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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. v.41 n.2 La Plata abr./jun. 2007

 

INMUNOHEMATOLOGÍA

Ascaris lumbricoides: Capacidad inhibitoria relacionada al antígeno P1

Ascaris lumbricoides: Inhibitory capacity in relation to P1 antigen

Patricia Ponce de León1*, Patricia Foresto2**, Juana Valverde2**

1. Bioquímica.
2. Dra. Ciencias Bioquímicas.

* Laboratorio de Parasitología. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario.
** Laboratorio de Inmunohematología, Hemorreología e Inmunogenética. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario. Argentina.

Resumen

El Sistema de Grupo Sanguíneo P tiene un único antígeno: P1 que fue identificado en varias especies parásitas. El objetivo de este trabajo fue determinar la capacidad inhibitoria de A. lumbricoides en relación al antígeno P1. Se trabajó con 11 extractos parasitarios (EA). Para evaluar la capacidad inhibitoria de los extractos en relación a los epitopes P1, se realizó la técnica semicuantitativa de inhibición de la aglutinación. Se prepararon dos series de diluciones de anticuerpo monoclonal anti- P1; a la primera se le agregó PBS a todos los tubos y a la otra, igual volumen de EA. El sistema revelador fue una suspensión de eritrocitos P1. Se determinó el título del anticuerpo monoclonal en ambas series. Se consideró significativa la aglutinación cuando hubo una diferencia de 2 o más diluciones entre ambos títulos. De los 11 EA estudiados, 8 presentaron epitopes P1. A estos 8 extractos se les calculó el Poder Inhibitorio y se lo relacionó con su contenido proteico a los fines de poder comparar la capacidad inhibitoria entre los extractos. La técnica aplicada permitió evidenciar la presencia de epitopes del Sistema P en extractos de A. lumbricoides y comparar la capacidad inhibitoria de los extractos en relación a epitopes P1.

Palabras clave: Ascaris lumbricoides; Capacidad inhibitoria; Antígeno P1

Summary

P Blood Group has a unique antigen: P1. It was identified in various parasite species. The aim of this work was to determine A. lumbricoides´s Inhibitory Capacity in relation to P1 antigen. The work was based on 11 parasite extracts (AE). The semiquantitative inhibition agglutination technique was used to assess the extracts´ Inhibitory Capacity in relation to P1 antigen. Two series of anti- P1 monoclonal antibody dilutions were prepared. PBS was added to the first series and an equal volume of AE to the second. Suspensions of P1 red cells were used as a revealing system. Monoclonal antibody titres were determined in both series. The agglutination was considered significative when there was a difference of two or more dilutions between the titres. Eight of the 11 extracts studied presented P1 epithopes. Inhibitory power of these 8 extracts was calculated and it was related with their protein concentrations to compare the Inhibitory Capacity among the extracts. The technique used made it possible to prove P System epithopes presence and to compare the extracts´ Inhibitory Capacity in relation to P1 epithopes.

Keywords: Ascaris lumbricoides; Inhibitory capacity; P1 antigen

INTRODUCCIÓN

El Sistema P, de acuerdo a la última nomenclatura de los Sistemas de Grupo Sanguíneo de la ISBT (International Society of Blood Transfusion), tiene un único antígeno: P1. Hay dos fenotipos: el fenotipo P1, presente en el 80% de los individuos de raza blanca, y el fenotipo P2 caracterizado por la ausencia de P1, presente principalmente en la población vietnamita. El anticuerpo anti -P1 generalmente es IgM y no se considera causal de enfermedad hemolítica del recién nacido (1).
P1 se encuentra expresado en linfocitos, granulocitos, monocitos y plaquetas y en forma soluble se lo ha identificado en huevos blancos de paloma y en líquido de quiste hidatídico (1).
Este antígeno del Sistema P también ha sido encontrado en ejemplares de Ascaris suum, Fasciola gigantita, Paragoninus westermani y Dicrocelium dendriticum. El significado clínico de su presencia en estos parásitos aún se desconoce, pero se postula su intervención en el mimetismo molecular (1-3).
Experiencias previas demostraron que los extractos de Ascaris lumbricoides pueden presentar epitopes de los Sistemas ABO, P y Glob (4)(5). Las similitudes bioquímicas entre estos sistemas de grupo sanguíneo hacen suponer que los glucolípidos de membrana podrían estar involucrados en el mecanismo de evasión de la respuesta inmune del hospedero.
El objetivo del trabajo fue determinar la capacidad inhibitoria de A. lumbricoides en relación al antígeno P1.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se trabajó con 11 extractos parasitarios (EA) obtenidos por remoción quirúrgica de la cutícula de ejemplares adultos de A. lumbricoides y ruptura mecánica refrigerada: EAB; EAG; EAX; EAW; EA28; EA29; EA33; EA35; EA36; EA39; EA41 (6).
Para evaluar la capacidad inhibitoria de los extractos en relación a epitopes P1, se realizó la técnica semicuantitativa de inhibición de la aglutinación (7). Se prepararon dos series de diluciones de anticuerpo monoclonal anti-P1 haciendo diluciones al medio a partir del anticuerpo puro y diluido 1/3, para determinar con mayor precisión el titulo de anti-P1 (Puro; 1/2;1/3;1/4; 1/6; 1/8; 1/12; 1/16; 1/24; 1/32, 1/48, 1/64; 1/96; 1/128;…..;1/1024). El volumen final de cada dilución fue 25 µL. Los anticuerpos monoclonales anti-P1 fueron suministrados por Monoclonal Antibodies against Blood Group Antigens (Monoclonal IV Workshop, París, 2001).
A los tubos de la primera serie se les agregaron 25 µL de buffer salino fosfato (PBS), pH 7.4 y a los tubos de la segunda serie 25 µL de EA. Ambas series fueron colocadas a 4 ºC durante 1 hora para permitir la reacción entre el anticuerpo y el extracto parasitario. Pasado este tiempo, se adicionaron a cada tubo 25 µL del sistema revelador (suspensión al 5% de eritrocitos frescos P1 en medio enzimático de bromelina) (8). Después de 24 horas a 4 ºC, se determinó el título de anti-P1 en ambas series. Cuando la diferencia de título del anticuerpo en las series es igual o mayor a dos diluciones, la inhibición de la aglutinación se considera significativa (7). El medio enzimático de bromelina y la temperatura de 4 ºC incrementan la capacidad de reacción antígeno-anticuerpo del Sistema P (8).
Se calculó el Poder Inhibitorio (PI) de los extractos que presentaron epitopes P1 a los fines de evaluar la capacidad inhibitoria. El PI es la relación entre el título del anticuerpo monoclonal (serie 1) y el título del mismo anticuerpo enfrentado al EA (serie 2) (9).
PI = Título de anti-P1/ Título de anti-P1 frente al EA estudiado
A los efectos de comparar la capacidad inhibitoria entre los extractos para cada experiencia, se estandarizaron los valores de PI a la misma concentración de proteínas. Se calculó la cantidad de proteína parasitaria presente en los 25 µL utilizados en la técnica. El valor de PI corresponde a la cantidad de proteína presente en los 25 µL y se calcula el poder inhibitorio que presentaría 1 gramo de proteína del extracto parasitario (PI/g prot) (9).
Para determinar la concentración proteica de los extractos se utilizó un Analitic Analizer (Hitachi 912, Buenos Aires-Argentina) y se empleó un método colorimétrico automatizado basado en la formación de un complejo color violeta originado por la unión de los enlaces peptídicos de las proteínas y el ión cúprico en medio alcalino (10).

RESULTADOS

En la primera experiencia semicuantitativa de inhibición de la aglutinación se estudiaron 6 extractos (EAB; EAG; EA28; EA33; EA36; EA39); los EA29 y EA35 se analizaron en la segunda y los extractos EAX; EAW y EA41 en la tercera experiencia.
La diferencia de título del anticuerpo monoclonal entre la serie con PBS y la serie con EA, fue igual o mayor de dos diluciones para todos los extractos analizados en la primera y segunda experiencia, demostrando la presencia de epitopes P1 en los extractos.
Los extractos estudiados en la tercera experiencia no presentaron capacidad inhibitoria en relación al antígeno P1, siendo la diferencia de título menor a dos diluciones entre la serie con PBS y la serie donde se agregó el EA.
La Tabla I muestra los resultados de la titulación de anti-P1 en la serie 1 (con PBS) y en la serie 2 (con EA) para las suspensiones eritrocitarias utilizadas en las 3 experiencias realizadas de inhibición semicuantitativa de la aglutinación.
Se calculó el PI de los 8 extractos que presentaron epitopes P1.
En la Tabla II se observan los valores de concentración proteica de los EA, el PI y el PI/g prot para los 8 extractos que presentaron capacidad inhibitoria en relación a epitopes P1. Los resultados de la primera experiencia muestran que si bien los extractos EA28 y EA39 presentaron el mayor valor de PI (PI = 8), el que tuvo mayor capacidad inhibitoria expresada por gramo de proteína (PI/g prot) para el sistema antígeno-anticuerpo de la experiencia fue el EA39. Se observó que el EAG fue el de menor valor de PI/g prot. Cuando se relacionó el valor de PI/g prot de los demás extractos de la experiencia con el valor de PI/g prot del EAG, se pudo establecer que los EA39; EA28; EAB; EA33 y EA36 fueron respectivamente 68; 34; 17; 12,75 y 5,45 veces más inhibitorios que el EAG para esa experiencia.
En la segunda experiencia se demostró que si bien el PI de EA29 y EA35 eran distintos, los dos presentaban un valor similar de PI/g prot. La relación entre ambos valores de PI/g prot fue aproximadamente igual a 1, significando que los extractos tuvieron una capacidad inhibitoria similar para el sistema antígeno-anticuerpo de la experiencia.
En la tercera experiencia no hubo inhibición significativa de la aglutinación. Ninguno de los extractos presentó epitopes P1 y por lo tanto no se les determinó el valor de PI.

Tabla I. Resultados de las experiencias semicuantitativas de inhibición de la aglutinación.

Tabla II. Valores de concentración proteica, PI y PI expresados por gramo de proteína de los extractos que presentaron capacidad inhibitoria.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Los antígenos de grupo sanguíneo son componentes químicos bastante simples localizados en la superficie eritrocitaria. Algunos de estos antígenos , como A, B, H, I, i, P, Lewis tienen una amplia distribución en el organismo, ubicándose en células y líquidos corporales, otros como LW, LU, CR fueron detectados en distintos tipos celulares, mientras que Rh y Kell exclusivamente en el eritrocito. La existencia de tan variado polimorfismo antigénico y el hecho de que muchos de estos antígenos no están circunscriptos únicamente al glóbulo rojo ha conducido a la búsqueda del papel biológico de los antígenos eritrocitarios, su relación con los diferentes órganos y tejidos y su asociación con diversas patologías (11).
En los últimos 20 años se demostró que los antígenos de grupo sanguíneo pueden actuar como receptores de parásitos, bacterias y virus (3)(11).
Si bien se sabe que los parásitos pueden portar antígenos de grupo sanguíneo, aún se desconoce el significado clínico de este hecho, aunque se especula que podrían estar involucrados en el complejo mecanismo de evasión de la respuesta inmune del hospedador (3)(11).
Las técnicas de inhibición de la aglutinación y de inmunofluorescencia permitieron detectar antígenos de sistemas de grupo sanguíneo en parásitos (3). Experiencias previas demostraron que A. lumbricoides puede presentar los mismos epitopes ABO, P y P1 que sus hospedadores (4)(5)(9)(12-15) y se comunicó que el 55,55% de los EA estudiados presentaron epitopes P1 que posiblemente fueran absorbidos del hospedador por el parásito durante la migración sanguínea del ciclo evolutivo (4).
Las similitudes bioquímicas entre estos antígenos permiten suponer que los glucolípidos de membrana estarían involucrados en el mecanismo de escape parasitario (4).
En la técnica de inhibición de la aglutinación, los aglutinados resultantes de la reacción entre antígenos y anticuerpos del Sistema P a veces son muy finos y se dificulta su observación; por eso se trabajó con el método semicuantitativo en el que se considera que la inhibición producida es significativa, cuando hay una diferencia de título entre ambas series igual o mayor a dos diluciones.
La utilización de eritrocitos tratados en medio enzimático de bromelina (sistema revelador) y la elección de 4 ºC como temperatura de reacción, aumentan la aglutinación para los antígenos y anticuerpos del Sistema P (8).
Los valores de PI expresados por gramo de proteína de los extractos permitieron obtener valores representativos de la cantidad de epitopes P1 presentes y comparar la capacidad inhibitoria de los extractos para la reacción entre el anticuerpo monoclonal y la suspensión eritrocitaria de la experiencia (9).
Los resultados en la primera experiencia mostraron que si bien dos extractos pueden tener el mismo valor de PI, las capacidades inhibitorias resultan totalmente diferentes al relacionar PI con el contenido proteico del extracto. Por otro lado, la segunda experiencia demostró cómo dos valores distintos de PI pueden corresponder a dos extractos con capacidades inhibitorias similares.
La técnica aplicada es sencilla y se puede adaptar para otros sistemas de grupo sanguíneo y/o microorganismos. Este método permitió evidenciar la presencia de epitopes del Sistema P en extractos de A. lumbricoides y comparar la capacidad inhibitoria que presentaron los diferentes extractos en relación a estos epitopes para una misma reacción antígeno-anticuerpo.

Correspondencia

DRA. PATRICIA PONCE DE LEÓN
Laboratorio de Parasitología
Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas - UNR
Suipacha 531- 2000 Rosario. Argentina
E-mail: tefu1958@hotmail.com

Referencias bibliográficas

1. Daniels GL, Fletcher A, Garraty G, Henry S, Jorgensen J, Judd WJ, et al. Blood group terminology 2004: from the International Society of Blood Transfusion Committee on Terminology for Red Cell Surface Antigens.Vox Sanguinis 2004; 87: 304-15.
2. Nieto Gallegos MD. Antígenos eritrocitarios compartidos. Rev Argent Transf 1998; 24 (4): 295-311.
3. Salmon C. Les groupes sanguins ou l'ecriture des genes. París: Mason; 1997.
4. Ponce de León P, Valverde J. P System epithopes in Ascaris lumbricoides. Rev Inst Med Trop S Paulo 2002; 44 (2): 115-6.
5. Ponce de León P, Valverde J. P System antigenic determiners expression in Ascaris lumbricoides. Rev Inst Med Trop S Paulo 2003; 45 (1): 53-4.
6. Monroy Ostria A, Gómez Gutierrez LJ, Ramírez Ramírez A, Carrillo Laudin G. Reconocimiento por inmunotransferencia de antígenos de Taenia solium y su larva. Rev Latinoam Microbiol 1992; 34: 33-8.
7. Marcelli A, Fine J, Ribat I. Techniques d´ Immunohematologie. 1 ed. Paris: Flammarion; 1981.
8. Reid M, Lomar Francis C. The Blood Group Antigen. London: Academic Press; 1997.
9. Ponce de León P, Foresto P, Valverde J. Método de difusión lumínica aplicado a la capacidad inhibitoria para epitopes ABO en Ascaris lumbricoides. Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39 (4): 463-6.
10. Kachmar JF. Fundamentals of Clinical Chemistry. Munich: Saunders; 1970.
11. Garraty G. Asociación entre grupos sanguíneos y enfermedad ¿Desempeñan un papel biológico los antígenos-anticuerpos de los grupos sanguíneos? Rev Argent Transf 1997; 23: 217-29.
12. Ponce de León P, Valverde J. ABO System: molecular mimicry of Ascaris lumbricoides. Rev Inst Med Trop S Paulo 2003; 45 (2): 107-8.
13. Ponce de León P, Foresto P, Valverde J. H Antigen presence in an Ascaris lumbricoides extract. Rev Inst Med Trop S Paulo 2005; 47 (3): 159-60.
14. Ponce de León P, Foresto P, Valverde J. Ascaris lumbricoides: heterogeneidad en la expresión de epitopes ABO. Rev Invest Clín 2006; 47 (4): 385-93.
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Aceptado para su publicación el 15 de mayo de 2007