HEMATOLOGÍA

Banco Público de Sangre de Cordón Umbilical: etapa inicial del Programa No Relacionado en Argentina

Argentina's Public Cord Blood Bank: Beginning of the Unrelated Program

Cecilia Gamba^1*, María Angélica Marcos^2*, Hugo Trevani^2**, Juan Van der Velde^2**, Cintia Yanina Marcos^4***, Graciela Theiler^3***, Jorge Rossi^4****, Marta Zelasko^2****, Leonardo Fainboim^2***, Ana Emilia del Pozo^2*

^1. Lic. en Ciencias Biológicas.
^2. Médico.
^3. Dra. de la Universidad de Buenos Aires.
^4. Bioquímico/a.

* Banco Público de Sangre de Cordón Umbilical - Servicio de Hemoterapia - Hospital de Pediatría Prof. Dr. JP Garrahan - Buenos Aires - Argentina.
** Hospital Materno Infantil Ramón Sardá.
*** Laboratorio de Inmunogenética - Hospital de Clínicas José de San Martín - Universidad de Buenos Aires.
**** Servicio de Inmunología - Hospital de Pediatría Prof. Dr. JP Garrahan.

Resumen

La sangre de cordón umbilical (SCU) ofrece una fuente rica de células progenitoras hematopoyéticas para trasplante de médula ósea (TMO). En el año 1996 comenzó en este Hospital un Programa Relacionado de Banco de SCU. Este Programa permite que familias con un niño que padece una enfermedad tratable con TMO almacene la SCU de un hermano por nacer para su futuro uso. Recientemente, el Programa No Relacionado ha sido aprobado y recibió apoyo financiero para adquirir nuevo equipamiento. Este Programa tiene como objetivo colectar y preservar unidades de SCU donadas de manera altruista, que quedan disponibles para su uso en TMO alogeneicos en pacientes que no poseen otro donante compatible. Desde agosto de 2005 a enero de 2006 se han inscripto 110 donantes y realizado 96 colectas. El procesamiento de 70 unidades mediante un sistema automatizado permitió recuperar un 76,4 ± 7,4% de las células nucleadas totales (CNT) iniciales. Las unidades presentaron 0,8 ± 0,3 x 109 CNT finales y un recuento de células CD34+ de 2,79 ± 2,57 x 106. El análisis molecular de los antígenos de histocompatibilidad mostró la presencia de alelos característicos de esta población (A68, B3519, DR08) junto con alelos menos frecuentes en la población de Argentina. El funcionamiento de este Banco nos permitirá aumentar la oferta internacional de unidades con perfil HLA latinoamericano-hispano, fenotipo escaso en los registros existentes en la actualidad.

Palabras clave: banco de sangre de cordón umbilical y placenta * células progenitoras hematopoyéticas * Programa No Relacionado

Summary

The umbilical cord blood (UCB) is a rich source of hematopoietic progenitor cells (HPC). The Unrelated Program has been recently established and it has received financial support by the Ministry of Health to acquire new equipment. This Program was aimed at collecting and preserving UCB from altruistic donors. The units are potentially used for allogeneic bone marrow transplantation in those patients who lack a suitable compatible donor. From August 2005 to January 2006 110 donors have been enrolled and 96 units collected. Units processed (n=70) yield a mean recovery of 76.4 ± 7.4% of the total nucleated cell (TNC) collected with a final count of 0.8 ± 0.3 x 109 TNC and 2.79 ± 2.57 x 106 CD34+ cells per unit. By HLA analysis, those variants common in the Argentine population (A68, B3519, DR08) along with the less frequently found alleles were detected. This Program will make it possible to increase the availability of units from Hispanic-Latin American background that are scarce in registries from other countries.

Keywords: cord blood bank * hematopoietic progenitor cells * Unrelated Program

INTRODUCCIÓN

La Sangre de Cordón Umbilical (SCU) constituye una fuente rica de células progenitoras hematopoyéticas (CPH) para trasplante de médula ósea (TMO). Actualmente, la colecta y preservación de SCU constituye un procedimiento habitual y bien establecido en diversos países.
El primer trasplante utilizando CPH de sangre de cordón umbilical fue realizado en Francia, en octubre de 1988 (1). El receptor, un niño de 6 años con anemia de Fanconi, recibió la sangre de cordón umbilical de su hermana. A más de 16 años de ese trasplante el joven se encuentra totalmente recuperado. Posteriormente, se sucedieron cantidades crecientes de TMO que usaron como fuente de CPH a la sangre de cordón umbilical. Hasta la fecha se estima que se han hecho más de 4.000 procedimientos de trasplante con sangre de cordón umbilical en todo el mundo para una gran variedad de enfermedades (2). Los resultados clínicos son alentadores y ya no existen dudas acerca de la capacidad de las células presentes en la sangre del cordón para regenerar a largo plazo la médula ósea, la cual puede ser utilizada para tratar numerosos desórdenes malignos y no malignos (3).
Existen dos modelos alternativos de Banco de SCU: el modelo relacionado permite que familias con un niño enfermo con una patología tratable con terapia celular almacene la SCU de un hermano para su posible uso futuro. Dentro de esta categoría se incluye frecuentemente el Banco para uso autólogo, en el cual las familias almacenan la SCU como un "seguro biológico" (tal como es promocionado). Sin embargo, el futuro uso autólogo resulta muy poco probable y este tipo de Banco presenta serios problemas éticos (4)(5). El modelo no relacionado, también llamado público, se dedica a la colecta y preservación de unidades donadas de manera altruista, que quedan disponibles para su uso en TMO alogeneicos en pacientes que no poseen otro donante compatible.
En 1996 comenzó a funcionar en el Hospital de Pediatría Prof. Dr. JP Garrahan, el Programa Relacionado del Banco de Sangre de Cordón Umbilical en el cual han sido inscriptas más de 120 familias de todo el país y que ha posibilitado el TMO de 5 pacientes con patologías diversas (6). Recientemente, el Programa No Relacionado ha sido aprobado y recibió apoyo financiero para adquirir nuevo equipamiento.
El objetivo de este trabajo es describir las actividades del Programa No Relacionado que comenzó sus actividades en 2005.

Fundamento y reseña histórica de los Bancos de Sangre de Cordón Umbilical
En un gran número de enfermedades metabólicas, hematológicas y oncológicas el trasplante de médula ósea es el único tratamiento curativo posible (7)(8). Las células progenitoras hematopoyéticas (CPH) se pueden obtener de donantes relacionados o no relacionados (trasplante alogeneico) o del mismo receptor en algunos casos particulares (trasplante autólogo). En la mayoría de los casos la mejor opción de donante la constituyen las CPH provenientes de un hermano histoidéntico del paciente. La compatibilidad de tejidos es importante para lograr un injerto exitoso y minimizar el desarrollo de la enfermedad Injerto versus Huésped, que es una patología potencialmente mortal. Desafortunadamente, la posibilidad de que dos hermanos resulten histoidénticos es de alrededor del 20-25% (9). Cuando no está disponible el donante de elección (hermano histoidéntico), la alternativa es buscar un donante adulto fuera de la familia (donante no relacionado). Si bien los trasplantes de médula ósea que utilizan donantes adultos voluntarios no relacionados se asocian con mayor morbimortalidad que cuando se usan CPH relacionadas, su pronóstico está mejorando, según aparece en comunicaciones recientes. Los mejores resultados se deben a la introducción de las técnicas moleculares modernas utilizadas para la tipificación HLA, con las que se logra determinar con mayor sensibilidad la histocompatibilidad y obtener así el donante más compatible con el receptor.
Existen centros que registran donantes voluntarios para trasplantes de médula ósea no relacionados. En estos registros, el tiempo que transcurre desde el inicio de la búsqueda de posibles donantes hasta el trasplante es de 6-14 meses (3). Por lo tanto, muchos pacientes que podrían beneficiarse con el trasplante, mueren en la espera. Uno de los serios problemas con que se encuentran los registros es que muchas veces un donante que estaba dispuesto a donar su médula ósea, deja de estarlo en el momento en que se lo necesita, bien por razones familiares, laborales, de salud, etc. El tiempo de espera puede ser aún mayor para minorías étnicas, como el caso de los pacientes latinoamericanos que inician búsquedas de donantes en los registros de EE.UU. y Europa. En el programa de donantes de EE.UU. sólo el 6% de los donantes registrados son de origen hispano/latino. De las búsquedas formales iniciadas para pacientes hispánicos resultaron en trasplante sólo 19,7%, comparado con 30,4% de la población caucásica (10).
Por lo expuesto anteriormente, resulta que el principal factor limitante para el trasplante alogénico es la disponibilidad de donantes compatibles (11). Es por ello de suma importancia que en los últimos años se haya abierto una nueva esperanza mediante la recolección de una fuente de CPH que normalmente es descartada: la sangre remanente en la placenta luego de separado de la misma el recién nacido en el momento del parto (12)(13). Esta fuente, conocida con el nombre de sangre de cordón umbilical, contiene un número importante de CPH, que pueden ser colectadas, criopreservadas y luego trasplantadas a pacientes que de otra manera no dispondrían de donante.
Al hacerse evidente el potencial de esta fuente alternativa de CPH, comenzaron a crearse bancos de sangre de cordón umbilical para suplementar la disponibilidad de donantes de células progenitoras hematopoyéticas en los registros internacionales. Se comenzó a criopreservar unidades de SCU para futuros trasplantes de pacientes compatibles no relacionados. El primer banco público se estableció en 1993 en el Centro de Sangre de Nueva York. Ese mismo año comenzaron a trabajar el Banco de Sangre de Cordón de Milán (Italia) y el Centro de Donantes de Médula Ósea de Dusseldorf (Alemania) (14). El Banco de Sangre de Cordón de Nueva York es el banco público más grande; de éste provinieron más de la mitad de las unidades utilizadas para trasplante en todo el mundo.
Las unidades colectadas se encuentran criopreservadas en los bancos y los registros de su tipo HLA están disponibles para todos los centros de trasplante de CPH. Los archivos electrónicos pueden ser revisados rápidamente y es posible hallar una unidad potencialmente trasplantable sin demoras. Sin embargo, las frecuencias de HLA de los Bancos de SCU existentes reflejan el mismo perfil poblacional que los Bancos de médula ósea no relacionados (15). Por ello, los Bancos de SCU han comenzado programas especiales para captar donantes de minorías étnicas. Estos programas no han sido tan exitosos como se esperaba, volviéndose evidente la ventaja de crear Bancos de SCU en países cuya variabilidad genética no se encuentra representada en los registros existentes en la actualidad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Promoción de la donación y obtención del consentimiento informado
Se provee educación a las potenciales madres-donantes de sangre de cordón umbilical de manera tal que puedan elegir mediante un consentimiento informado donar la sangre de cordón de su niño para el Programa No Relacionado del Banco Público de Sangre de Cordón Umbilical. La información se provee con antelación a la solicitud del consentimiento posibilitando que la donante reflexione y pueda consultar con familiares y allegados la decisión de donar la sangre de cordón umbilical del bebé por nacer. El proceso de obtención del Consentimiento Informado se realiza en embarazadas que hayan alcanzado la 22da semana de gestación y sólo puede obtenerse antes del comienzo del parto activo. La información es provista por personal autorizado. Para considerar a la madre inscripta en el Programa de Colecta de SCU debe estar firmado el Consentimiento Informado.

Evaluación de donantes
La obtención de información médica detallada de la madre constituye un método de pesquisa de las unidades para evaluar enfermedades hereditarias e infecciosas que pueden ser potencialmente transmitidas a los receptores de las unidades de sangre de cordón umbilical. La entrevista es realizada por personal autorizado, y se realiza luego de obtenido el consentimiento. Los registros son almacenados junto con los otros documentos de la unidad identificados con un código único. En el momento del parto se obtiene una muestra materna para analizar los marcadores de infecciones obligatorios para donantes de sangre de cordón umbilical y se almacenan alícuotas de plasma, suero y ADN para análisis posteriores.

Colecta y procesamiento de sangre de cordón umbilical
La sangre es colectada antes que se produzca el alumbramiento de la placenta, mediante la técnica de colecta in utero (16). Un operador entrenado realiza la desinfección del sitio de punción con una gasa estéril embebida en solución iodada. La sangre remanente en la placenta se obtiene por punción de la vena umbilical y se colecta en bolsas con CPD-A como anticoagulante. Las bolsas con sangre se transportan hasta el Laboratorio de Células Progenitoras Hematopoyéticas donde se mantienen a 20-25 °C hasta su procesamiento.
El procesamiento se realiza con un equipo automatizado (Sepax, BioSafe, Suiza) en un sistema cerrado descartable, compuesto por una cámara de centrifugación, una bolsa para el plasma remanente y una bolsa de criopreservación, a la cual se conecta la bolsa original de colecta. Toda manipulación de las unidades se realiza bajo campana de flujo laminar. Las unidades de sangre de cordón umbilical se reducen a un volumen estándar de 20 mL utilizando el equipo automatizado que permite la remoción de plasma y glóbulos rojos mediante el agregado de hidroxietil-almidón de alto peso molecular (20% vol/vol) hasta obtener el concentrado de células requerido (buffy coat). Luego de enfriar a 4 °C la unidad procesada se agrega, a la misma temperatura y en permanente agitación, una solución al 50% de dimetil sulfóxido (DMSO) en Dextran 40 para obtener una concentración final del criopreservante del 10%. Las unidades son selladas al vacío en una bolsa protectora y almacenadas en nitrógeno líquido mediante un descenso programado de temperatura realizado en el mismo equipo donde se almacenan (BioArchive, Thermogenesis, EE.UU.). Criterios de descarte de unidades: recuento de células nucleadas totales (CNT) previo procesamiento menor a 0,6 x 10⁹ CNT, recuento de CNT post procesamiento menor a 0,4 x 10⁹ CNT, recuperación post procesamiento de CNT menor a 70%, resultados repetidamente reactivos para los marcadores de infecciones obligatorios, exclusión materna debido a la presencia de factores de riesgo comportamentales o causas médicas.

Análisis de las unidades y muestras maternas
Cada unidad se encuentra caracterizada por el número total de células nucleadas (mediante un contador celular automatizado), células CD34+ (por citometría de flujo (17) y viabilidad (estudiadas en una alícuota del material previo a ser congelado). El plasma remanente de las unidades es estudiado para los mismos marcadores de infecciones que las muestras maternas. Además, se realizan cultivos microbiológicos (para detectar contaminación por organismos aerobios y anaerobios).

Caracterización molecular de los antígenos de histocompatibilidad
A partir de una alícuota obtenida luego del procesamiento de la unidad, se extrajo DNA genómico utilizando la técnica clásica de fenol-cloroformo. Se tipificaron hasta el momento 56 unidades por la técnica de PCR-SSOP (amplificación enzimática e hibridización con oligonucleótidos sintéticos -sondas- marcados con digoxigenina) con una estrategia de baja-media resolución para HLA-A, -B y DR. Para HLA-A se utilizó una PCR locus específica (18) y un equipo de 40 sondas, para HLA-DR se amplificaron todos los genes DRB y se usó un equipo de 20 sondas específicas para DRB1 (19)(20). Para definir DR 15 y/o DR 16 en las muestras DR 02 positivas se usó una PCR con primers específicos (técnica de SSP) (21). En el caso de locus B, para disminuir el número de ambigüedades posibles, se realizó un procedimiento en dos etapas. En la primera se utilizó una PCR locus específica y se hibridizó el producto de la misma con 11 sondas para clasificar a cada muestra en 5 grupos posibles. Como segunda etapa se realizó PCR grupo específica. Cada grupo se hibridizó con un conjunto de sondas que varía entre 16 y 32, según el grupo considerado. La estrategia de HLA-clase I (A y B) que se utilizó es una modificación de la estrategia de alta resolución publicada anteriormente por el grupo de M. Fernández-Viña y cols. (22-24).
Para los tres loci (HLA-A, B y DR) en cada hibridización se utilizaron controles positivos y negativos para cada sonda.
El laboratorio participa desde hace más de tres años del Programa de Control de Calidad Internacional de la Universidad de los Ángeles, California, controlando así las estrategias de tipificación para los distintos loci y el comportamiento de las sondas para alelos presentes en distintas poblaciones estudiadas.

Análisis estadístico
Los resultados se expresan como mediana y rango o media ± desvío estándar (DE).

RESULTADOS

Los tres primeros meses (mayo a julio de 2005) se procedió a la instalación y validación del nuevo equipamiento adquirido, validación de los Procedimientos Operativos Estándares (POE) desarrollados y capacitación del personal que permitieron la habilitación del Banco de Sangre de Cordón Umbilical por el Instituto Nacional Central Único Coordinador de Ablación e Implante (INCUCAI). Desde agosto de 2005 a enero de 2006 se han inscripto 110 donantes y realizado 96 colectas (Tabla I), 16 colectas fueron canceladas por diversas causas. No se han procesado 26 unidades (28% de las colectas realizadas) debido a bajo volumen o baja celularidad inicial (n=24, 92%), presencia de coágulos en la bolsa de colecta (n=1) y transcurso de más de 36 h al llegar al laboratorio de procesamiento (n=1). La inclusión en el Programa de maternidades públicas permitió acceder a donantes de pueblos originarios de sudamérica, un grupo étnico escasamente representado en los registros de donantes de CPH (Tabla I).
Las unidades fueron procesadas por dos operadores entrenados. La Tabla II resume los resultados obtenidos mediante el uso de equipos automatizados. El 50% de las unidades almacenadas en el Banco son aptas para receptores de hasta 56 kg (a una dosis de 2,5 x 10⁷ células por kg de receptor).
Si bien el estudio molecular de los antígenos de histocompatibilidad no permite calcular frecuencias (debido al bajo número de muestras analizadas) en la población de donantes se encontraron representados, en orden decreciente, para el locus A: A02, A24, A03, A68, A01; para el locus B: B35, B44, B07, B51, B14; para el locus DR: DR04, DR08/1415; DR11, DR15, DR07, DR01, DR13.

Tabla I. Información general de las primeras colectas realizadas.

Tabla II. Estadística descriptiva de las unidades procesadas en el Laboratorio de CPH del Banco de Sangre de Cordón Umbilical.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Lograr unidades de células progenitoras hematopoyéticas de sangre de cordón umbilical de óptima calidad para la realización de TMO no relacionado requiere desarrollar una serie de actividades necesarias para la acreditación del Banco ante organismos internacionales. Es por ello que la implementación del programa de gestión de calidad que adhiere a los estándares nacionales e internacionales actualmente vigentes para Bancos de SCU (25-27) fue un requisito indispensable desde el inicio de este Programa.
La posibilidad de iniciar un Programa No Relacionado de colecta de sangre de cordón umbilical en este país presenta numerosas ventajas. El principal objetivo es aumentar la oferta internacional de unidades con perfil HLA latinoamericano-hispano, fenotipo escaso en los registros existentes en la actualidad. Al colectar unidades en el país se puede brindar una mayor posibilidad de hallar una unidad compatible para los pacientes argentinos y del resto de Latinoamérica y reducir los gastos actualmente necesarios para envío de muestras al exterior para estudios confirmatorios y para el transporte de la unidad hacia Argentina. Un programa como éste permite, además, el desarrollo científico local y acrecentar la experiencia en la obtención y criopreservación de células progenitoras con potencial terapéutico.
El análisis de las primeras unidades aquí presentado permite evaluar el funcionamiento del Programa recientemente iniciado y delinear futuras acciones para su mejora. La sangre de cordón umbilical puede ser colectada in utero (antes del alumbramiento de la placenta) o ex utero. Este banco ha elegido la primera debido a que puede ser realizada por obstetras u obstétricas en el momento del parto. Si bien las colectas ex utero son menos invasivas y se obtiene un mayor control de la técnica de colecta, resulta más costoso debido a que debe utilizarse personal adicional para el procedimiento. No ha habido comunicaciones en la literatura acerca de efectos adversos serios por la realización de una u otra técnica de colecta. Además, se ha demostrado que con ambas técnicas se obtienen cantidades comparables de células nucleadas y CD34+ (28). A la vez, el entrenamiento de obstetras y obstétricas permite ampliar el Programa de colecta de sangre de cordón umbilical e incluir más maternidades que pueden proveer mayor variabilidad genética de las unidades almacenadas.
Las causas de descarte de unidades son similares a las comunicadas en la literatura, pero el porcentaje de unidades colectadas no procesadas en este banco es menor (29). Si bien el número de colectas analizadas es muy bajo, el análisis de las variables muestra resultados concordantes con los reportados para estos procedimientos en la literatura (30). Durante la etapa de capacitación en colecta de SCU se encontró una unidad contaminada con Propionobacterium sp. (bacilo de la flora habitual de la piel). Sin embargo, debido a la rigurosa técnica de desinfección realizada antes de efectuar la punción de la vena del cordón umbilical, en la que ha sido entrenado el personal, todos los cultivos de las unidades colectadas y actualmente almacenadas en el banco son negativos. Es de esperar que la tasa de contaminación se mantenga baja siempre que se respeten los procedimientos y el personal adquiera mayor experiencia en los mismos (31).
El análisis molecular de los antígenos de histocompatibilidad mostró la presencia de alelos característicos de esta población (A68, B3519, DR08) de baja representación en poblaciones caucásicas (mayormente representadas en los registros de donantes internacionales) junto con alelos menos frecuentes en la población de Argentina (por ejemplo, A80). Debido a que se utilizaron técnicas de baja resolución para la determinación del locus DR, un 16% de las muestras requiere el estudio del haplotipo materno para la resolución de ambigüedades.
Entre las futuras acciones a desarrollar para mejorar el Programa no relacionado de colecta de sangre de cordón umbilical cabe mencionar: aumentar la cantidad de donantes de fenotipos HLA escasamente representados en los registros, reducir el tiempo transcurrido desde la colecta hasta el almacenamiento, capacitar al personal para obtener mayor volumen inicial y con ello reducir el porcentaje de unidades colectadas que no se procesan y aumentar la recuperación de células nucleadas totales mediante la variación de parámetros del procesamiento automatizado.
Este primer análisis muestra que ha sido posible organizar en Argentina un programa no relacionado de colecta de sangre de cordón umbilical. Se espera que éste sea capaz de proveer unidades de calidad óptima para el trasplante de médula ósea de pacientes que en la actualidad no poseen donantes histocompatibles.

Correspondencia

DRA. ANA DEL POZO
Banco Público Nacional de Sangre de Cordón Umbilical
Servicio de Hemoterapia
Hospital de Pediatría Prof. Dr. Juan P. Garrahan
Combate de los Pozos 1881
1245 CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES, Argentina
E-mail: bscu@garrahan.gov.ar

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Aceptado para su publicación el 19 de diciembre de 2006