SECCIÓN PERMANENTE LATINOAMERICANA

Niveles de luz ultravioleta ambiental asociados con apoptosis y necrosis en fibroblastos humanos

Jaime L. Matta¹, Juan M. Ramos¹, Roy A. Armstrong², Hector D'Antoni³

^1. Departament of Pharmacology and Toxicology, Ponce School of Medicine, Ponce, Puerto Rico.
^2. Departament of Marine Sciences, University of. Puerto Rico, Mayagüez, Puerto Rico.
^3. National Aeronautics and Space Administration, Ames Research Center, Moffett Field, CA

Resumen

La apoptosis involucra una serie de episodios altamente organizados y programados que tienen por objeto mantener la estabilidad genómica eliminando células huésped defectuosas. El propósito de este estudio fue determinar las dosis umbral y los tiempos de exposición a UV-A y UV-B medioambientales suficientes como para producir apoptosis y necrosis en las células normales de una línea celular de fibroblastos humanos. Se midieron dosis de UV-A y UV-B durante un período de seis años con un radiómetro UV de cuatro canales. Se irradiaron los fibroblastos una vez utilizando Simulador Solar UV Oriel con seis dosis de UV basados en el medio ambiente. Las dosis correspondieron a 0, 11, 19, 23 y 45 minutos de radiación ambiental de UV-A y UV-B al sol del mediodía en Puerto Rico. Se utilizó el método de unión de la anexina-V para diferenciar entre los fibroblastos normales y fibroblastos apoptóticos o necróticos. La dosis umbral de la apoptosis a la necrosis se halló entre 24-28 kJ/m², correspondiente a los 19 y 23 minutos de exposición ambiental a UV-A y UV-B. Este estudio proporciona los primeros datos que especifican las dosis de umbral medioambientales de UV-A y UV-B en las que los fibroblastos humanos experimentan apoptosis y necrosis. Estos resultados pueden proporcionar valiosos umbrales dosis-respuesta de apoptosis y necrosis para futuros estudios mecanicistas y datos de línea de base para programas de prevención de cáncer de piel.

INTRODUCCIÓN

La exposición excesiva a la radiación de UV-A (320-400 nm) y UV-B (280-320 nm) es un factor de riesgo importante en el desarrollo de cáncer de piel (1). La radiación de UV-A produce un incremento en la producción de ROS y en las especies de estrés oxidativo, y finalmente ocasiona daños en el ADN, los lípidos y las proteínas (2)(3). A pesar de que los UV-B son sustancialmente menos abundantes en la naturaleza, tienen muchísimo más potencial carcinógeno. Estas longitudes de onda de energía más alta promueven la incorporación de dímeros pirimidina ciclobutano y fotoproductos 6-4 directamente dentro del ADN (4)(5). La acumulación persistente del daño al ADN da lugar a carcinogenia. En la carcinogenia existe un aumento de la proliferación celular y una reducción de la muerte celular, siendo ambas secundarias a la reducción de la apoptosis (6)(7).
La apoptosis es un camino de muerte celular altamente conservado que mantiene la estabilidad genómica por medio de la eliminación de células defectuosas en una serie de eventos programados y efectivos (8). La principal proteína asociada con la apoptosis es la p53 (8). La proteína p53 funcional les permite a los fibroblastos reparar los daños que sufre el ADN inducido por UV y protege a las células contra la apoptosis (9)(10). El daño persistente al ADN inducido por UV en los fibroblastos da lugar a la apoptosis (11)(12). Las mutaciones de p53 en los queratinocitos y que son inducidas por UV pueden disminuir la apoptosis, aumentar la proliferación celular y promover el desarrollo temprano del cáncer de piel (13-15). Los queratinocitos y los fibroblastos con mutaciones en p53 se vuelven resistentes a la apoptosis (16-18). Esto se encuentra asociado al desarrollo de carcinogenia (8)(16). Luego del daño inicial por radiación con UV, la mayoría de las células vecinas a las células resistentes a la apoptosis mueren por apoptosis o necrosis, dándole la oportunidad a las células mutadas a expandirse clonalmente (8)(16)(19).
La necrosis hace referencia a la muerte celular no programada en presencia de daño exógeno, que ocasiona la digestión enzimática de la célula y la degradación de las proteínas (20). La necrosis celular normalmente se produce por un serio daño celular como el de la radiación UV, entre otros (20). Las células inmunes son atraídas al área y comienzan a producir citoquinas que generan una respuesta inflamatoria (21)(22). La necrosis a menudo trae aparejados cambios irreversibles dentro de los núcleos, pérdida de la estructura citoplasmática, pérdida de la integridad de la membrana plasmática, disfunción en varios orgánulos (particularmente en la mitocondria) y finalmente citólisis como resultado de hinchazón de alta-amplitud (23). La necrosis origina el derrame de contenidos citosólicos y organulares dentro del entorno circundante (21). Luego de un gran daño por UV la cantidad de ADN presente en las células interrumpe la apoptosis y da lugar a la necrosis. Las células que sobreviven al daño necrótico son usualmente resistentes a la apoptosis y pueden originar la expansión clonal de las células mutadas. La progresión de las células hacia caminos apoptóticos o necróticos depende de la cantidad de daño al que estén expuestas (21).
El objetivo de este estudio fue probar la hipótesis de que la dosis de UV regula la progresión de los fibroblastos normales hacia apoptosis o necrosis. Nuestros experimentos apoyan el punto de vista de que, a medida que se incrementan los UV-A y UV-B medioambientales, los fibroblastos sufren apoptosis seguida posteriormente por necrosis. Este estudio presenta los primeros datos que especifican las dosis umbral de UV-A y UV-B medioambientales y los tiempos de exposición en los que los fibroblastos humanos experimentan apoptosis y necrosis. Estos resultados pueden proporcionar valiosos umbrales dosis-respuesta para la apoptosis y la necrosis para estudios mecanicistas posteriores.

MATERIALES Y MÉTODOS

Dosis de UV-A y UV-B medioambientales
Se recogieron datos de UV-A y UV-B medioambientales de manera continua durante un período de 6,5 años en La Parguera, Puerto Rico (17º58'23"N, 67º02'42"O), por medio de un radiómetro GUV-511 en tierra (Biospherical Instruments Inc. San Diego CA). Al simulador solar se lo calibró radiométricamente utilizando un espectroradiómetro Optronic OL-754 (Orlando, FL) de modo tal que pudiera reproducir la dosis de irradiación de UV-A y UV-B determinada por los niveles ambientales medidos por el radiómetro GUV-511 en tierra. Aquel instrumento mide UV-A y UV-B en cuatro canales centrados a longitudes de onda (305, 320, 340 y 380 nm) y está ubicado en la estación permanente de monitoreo de UV en el Departamento de Ciencias Marinas, Universidad de Puerto Rico, la Parguera. El radiómetro registra los datos de UV a intervalos de 5 minutos desde el amanecer hasta el atardecer. Se utilizaron las ecuaciones de Orce y Helbling (24) para la reconstrucción espectral de los datos de GUV-511 de cuatro bandas en irradiación diaria en el rango de UV (280-400 nm). Se realizaron mediciones simultáneas de radiación de UV utilizando un radiómetro Solar Light Model PMA 2100 al lado del GUV-511 durante 3 días en julio de 2003. El radiómetro de banda ancha mide las radiaciones totales (280 a 400 nm) de UV y calcula la dosis. Se utilizó el radiómetro Solar Light para validar los resultados de la dosis de UV que se obtuvieron de los cálculos realizados con el GUV-511.
Los datos ambientales de UV se integraron en tiempo para producir dosis diarias de UV-A y UV-B en kJ/m²/día. El total de UV promedio diario durante los seis años fue de 1198 kJ/m²/día, de los cuales el 92% fue UV-A (1106 kJ/m²/día) y un 8% fue de UV-B (92 kJ/m²/día) (22). Al sol de medio día en enero (valor anual más bajo), se midieron 76 kJ/m², correspondientes a 32 minutos de exposición ambiental. Esto se basa en una medición de 142 kJ/m² por hora. A pesar de que hay diferencias en la susceptibilidad al cáncer a través del espectro de UV, la mejor manera de abordaje fue integrar los datos de UV recolectados debido a que las personas están expuestas a todo el espectro de UV. Además, es importante desde el punto de vista fisiopatológico integrar los datos de UV debido a la foto-interacción que existe entre el UV-A y el UV-B (25-27).

Simulación de radiación UV-A y UV-B.
Se utilizó un simulador Solar Oriel UV 1 kW (Stratford, CT) para generar UV-A y UV-B para todos los experimentos. Björn y Teramura han publicado una descripción detallada de esta unidad con espectros que utilizan distintos filtros de corrección de los mismos (28). El simulador solar consiste en una lámpara de xenón de 1.000 W refrigerada por aire que se coloca en un foco de un espejo elipsoidal. La radiación se enfoca sobre el mezclador de luz en el segundo foco desplazado por un espejo plano. Al haz de luz lo colima una lente transparente ultravioleta luego de la deflexión por otro espejo plano (28). El espectro de UV (280-400 nm) del simulador solar recogido con la lámpara a 500 watts se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Espectro UV-A y UV-B (280-400nm) producido por el Simulador Solar Oriel.

Cultivo celular
La línea celular humana de fibroblastos CRL-2072 (ATCC, Manassas, VA) se transfirió desde los matraces (75 cm²) a platos. Se evaluaron distintos tipos de platos para determinar las óptimas condiciones de crecimiento. Se seleccionó un disco de Petri de 150 X 15 mm BD Falcon #351058 (Biosciences, Discovery Labware, Franklin Lakes, NJ). El sistema de incubadora del intercambio de CO2 es más eficiente cuando se utiliza un matraz en lugar de un plato. Por consiguiente, las células fibroblásticas tardaron de 5 a 7 días en formar una monocapa de 1.5 X 106 células por 150 mm. Los fibroblastos se cultivaron siguiendo el protocolo establecido por ATCC con los siguientes componentes y sus volúmenes utilizados por 1 litro de solución: MEM (870 mL), 100 mM piruvato de sodio (10 mL), 200 mM L-glutamina (10 mL), suero fetal bovino(100 mL) y solución antimicótica/antibiótica (10 mL, 100X, 10,000U penicilina, 10 µg streptomicina, 25 µg anfoteticina B) Luego de la formación de la monocapa, las células se irradiaron tal como se describe más abajo.

Irradiación de células con UV
Luego de la recolección, los fibroblastos seleccionados se irradiaron con dosis de UV-A y UV-B basadas en el ambiente (estimadas a partir de mediciones en la estación de monitoreo de UV en La Parguera, Puerto Rico). Para aproximar de la mejor manera los efectos de una exposición medioambiental, se utilizó una combinación de UV-A y UV-B. Los fibroblastos se expusieron a dosis de UV-A y UV-B emitidas por un Simulador Solar de UV Oriel a 500 W y equipado con filtros que eliminaron longitudes de onda de UV-C visibles e infrarrojas. Se seleccionaron seis tiempos de exposición diferentes (0, 3, 5, 6 y 12 minutos) en el simulador solar para irradiar los fibroblastos; los tiempos fueron los equivalentes a 0, 11.4, 18.6, 22.8 y 45 minutos de exposición medioambiental. Estos tiempos de exposición correspondían a una dosis combinada de UV-A y UV-B de 0, 14, 23, 28 y 55 kJ/m² .El simulador solar se diseñó para que emita radiación tanto UV-A como UV-B. Se utilizaron filtros para eliminar la radiación UV-C y la radiación infrarroja visible. El uso de este último filtro da lugar a una reducción en la radiación luego de 370 nm en la cantidad de UV-A emitidos por este instrumento, tal como se muestra en la figura 1 en relación a los niveles medioambientales (datos no mostrados).

Unión de anexina-V
Se utilizó el equipo de detección de apoptosis (TACS Anexina V-Biotina, #TA4619) fabricado por R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN). Una hora después de que se irradiaran los fibroblastos (de acuerdo con las dosis previamente determinadas) se los examinó para apopotosis. El equipo R&D utiliza una anexina V conjugada a la biotina para la detección in situ de cambios en la superficie celular que se presentan de manera temprana en el proceso apoptótico. La pérdida de asimetría en los fosfolípidos de la membrana se produce en la membrana de aquellas células que sufren apoptosis dando lugar a la externalización de fosfatidilserina (PS) en la superficie celular (29). La Anexina V es una proteína anticoagulante que preferentemente se une a la PS cargada negativamente en la superficie de las células, posibilitando la detección de esta externalización en las células apoptóticas (30). El conjugado de anexina V-biotina tiene un fluoróforo por lo que se hace posible el uso de microscopía de fluorescencia en el proceso de detección. La combinación de anexina V y yoduro de propidio conjugados hace posible que se diferencie entre las células apoptóticas tempranas (anexina V positiva, verde claro), células apoptóticas tardías/ células necróticas tempranas (anexina-V y yoduro de propidio positivos, verde claro y rojo), células necróticas (positivas a yoduro de propidio, rojas) y células normales (tinción base, naranja). Esto se debe a la capacidad de la anexina V de unirse a la PS de un modo dependiente del calcio. Esta propiedad de la anexina V la ha transformado en una herramienta muy útil para la detección de la apoptosis en las etapas tempranas del proceso, particularmente en conjunción con el yoduro de propidio (22)(30).
Se utilizó un microscopio de fluorescencia (Olympus, modelo BX 40, Tokio, Japón) con una cámara digital (Polaroid, modelo DMC1, Cambridge, MA) para cuantificar los fibroblastos apoptóticos o necróticos. Se siguió el protocolo para la detección in situ para células adherentes suministrado por el fabricante (R&D Systems).

RESULTADOS

Los fibroblastos control sin tinción y no-irradiados se muestran en la Figura 2. En las células control no hubo reducción en el número celular, ni hinchazón o reducción citoplasmática ni cambios en la fragmentación de los núcleos (cariorexis). El método de detección de unión de anexina-V que utiliza el equipo de detección de apoptosis TACS Anexina V-Biotin pudo diferenciar entre fibroblastos normales y aquellos que mostraban apoptosis y necrosis. Con este método, las células del fibroblasto control no-irradiadas se tiñeron de naranja y exhibieron un mínimo color verde claro (Figura 3). Esto se interpretó como el nivel basal de apoptosis en ausencia de exposición a UV-A y UV-B. Los espacios oscuros denotan la presencia de células no teñidas. El color naranja es ocasionado por la unión de yoduro de propidio al ADN nuclear en células. En las células necróticas (que no se muestran), esta tinción se encuentra coloreada de rojo.
En los fibroblastos irradiados con 14 kJ/m² de UV-A y UV-B, equivalente a 11,4 minutos de exposición al medio ambiente, hubo un incremento en la tinción naranja de los fibroblastos, como también pruebas de actividad apoptótica temprana, tal cual lo indica el color verde claro que se muestra en la porción inferior e izquierda de la Figura 4. También hay alguna reducción celular en los fibroblastos teñidos.
Cuando se los irradió con 23 kJ/m² de UV-A y UV-B equivalentes a 18,6 minutos de UV medioambientales, hubo un incremento en la tinción naranja de los fibroblastos normales en comparación con la dosis de irradiación previa (Figura 5). Se muestra un fibroblasto apoptótico temprano en el medio de la imagen con su membrana parcialmente interrumpida, como lo demuestran las regiones en verde claro, positivas para anexina V y el núcleo teñido naranja/rojo con una forma irregular. Hay reducción celular ocasionada por la pérdida de agua celular. El fibroblasto en la porción derecha ha perdido su membrana y el núcleo está teñido de rojo por el yoduro de propidio. La Figura 6 muestra fibroblastos irradiados con 28 kJ/m², equivalentes a 22,8 minutos de UV-A y UV-B medioambientales. La membrana teñida se encuentra seriamente interrumpida como lo demuestra la ausencia virtual de color verde claro; pero su morfología es todavía evidente, y hay mínima apoptosis. La necrosis se encuentra presente en varias células tal como lo demuestra la hinchazón de los núcleos teñidos de rojo. La dosis de UV representa el comienzo del umbral entre la apoptosis y la necrosis.
La Figura 7 muestra fibroblastos irradiados con 55 kJ/ m² de UV-A y UV-B, equivalentes a 45 minutos de UV medioambiental. Todos los fibroblastos teñidos están coloreados de rojo y muestran hinchazón sustancial en sus núcleos. La membrana se encuentra completamente interrumpida y no es detectable por la tinción de la anexina V. Los fibroblastos teñidos muestran una necrosis completa, y los núcleos mostrados pueden ser de las células destruidas, tal como lo sugiere la importante hinchazón (Fig. 7).

Figura 2. Fibroblastos no teñidos y no-irradiados (100X). Hay un elevado número de células y hay ausencia de hinchazón citoplasmática o reducción. Los núcleos están mostrados por las pequeñas regiones negras.

Figura 3. Fibroblastos no-irradiados (control). Las células tenían tinción de color naranja y exhibían un mínimo color verde claro (100X). Esto representa el nivel basal de apoptosis sin exposición a UV. Los espacios oscuros denotan la presencia de células no teñidas. El color naranja está ocasionado por la unión de yoduro de propidio al ADN nuclear en las células.

Figura 4. Fibroblastos (100X) irradiados con 14 kJ/m2 de UV-A y UV-B, equivalentes a 11,4 minutos de exposición medio-ambiental a la luz del sol del medio día en Puerto Rico. Si se lo compara con los fibroblastos control, hay incremento de la tinción naranja de los fibroblastos así como evidencia de actividad apoptótica temprana, tal como lo indica el color verde claro que se muestra en la porción inferior izquierda. Hay alguna reducción celular que es evidente en los fibroblastos teñidos.

Figura 5. Fibroblastos (100X) irradiados con 23 kJ/m2 de UV-A y UV-B, equivalentes a fibroblastos normales si se los compara con la dosis de irradiación previa. En el medio de la imagen se muestra un fibroblasto temprano apoptótico, con su membrana parcialmente interrumpida, tal como lo demuestran las regiones en verde claro positivas para anexina V. Hay un achicamiento celular debida a la pérdida de agua celular. También es evidente una menor adhesión celular en las células expuestas a 23 kJ/m2 de UV-A y UV-B. El fibroblasto en la porción derecha ha perdido su membrana y el núcleo está teñido de rejo por el yoduro de propidio.

Figura 6. Los fibroblastos (100X) irradiados con 28 kJ/m2, equivalente a 22,8 minutos de UV-A y UV-B medioambientales. La membrana teñida está interrumpida de manera importante tal como lo demuestra la ausencia virtual de color verde claro, pero es todavía aparente desde el punto de vista morfológico y hay mínima apoptosis. La necrosis se encuentra presente en varias células tal como lo demuestra la hinchazón de los núcleos teñidos de rojo. La dosis de UV representa el comienzo del umbral entre la apoptosis y la necrosis.

Figura 7. Fibroblastos irradiados con 55 kJ/m2 UV-A y UV-B, equivalentes a 45 minutos de UV medioambiental. Todos los fibroblastos teñidos de rojo están completamente necróticos y muestran una importante hinchazón de sus núcleos. Sus membranas están completamente interrumpidas y no son detectables por la tinción por anexina V. Los fibroblastos teñidos muestran una completa necrosis y los núcleos que se muestran pueden ser de células con lisis tal como lo sugiere la importante hinchazón.

DISCUSIÓN

Según sabemos, este estudio proporciona los primeros datos para especificar un umbral de dosis combinadas de UV-A y UV-B entre la apoptosis y la necrosis, así como los tiempos de exposición al medio ambiente que se requieren para producir estos efectos en los fibroblastos humanos. También proporciona una estimación de los umbrales entre la apoptosis temprana y la tardía en términos de dosis de UV-A y UV-B. Las células apoptóticas exhiben ampollas en la membrana, condensación de cromatinas y reducción nuclear, constricción citoplasmática y pérdida de volumen celular, y formación de cuerpos apoptóticos (22). Las células necróticas sufren hinchazón nuclear, floculación de la cromatina, ampollamiento de la membrana celular e interrupción y finalmente lisis (22). En combinación con el yoduro de propidio, la tinción con anexina V puede discriminar de manera confiable la apoptosis de la necrosis (22).
La exposición a la radiación con UV es un factor de riesgo importante para el desarrollo de cáncer de piel (1). Muchos estudios utilizan modelos de animales y de tejidos a los que se irradia con distintas dosis de UV (19)(25)(31-34). De rutina se realizan muchos estudios importantes sobre la etiología del cáncer, la carcinogenia, reparación y daño de ADN, y apoptosis entre otros, para los cuales se utiliza radiación con UV (25-27)(31-35). Estudios previos de apoptosis han expuesto a los fibroblastos y al tejido de la piel a una amplia gama de dosis de radiación UV-A y/o UV-B. El fundamento en base al cual se selecciona una dosis de UV-A y UV-B en particular a menudo no es tan claro y generalmente se basa en estudios previos y no en otros (25)(31-34) basados en el medio ambiente. Esto se debe en parte al costo elevado, al equipamiento especializado y al tiempo y esfuerzo que se requieren para adquirir datos de UV-A y UV-B en un lugar en particular. En estudios previos, las dosis de UV-A y/o UV-B oscilaban entre 300 J/ m² y 1.000 kJ/m² (19)(25)(31-34). En la literatura actual, no hay consistencia entre las dosis de UV seleccionadas para los distintos tipos de estudios. Las clasificaciones de las dosis de UV en alta o baja sin tener ningún dato del medio ambiente probablemente no sea fisiológicamente relevante. Una dosis alta de UV en un estudio (32) puede ser considerada baja en otra (31). A pesar de que estos estudios tienen hallazgos muy valiosos, realizar una comparación entre ellos puede no resultar preciso debido a las diferencias en las dosis de UV. Es importante que los investigadores aporten los fundamentos por los cuales seleccionan una dosis dada de UV e informen cómo esto se relaciona con los niveles de UV del medio ambiente.
La evaluación de los efectos de UV-A y UV-B en la piel humana y animal es menos ambigua que en las células debido a puntos finales bien definidos que se han estudiado de manera extensiva (36-43). El eritema es una respuesta inflamatoria de la epidermis y la dermis que produce dilatación aguda de los vasos sanguíneos e hinchazón de la piel y que de manera crónica produce hiperplasia y reordenamiento de la arquitectura de la piel (44). Los cambios inducidos por UV en las células de la piel se producen antes de que aparezcan cambios visibles de eritema (44). Muchos científicos han utilizado el concepto de dosis de eritema estándar (SED) tal como lo describe la Comisión International d' Eclairage (CIE), el SED tiene un valor de 100 J/m². La dosis de eritema mínima (MED) es la cantidad de SED requerida para que las personas con piel clara logren eritema, que es equivalente a 2 SED. Es bien establecido que los tipos de piel I y II (con menos melanina) tienen más propensión a quemarse y pelarse luego de una exposición a UV (45). De manera alternativa, las personas con tipos de piel III y IV tienden a broncearse más fácilmente. Los resultados del presente estudio claramente ponen de relieve la sensibilidad de los fibroblastos humanos a dosis variables de niveles ambientales de UV-A y UV-B. Dan pruebas morfológicas y bioquímicas de los beneficios de limitar la exposición a UV, una medida clave que se encuentra promovida por hallazgos anunciados en forma conjunta por el Task Force on Community Preventive Services y el US Preventive Services Task Force y la International Agency for Research on Cancer (IARC) Working Group on the Evaluation of Cancer Preventive Agents (41-47).
Este estudio proporciona datos valiosos de dosis de UV-A y UV-B para futuros estudios de apoptosis. Se halló un efecto de respuesta a la dosis entre la exposición combinada a la radiación de UV-A y UV-B y la respuesta de los fibroblastos a este factor medioambiental. Hubo una transición visible en los fibroblastos normales tanto a la apoptosis como a la necrosis dependiendo de la intensidad de la dosis de UV. Se proporciona un umbral de dosis de UV entre la apoptosis temprana y la tardía y la necrosis. Las dosis de UV que se utilizaron en este estudio pueden ser de valor para diseñar futuros estudios mecanicistas de apoptosis inducida por UV en fibroblastos humanos basados en los niveles ambientales de UV-A y UV-B.

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