del tiempo de migración, correspondientes a M-1, M-2 y M-3, en el que se han superpuesto los perfiles de los tres fraccionamientos realizados por ECZ. El gráfico refleja tanto la prolongación del tiempo de migración como el ensanchamiento del pico en las soluciones proteicas incubadas con concentraciones crecientes de glucosa, M-2 y M-3. Estos resultados fueron obtenidos luego de la optimización de las condiciones de operación: buffer ácido bórico 350 mM; pH 9,9; capilar 50 µm x 50 cm y voltaje 30 kV. Las muestras fueron evaluadas por triplicado y los parámetros que caracterizan el perfil electroforético (TM y A1/2) de cada una de las soluciones proteicas se indican en la Tabla I.


Figura 1. Electroforesis capilar de zona: modificación del perfil electroforético de albúmina bovina en función de la concentración de glucosa.
Albúmina bovina (BSA) fue incubada con diferentes concentraciones de glucosa por 60 días.
Muestras: M-1 (BSA), M-2 (BSA-glucosa 0,05 M) y M-3 (BSA-glucosa 0,5 M).
Se muestran superpuestos los electroforegramas (absorbancia vs. tiempo de migración) obtenidos aplicando las siguientes condiciones de operación: capilar de sílica de 50 µm x 50 cm; inyección: 50 mbar x 4 s; buffer ácido bórico 350 mM; pH 9,9; 30 kV; 114 µA; 20 °C; ldetección=200 nm.

Tabla I. Evaluación por electroforesis capilar de zona del proceso de glicosilación de albúmina bovina en función de la concentración de glucosa.

Estudio del proceso de glicosilación in vitro de albúmina en función del tiempo y su inhibición por aminoguanidina.
Con el propósito de examinar la glicosilación en función del tiempo, soluciones de BSA y suero humano (SH) fueron incubadas con glucosa 0,5 M durante 12, 24 y 60 días. El tiempo de incubación fue elegido teniendo en cuenta que la vida media de la albúmina humana oscila entre 17 y 21 días (23). La inhibición de este proceso se estudió en ensayos paralelos con agregado de aminoguanidina (AG). Este esquema de trabajo contó con los siguientes controles los cuales fueron incubados en las mismas condiciones experimentales: BSA; BSA+AG; SH; SH+AG. Finalizada la incubación, la albúmina sérica humana (Alb-SH) fue obtenida por precipitación fraccionada y redisuelta en PBS.
Ninguna de las proteínas de los ensayos controles presentó cambios en su pI, emisión de fluorescencia y/o movilidad electroforética. Estos resultados indican que no hubo alteraciones atribuibles a la incubación a 37 ºC o a la presencia del inhibidor. Por lo tanto, los cambios observados en las muestras tratadas con glucosa y/o glucosa-AG podrían estar asociados con modificaciones ocurridas durante el proceso de glicosilación.
El pI presentó un corrimiento (desde pI= 4,8 hacia pI= 4,7) únicamente en las soluciones de BSA incubadas con glucosa durante 60 días y en ausencia del inhibidor (M-5) (Fig. 2). Resultados similares fueron obtenidos con Alb-SH (datos no mostrados).
Por otra parte, en todas las soluciones de albúmina bovina y humana incubadas con glucosa se detectaron compuestos fluorescentes (Fig. 3), cuya concentración aumentó en función del tiempo de incubación. La fluorescencia relativa fue mayor para Alb-SH respecto de BSA. Como puede observarse en la Figura 3, la AG inhibió eficientemente la formación de productos fluorescentes a lo largo de todo el período de incubación.
En estas mismas soluciones se estudió el perfil electroforético por ECZ y se observó aumento del tiempo de migración y del ancho de pico a media altura a medida que se prolongaba el tiempo de incubación con glucosa, tanto para BSA (pico M-5 en la Fig. 4, panel A) como para Alb-SH (pico M-8 en la Fig. 4, panel B). Las modificaciones del perfil electroforético fueron más evidentes para albúmina humana que para albúmina bovina. Las soluciones fueron evaluadas por triplicado y en la Tabla II se indican los parámetros TM y A1/2 correspondientes a cada electroforegrama obtenido, expresados como media ± desvío estándar. Es interesante destacar que los TM de las soluciones de albúminas glicosiladas (M-5 y M-8) fueron significativamente mayores que los TM de sus respectivos controles (M-4 y M-7) desde los 12 días de incubación y que también aumentaron significativamente los A1/2 asociados a las proteínas glicosiladas. En la Figura 4 y la Tabla II puede observarse además, que AG inhibió la glicosilación tanto de albúmina de origen bovino (M-6) como de suero humano (M-9), ya que los picos detectados en esas soluciones siempre correspondieron a TM intermedios entre las proteínas controles (M-4 y M-7) y las glicosiladas (M-5 y M-8). No obstante, nunca se obtuvo una inhibición total del proceso de glicosilación. Además, si bien AG disminuyó visiblemente el A1/2 respecto de las modificaciones producidas en la proteína durante la incubación con glucosa sola (M-6 vs. M-5; M-9 vs. M-8), no se recuperó el aspecto basal de los picos correspondientes a las proteínas controles (M-4 y M-7).


Figura 2. Estudio por isoelectroenfoque del proceso de glicosilación-inhibición de albúmina bovina en función del tiempo de incubación.
Albúmina bovina (BSA) fue incubada con glucosa (glu; 0,5 M) por 60 días. Para evaluar la inhibición del proceso de glicosilación se agregó aminoguanidina (AG; 0,5 M).
Muestras: M-4: BSA; M-5: BSA-glu; M-6: BSA-glu-AG; CAG: control BSA-AG y MPI: Marcadores de punto isoeléctrico (se indican Hemoglobina A = 7,1 y Ficocianina = 4,8).


Figura 3. Estudio fluorométrico del proceso de glicosilación-inhibición de albúmina bovina y humana en función del tiempo de incubación.
Albúmina bovina (BSA) y suero humano (Alb-SH) fueron incubados con glucosa (glu; 0,5 M) por 12, 24 y 60 días. Para evaluar la inhibición del proceso de glicosilación se agregó aminoguanidina (AG; 0,5 M).
Las muestras fueron evaluadas por triplicado y las mediciones de fluorescencia (lexcitación=338 nm; lemisión=442 nm) se expresaron como media ± desvío estándar del porcentaje relativo de aumento de fluorescencia respecto a la solución control de albúmina (M-4 y M-7, respectivamente). Cada medición de fluorescencia fue normatizada para una concentración proteica de 1 mg/mL.
Los resultados del análisis estadístico (ANOVA de dos factores, test de Tukey, a = 0,05) se indican con letras mayúsculas (A a D). Los datos que comparten letra no presentan diferencias estadísticamente significativas.


Figura 4. Estudio por Electroforesis Capilar de Zona del proceso de glicosilación-inhibición de albúmina bovina y humana en función del tiempo de incubación.
Albúmina bovina (BSA) y suero humano (Alb-SH) fueron incubados con glucosa (glu; 0,5 M) por 12, 24 y 60 días. Para evaluar la inhibición del proceso de glicosilación se agregó aminoguanidina (AG; 0,5 M).
Tiempo de incubación: 1 = 12 días; 2 = 24 días y 3 = 60 días. Panel A: M-4 (BSA); M-5 (BSA-glu); M-6 (BSA-glu-AG). Panel B: M-7 (Alb-SH), M-8 (Alb-SH-glu); M-9 (Alb-SH-glu-AG).
Se muestran superpuestos los electroforegramas (absorbancia vs. tiempo de migración) obtenidos aplicando las siguientes condiciones de operación: capilar de sílica de 50 µm x 50 cm; inyección: 50 mbar x 3 s; buffer ácido bórico 350 mM; pH 9,9; 25 kV; 90 µA; 20 °C; ldetección=200 nm.

Tabla II. Evaluación por electroforesis capilar de zona del proceso de glicosilación-inhibición de albúmina bovina y humana en función del tiempo de incubación.

Albúmina bovina (BSA) y suero humano (Alb-SH) fueron incubados con glucosa (glu; 0,5 M) por 12, 24 y 60 días. Para evaluar la inhibición del proceso de glicosilación se agregó aminoguanidina (AG; 0,5 M).
Las muestras fueron evaluadas por electroforesis capilar de zona (Figura 4) por triplicado. Los parámetros tiempo de migración (TM) y ancho de pico a media altura (A1/2) correspondientes a los electroforegramas obtenidos se indican como media ± desvío estándar (DE).
Los resultados del análisis estadístico (ANOVA de dos factores, test de Tukey, a = 0,05) se indican con letras mayúsculas (A a F). Los datos que comparten letra no presentan diferencias estadísticamente significativas.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

La glicosilación es una modificación post-transcripcional de la estructura proteica que puede producirse espontáneamente en presencia de moléculas de azúcares, en la cual diversos monosacáridos se fijan a la proteína en los grupos e-amino de los residuos de lisina o hidroxi-lisina, así como en los grupos a-amino de los residuos amino terminales y de ácido siálico. Estos cambios moleculares en la estructura proteica, que llevan a la formación de AGEs, afectan la antigenicidad de la proteína así como la actividad química o catalítica y la movilidad electroforética. Aunque la glicosilación de proteínas es una reacción lenta, la reacción de unos pocos grupos amino con glucosa parece ser responsable de alteraciones en la sensibilidad alostérica, la unión de ligandos, la capacidad de fijación a receptores y la actividad enzimática (24).
En este trabajo se utilizaron varios métodos para evaluar la formación de AGEs en soluciones de BSA incubadas con distinta concentración de glucosa: SDS-PAGE, IEF, EF y ECZ. Si bien la técnica de SDS-PAGE no fue lo suficientemente sensible como para demostrar diferencias entre los pesos moleculares de la proteína nativa y la sometida a glicosilación, los cambios en la estructura molecular de esta última fueron percibidos, en forma indirecta, mediante la detección de proteínas con menor punto isoeléctrico luego de la incubación durante 60 días con alta concentración de glucosa (0,5 M; M-3). Se debe tener presente que la albúmina se glicosila en múltiples sitios pero que, fundamentalmente, la reacción ocurre en los grupos e-amino de los residuos lisina 199, 281, 439 y 525 (25). Por lo tanto, es muy probable que la formación de cetoaminas con menor carácter básico y leve modificación en el PM fuera responsable de esta modificación en el punto isoeléctrico. Por otro lado, algunas modificaciones estructurales de la albúmina glicosilada produjeron cambios que pudieron ser observados a simple vista, como el color amarillo y la fluorescencia observada luego de incubar la proteína con glucosa 0,5 M, aunque con menores concentraciones de glucosa (0,05 M; M-2) ni siquiera la fluorometría permitió distinguir variaciones. En contraste con las técnicas mencionadas, la ECZ permitió reconocer diferencias en el grado de glicosilación, las cuales se evidenciaron tanto en la menor velocidad de migración como en el ensanchamiento de los picos de los electroforegramas obtenidos con respecto a las proteínas nativas y entre las soluciones incubadas con distintas concentraciones de glucosa (M-3 vs. M-2 vs. M-1). La técnica reveló, además, la existencia de estadios intermedios de glicosilación no detectables por fluorometría y que, en consecuencia, son previos a la formación de AGEs.
La electroforesis capilar de zona permite separar los componentes de una muestra en función de su relación carga/masa, con la ventaja de que en el interior del capilar se genera una gran fuerza electroendosmótica (FEO) que produce un flujo de líquido hacia la salida del mismo permitiendo que todos los componentes de la muestra (cargados o no) puedan pasar por el detector. A pH 9,9 las proteínas presentan carga negativa, y como se inyectan en la porción anódica del capilar, su desplazamiento hacia el detector se produce principalmente por acción de la FEO, resultando menor tiempo de migración para aquellas proteínas con menor carga negativa neta. Por lo tanto, en el análisis realizado por ECZ (Fig. 1) (Tabla I), el aumento progresivo del TM de la proteína incubada con glucosa podría deberse a cambios en la carga neta de la misma (pérdida de carácter básico) como resultado de la glicosilación. Por otro lado, los múltiples sitios de glicosilación descriptos en la molécula de albúmina (25) favorecerían la síntesis de múltiples AGEs con cargas muy similares, cuya heterogeneidad estaría asociada al ensanchamiento de los picos. Ambas características, corrimiento del TM y ensanchamiento de los picos, también fueron descriptas por otros autores en estudios de ECZ realizados en similares condiciones de operación para evaluar la glicosilación in vitro de diversas proteínas séricas, entre ellas albúmina, fibrinógeno e inmunoglobulina G (26) (27).
En una segunda etapa de este trabajo se estudió por fluorometría y electroforesis capilar la glicosilación de albúmina en función del tiempo de incubación con glucosa. El aumento de la fluorescencia relativa característica de los AGEs (Fig. 3), la prolongación del TM y el aumento de A1/2 (Fig. 4) (Tabla II) fueron proporcionales al tiempo de incubación, resultados que denotan una modificación dinámica y acumulativa de la estructura de la proteína que fue parcialmente inhibida en presencia de AG.
Como se ha mencionado previamente, los AGEs son polímeros fluorescentes de color marrón cuya síntesis involucra reacciones de entrecruzamiento intra e intermoleculares y requiere lapsos de varias semanas para completarse. En tal sentido, debe destacarse que luego de 60 días de incubación con glucosa la solución presentaba coloración amarilla y fluorescencia que podía notarse a simple vista. En cambio, ninguna de estas características estuvo presente en aquellas soluciones incubadas en presencia de AG (Fig. 3), datos que ponen de manifiesto la inhibición de la síntesis de productos de glicosilación avanzada o AGEs. La AG es un inhibidor de la formación de AGEs que se emplea terapéuticamente para retardar la progresión de las complicaciones vasculares diabéticas. Es un derivado hidrazínico, que bloquea selectivamente los grupos carbonilo reactivos en las fases tempranas de la glicosilación, inhibiendo la formación posterior de AGEs y su correspondiente entrecruzamiento con proteínas plasmáticas solubles o con la matriz proteica colágena (28) (29).
Contrariamente a lo descripto para la formación de AGEs, para evidenciar la presencia de productos tempranos de glicosilación y aductos de Amadori deberían emplearse métodos capaces de detectar modificaciones estructurales que alteren, por ejemplo, el peso molecular, punto isoeléctrico o la velocidad de migración de la proteína, ya que tales compuestos no fluorescen. Las alteraciones del perfil electroforético, incluso a tiempos cortos de incubación con glucosa, demuestran la existencia de moléculas cuya estructura ha variado como consecuencia de la glicosilación, aún en presencia de AG. Estos resultados confirman la utilidad de la ECZ para discriminar estadios intermedios de glicosilación y revelan que, en las condiciones experimentales empleadas, la inhibición con AG fue incompleta.
En conclusión, el método de ECZ desarrollado permite detectar la formación de compuestos proteicos glicosilados y demostrar la inhibición parcial del proceso mediante el estudio de variaciones en el perfil electroforético de la proteína glicosilada, mostrando sensibilidad para discriminar estadios intermedios de glicosilación. Considerando que aproximadamente el 8% de la albúmina circulante en individuos normoglucémicos sufre glicosilación no enzimática y que hasta el 25% es glicosilada durante el estado de hiperglucemia, la ECZ podría constituir una herramienta de análisis complementaria a la fluorometría habitualmente utilizada para el estudio de AGEs, que aportaría información sobre la formación de productos tempranos de glicosilación de albúmina como paso previo a la síntesis irreversible de AGEs.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado con fondos aportados por la Fundación Alberto J. Roemmers. Los autores agradecen el asesoramiento estadístico de la Dra. Ana Silvia Haedo.

Correspondencia

DRA. GRACIELA GARBOSSA
Departamento de Química Biológica
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Int. Güiraldes 2160. Pabellón II. Piso 4. Ciudad Universitaria
C1428EHA CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES. Argentina
Tel.: 54 11 4576-3300 al 09 int 209. Fax: 4576-3342
E-mail: garbossa@qb.fcen.uba.ar

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Aceptado para su publicación el 14 de noviembre de 2006