TOXICOLOGÍA

Determinación y estandarización de plomo en sangre en operarios de estaciones de servicio del Estado Mérida

Blood lead determination and standardization in petrol station workers in the State of Merida

Laura Molina^1*, María Luisa Di Bernardo², Carlos Rondón^2*, María Ysabel García², Pablo Carrero^2*, José Rafael Luna³, José Gregorio Salazar⁴, Alexis Morales³, Yajaira Hernández⁵, Jesús Peña⁶

^1. Licenciada en Química.
^2. Dr. en Química Analítica.
^3. MSc. en Química Aplicada.
^4. Farmacéutico de la Universidad de Los Andes, Mérida-Venezuela.
^5. Licenciada en Bioanálisis.
^6. Licenciado en Educación (Mención Estadística).

* IVAIQUIM, Instituto Andino Venezolano para la Investigación Química. Facultad de Ciencias. Universidad de Los Andes. Mérida-Venezuela. Apartado postal 5101-A.
GITAEF, Grupo de Investigación en Toxicología Analítica y Estudios Farmacológicos. Facultad de Farmacia y Bioanálisis. Urbanización Campo de Oro, Calle Principal, Edificio Carlos Edmundo Sala. Universidad de Los Andes. Mérida-Venezuela. Apartado postal 5101.

Resumen

En este trabajo se ha determinado el contenido de plomo (Pb) en sangre en operarios de estaciones de servicio de la ciudad de Mérida (Venezuela) y en un grupo de personas no expuestas ocupacionalmente. Las muestras de sangre provenientes de sujetos de ambos sexos n=21 (controles) y n=65 (personal expuesto) fueron procesadas por absorción atómica con atomización electrotérmica (ETAAS). Las concentraciones obtenidas de 15,27±9,62 y 83,74±28,95 µg/L para los grupos denominados como control y expuesto respectivamente, muestran diferencias altamente significativas que evidencian una exposición directa al Pb, por cuanto los valores del grupo expuesto ocupacional son más de 5 veces superiores a los del grupo control. Los resultados obtenidos también muestran que valores iguales o superiores a 54,79 µg/L son indicadores de exposición directa al Pb, permitiendo establecer valores de tolerancia entre los intervalos de 24,89 y 112,69 µg/L. Estos valores de referencia se encuentran por debajo de lo descripto por Burguera y cols. (1997), lo cual podría atribuirse al reemplazo gradual de la gasolina con plomo, en los últimos años, que ha llevado a una disminución de un 27% en los niveles de plomo en sangre, en comparación con un estudio similar realizado en esta misma ciudad en el año 1997.

Palabras clave: Plomo; Polución; Absorción atómic; Atomización electrotérmica; Modificadores; Sangre

Summary

In this work the lead (Pb) content in blood was determined in petrol station workers in the city of Merida-Venezuela and in a group of people not occupationally exposed. The blood samples coming from subjects of both sexes n=21 controls and n=65 exposed workers were processed by atomic absorption with electrothermal atomization (ETAAS). The 15.27±9.62 and 83.74±28.95 µg/L concentrations obtained for the group referred to as control and exposed respectively show highly significant differences that evidence a direct exposure to Pb, since the values of the occupationally exposed group are more than 5 times higher than those of the control group. The results obtained also show that values equal to or higher than 54.79 µg/L are indicative of direct exposure to Pb, making it possible to establish tolerance values between the 24.89 and 112.69 µg/L intervals. These reference values are below what was reported by Burguera et al (1997) which could be attributed to the gradual substitution of gasoline for lead that has originated a 27% decrease in lead levels in blood, if compared with a similar study carried out in the same city in 1997.

Key words: Lead; Pollution; Atomic absorption; Electrothermal atomization; Modifiers; Blood

INTRODUCCIÓN

La contaminación y el envenenamiento por plomo son problemas muy conocidos que no distinguen grupos sociales, económicos, étnicos, religiosos, ni áreas geográficas (1). En las dos últimas décadas, el interés acerca de la toxicidad del plomo en los seres humanos ha ido desde sus efectos por exposición industrial hasta la exposición ambiental.
En Venezuela, a comienzos del año 2000, se inició un proceso de introducción gradual y reemplazo de combustible corriente por un combustible sin plomo, lo que debería conducir a una disminución relativa de la carga del metal en el ambiente. Desafortunadamente, por ser un elemento no bio-degradable, en la mayoría de las ciudades las concentraciones de Pb son elevadas como consecuencia de su acumulación en los suelos a lo largo de años de grandes emisiones sin control.
El plomo produce una gran cantidad de efectos nocivos para el organismo, actúa a nivel del desarrollo de los glóbulos rojos, el sistema cardiovascular y el sistema nervioso central (2). Los síntomas de intoxicación por plomo son numerosos. La exposición crónica, incluso a niveles bajos de plomo, va en detrimento del desarrollo mental de los niños y se le ha relacionado con una disminución en el cociente intelectual y con problemas de comportamiento (3).
Otros síntomas de intoxicación por plomo pueden ser: irritabilidad, comportamiento agresivo, disminución del apetito y la energía, sueño insuficiente, dolores de cabeza, estreñimiento y pérdida de destrezas del desarrollo recientemente adquiridas (en niños pequeños). También son comunes la anemia y los cólicos abdominales. Los altos niveles de plomo pueden causar encefalopatía aguda con vómito, marcha inestable, debilidad muscular, convulsiones y hasta coma (4-6).
Se han establecido desde hace mucho tiempo los riesgos de la exposición laboral al plomo, y en correspondencia, diferentes organismos e instituciones, a nivel mundial, han señalado los lineamientos para limitar, reducir y controlar esta exposición.
Actualmente la Administración de Salud y Seguridad Ocupacional (OSHA) en los Estados Unidos de América (7) recomienda el retiro de la exposición al metal para una población trabajadora con una concentración de 50 µg/dL de plomo en sangre. No obstante, la Conferencia Americana de Higienistas Industriales Gubernamentales (ACGIH) sugiere que los niveles biológicos máximos permisibles de exposición límite no deben exceder de 30 µg/dL de plomo en sangre (8).
Investigaciones más recientes (9) han demostrado que el plomo es tóxico, aun a niveles bajos en sangre suficientes como para producir síntomas clínicos asociados a la exposición con el metal. Sin embargo, en este trabajo se han encontrado operarios con niveles de Pb por encima de los valores de referencia que no presentaban ningún indicio de intoxicación. De este modo, el ejercicio de profesiones o labores que obligan a los trabajadores a estar en contacto con los compuestos de plomo, representa la causa más frecuente de intoxicación crónica, por ingreso del tóxico, ya sea por vía digestiva o pulmonar, bajo la forma de vapores o incluso partículas muy finas en suspensión en el aire y hasta a través de la piel (10).
Sobre esta base, personas que están o han estado expuestas de manera permanente a los efectos nocivos del plomo, tales como los trabajadores de las estaciones de servicio y expendios de gasolina, pueden presentar concentraciones de plomo en sangre y orina que ponen en peligro su salud física y mental (11).
El nivel de plomo en sangre es un índice de la concentración crónica en el organismo. El nivel de plomo en orina indica una concentración aguda, más reciente. Esto permite contar con parámetros de diagnóstico referenciales a los fines de adoptar medidas de prevención, control y eliminación del plomo ambiental y corporal, por parte, tanto de los organismos que tienen que ver con la planificación del ordenamiento urbano, como de las autoridades sanitarias y propietarios de expendios de gasolina, quienes deben tener la responsabilidad de asegurar las mejores condiciones de seguridad sanitarias y laborales a la población.
La información acerca de la concentración de plomo en muestras ambientales y biológicas es de gran interés clínico, ambiental y ecológico. Se sabe desde hace mucho tiempo que este metal es un elemento seriamente tóxico para la salud de los organismos vivientes, además de que es un elemento al cual no se le ha detectado ninguna función vital, y sus efectos tóxicos han ido en ascenso en los últimos años debido a su extenso uso en baterías, pinturas, gasolina con plomo y otros productos derivados. Esto ha tenido un profundo impacto ambiental, causando daños en el ecosistema y en humanos principalmente por ingestión en alimentos e inhalación. La determinación de plomo en muestras biológicas como sangre y orina constituye un importante indicador del grado de exposición al metal.
Debido a que actualmente la gasolina con plomo ha sido sustituida por gasolina sin plomo, es importante en el Estado Mérida actualizar los valores de referencia para plomo en sangre y orina (12).
Por otra parte, es necesario también mejorar la metodología analítica y actualizarla en relación con modificadores de matriz y programas cortos de temperatura (tiempos cortos de tratamiento térmico), en lugar del empleo de programas largos de temperatura donde sólo la temperatura de pirólisis es de 30 segundos o más (13).
Por estas razones se consideró conveniente hacer este estudio sistemático para la determinación de plomo en sangre por ETAAS, que sumado a la optimización de la técnica, empleando un anticoagulante mejor para el caso de la sangre, la digestión, la dilución y un surfactante mejor para disminuir la tensión superficial, así como un modificador permanente y un programa de temperatura corto, ha permitido desarrollar un método más actual y exitoso para la determinación de plomo en sangre y orina por ETAAS en individuos expuestos o no al metal.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizó un estudio prospectivo, transversal, descriptivo y analítico, previa autorización de las empresas gasolineras, en 65 trabajadores, mayores de 18 años de edad, con puesto de despachadores de gasolina. A todos los sujetos se les explicó el objetivo y procedimientos del estudio. Se obtuvo la aprobación del trabajador a través de una carta de consentimiento. Se registraron los datos personales y laborales del trabajador: nombre, edad, sexo, antigüedad laboral, puesto de trabajo. Se recogieron muestras de sangre venosa en ayuno en tubos al vacío, con anticoagulante heparina para la determinación de plomo. La medición del plomo se realizó por espectrofotometría de absorción atómica con horno de grafito (10-16).
Obtención de las muestras
Las muestras de sangre se tomaron de la vena del antebrazo derecho y se conservaron con heparina y bajo refrigeración a - 4 ºC hasta el momento de la preparación de las mismas.

Aparatos
Se utilizó un espectrofotómetro de absorción atómica Perkin-Elmer, modelo 2100 (Uberlingen-Alemania), equipado con una unidad de atomización HGA-700 y un automuestreador AS-70 de la misma marca, conectado a un computador personal para la operación del software Perkin-Elmer, versión 9.1. Para la evolución de la señal se usó una lámpara de cátodo hueco de plomo Perkin-Elmer (Uberlingen-Alemania) y una lámpara de deuterio (D₂) Perkin-Elmer como corrector de fondo (Uberlingen-Alemania). Se utilizaron tubos de grafito parte Nº 109322 Perkin-Elmer (Uberlingen-Alemania) equipados con plataformas integradas de grafito pirolítico parte Nº B0109324 de la misma marca.

Reactivos
Todos los reactivos usados fueron de grado analítico. El ácido etilendiaminotetraácetico (EDTA) BDH (Deutschland-Alemania); ácido nítrico, Redel-de Haën (Hannover-Alemania); ácido nítrico (99,999% libre de metales) Alfa Aesar (Karlsruhe-Alemania); Argón, AGA GAS (Mérida-Venezuela); fosfato de amonio dibásico, cristal, Sigma (Munich-Alemania); fosfato de amonio monobásico, cristal, J T Baker (Alemania); iridio, Merck (Darmstadt-Alemania ); heparina sódica, Lab. Valmorca (Mérida-Venezuela); nitrato de paladio Merck (Darmstadt-Alemania); plomo metálico Merck (Darmstadt- Alemania); rodio Merck (Darmstadt-Alemania) y tritón X-100 Sigma (Munich-Alemania).

Tratamiento del material
Para la preparación de soluciones y lavado del material de laboratorio se empleó agua desionizada de alta pureza Milli-Q (18 MW cm-1 de resistividad). Todo el material utilizado (vidrio, polietileno, entre otros) fue lavado y luego se sumergió en una solución de HNO3 al 20% v/v durante por lo menos 12 horas y se mantuvo en la solución ácida hasta que se utilizó, con el objeto de eliminar cualquier tipo de contaminación del material y sobre todo trazas del metal en estudio. Al momento de utilizar el material, éste se enjuagó con agua desionizada y se curó con la solución a utilizar.

Metodología analítica
La determinación de plomo se realizó por espectroscopia de absorción atómica acoplada con atomización electrotérmica (ETAAS) en un equipo Perkin-Elmer, modelo 2100 provisto de automuestreador AS-70, inyector automático y horno de grafito HGA-700 a una longitud de onda de 283,3 nm. El método utilizado fue desarrollado y optimizado en el Laboratorio de Espectroscopia Molecular de la Facultad de Ciencias de La Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela, por Burguera y cols. (12). En este trabajo se probaron nuevos modificadores con la finalidad de acortar los tiempos de análisis.

Características analíticas
Las características analíticas se determinaron usando las condiciones óptimas. En la Tabla I se muestra el límite de detección, LOD (definido como la concentración de plomo que produce una señal analítica igual a tres veces la desviación estándar del blanco); la masa característica, mo (definida como la concentración de plomo requerida para producir una señal de 1% de absorción, es decir, 0.0044 unidades de absorbancia); sensibilidad, m (expresada como la pendiente de la curva de calibrado); el intervalo lineal LOQ-LOL, en el cual LOQ es el límite de cuantificación (definido como diez veces la desviación estándar del blanco entre la pendiente, además es el límite inferior de las curvas de calibrado e indica la cantidad mínima de plomo que se puede medir con exactitud), LOL es la concentración en que la curva se desvía de la linealidad; RSD (%) es la desviación estándar relativa y r2 es el coeficiente de correlación(15-19).
La temperatura de pirólisis se optimizó variando la temperatura entre 400 y 1.000 °C y los resultados se muestran en la Figura 1.
La disminución en la absorbancia para las muestras de sangre no es significativa, sin embargo, para temperaturas menores de 800 ºC la señal de fondo es muy alta, lo que dificulta la capacidad de la lámpara de deuterio para corregir el fondo; esta mayor señal se debe a que la temperatura no es suficiente para eliminar la mayor parte de la matriz de la muestra, comportamiento que no se observa para el patrón acuoso puesto que no hay matriz que interfiera. Para temperaturas superiores a 800 °C se obtienen mejores perfiles de absorbancia y la señal de fondo es mucho más baja. Para el patrón tampoco se observan diferencias significativas en las medidas de absorbancia entre 800 y 1.000 ºC, así se establece la temperatura de pirólisis en 900 ºC.

Tabla I. Características analíticas para la determinación de plomo en patrones acuosos, tomando en consideración las condiciones optimizadas. mo: masa característica. LOD: límite de detección. LOQ-LOL: intervalo lineal.
RSD: desviación estándar relativa. r²: coeficiente de correlación.

Figura 1. Efecto de la temperatura de pirólisis en la señal de absorbancia de Pb en muestras de sangre y patrones acuosos con la mezcla de modificadores Ir-Rh/Ir optimizada.

La temperatura de atomización se varió entre 1.400 y 2.400 °C para la disolución patrón de 30 µg L-1 y muestras de sangre, manteniendo fija la temperatura de pirólisis en 900 °C y la mezcla de modificadores Ir-Rh/Ir optimizada. Los resultados se muestran en la Figura 2.
En base a estos resultados se decidió establecer una temperatura de atomización en 2.200 ºC, con una temperatura de pirolisis de 900 ºC. Las medidas de absorbancia no presentan mucha diferencia entre 1.800 y 2.400 ºC, en cuanto a sensibilidad, pero para esta temperatura se observan mejores perfiles. Los perfiles mostrados en la Figura 3 son los optimizados para el análisis de plomo en sangre, y si se compara con los de la Figura 4 se observa la mejora en cuanto a sensibilidades y señal de absorbancia.

Figura 2. Efecto de la temperatura de atomización en la señal de absorbancia de Pb en muestras de sangre y patrones acuosos con la mezcla de modificadores Ir-Rh/Ir optimizada.

Figura 3. Perfil de la señal analítica de Pb en un patrón de Pb 30 µg L^-1 y muestras de sangre, a una temperatura de atomización de 2.200 ºC. La línea punteada es la señal de fondo y la línea continua es la señal de Pb .

Figura 4. Perfil de la señal analítica de Pb en un patrón de Pb 30 µg L^-1 y muestras de sangre, a una temperatura de pirólisis de 800 ºC.
La línea punteada es la señal de fondo y la línea continua es la señal de Pb.

Exactitud del método
Para estudiar la exactitud del método propuesto se hizo un estudio de recuperación y análisis de muestras certificadas, SeronormTM Trace Elements (USA).

Estudios de recuperación
Los estudios de recuperación se realizaron en muestras reales de sangre a las cuales se le agregaron cantidades conocidas de patrón, tomando en consideración el modificador Ir-Rh/Ir optimizado, la temperatura de pirólisis y atomización, y las características analíticas. Los resultados se muestran en la Tabla II, donde se obtiene una recuperación entre 96 y 105%. Se realizó una curva de calibración sencilla y una curva de adición de estándar y el porcentaje de recuperación se obtuvo para cada punto.

Tabla II. Porcentaje de recuperación en la determinación de Pb en sangre.

RESULTADOS

El estudio involucró 65 sujetos, 7 de sexo femenino (F) y 58 de sexo masculino (M) todos operarios activos con tiempos de trabajo entre 1 y 300 meses en las estaciones de servicio del casco de la ciudad de Mérida (16 estaciones de servicio) denominados "personal expuesto o de alto riesgo". Además, se contó con 21 muestras, denominadas controles, procedentes de sujetos ajenos al área de trabajo evaluada, designados como "no expuestos o de bajo riesgo". La evaluación estadística de los datos para un nivel de confianza del 95% se realizó en el STATISTIX 7.0. Los resultados experimentales, además de otras variables tales como edad, peso corporal y tiempo de exposición están expresados como media ± desviación estándar (DE), con sus respectivos rangos máximos y mínimos, varianzas, desviación estándar relativa (RSD%) y mediana. Los mismos se resumen en las Tablas III y IV. La edad está expresada en años, el peso en kilogramos, el tiempo de exposición en meses y la concentración del elemento en µg/L.

Tabla III. Parámetros estadísticos simples del grupo control o no "expuesto".

Tabla IV. Parámetros estadísticos simples del personal expuesto (operarios).

DISCUSIÓN

La estadística descriptiva simple muestra rangos de edades de 21-69 ± 12,20 y 18-54 ± 7,99 años, para los no expuestos y expuestos, respectivamente. Con RSD de 37,12 y 25,32%, evidenciando cierta homogeneidad, a pesar del amplio rango de edades muestreadas.
La concentración obtenida de 15,27±9,62 y 83,74± 28,95 µg/L para el grupo denominado "control" y "expuesto" respectivamente, muestra diferencias altamente significativas con un p=0,035; como se observan en la Tabla V. De este resultado se presume que valores iguales o superiores a 54,79 µg/L, límite inferior de la concentración de plomo encontrada para el grupo expuesto, evidencian exposición directa al agente tóxico, permitiendo establecer valores de tolerancia entre los intervalos de 24,89 y 112,69 µg/L, límite superior de la concentración de plomo encontrada para el grupo no expuesto y el expuesto, respectivamente. Al fijar como valor de referencia en la población expuesta el dato de 130,87±62,08 µg/L, tomando en consideración el de la no expuesta, surge un nivel de referencia para la primera de 68,79±62,08 µg/L (media ± DE poblacional del intervalo 24,89 y 112,69 µg/L). Esta amplitud de la DE puede deberse al intervalo tan amplio en mínimos y máximos encontrados de 45-188 y de 1,65-30,73 µg/L, en la población expuesta y controles respectivamente, y no a los tiempos de exposición. Esta amplitud podría atribuirse al metabolismo individual. Esta presunción, posteriormente se corrobora por la correlación de Pearson, donde no influye el tiempo de exposición en la concentración. Este valor de referencia se encuentra por debajo del descripto por Burguera y cols., como se observa en la Tabla VI, que se explicaría en relación al reemplazo gradual de la gasolina sin plomo, en años recientes, que condujo a una disminución de un 27% en los niveles de plomo en sangre, en comparación con el año 1997, en un estudio similar realizado en esta misma ciudad (11)(12) En Estados Unidos, después de la eliminación del plomo en la gasolina, los niveles de Pb en sangre disminuyeron cerca de un 40%, lo que significo un ahorro en salud de cerca de 46.500 millones de dólares por la eliminación de los efectos tóxicos atribuibles al plomo (14). Los operarios con hábitos de fumar e ingerir licor, aun con tiempos de exposición similares, mostraron niveles más altos de Pb; sin embargo, no arrojaron diferencias significativas con un p=0,85. Este comportamiento podría explicarse por el hecho de tratarse de fumadores o consumidores de licor ocasionales. A esto puede agregarse la ingesta diaria de alimentos lácteos, con predominio de leche y queso. Estos últimos, a diferencia del cigarrillo y el licor, contribuirían a la eliminación del plomo por vía urinaria, al formar con la caseína (proteína presente en los lácteos) un quelato insoluble llamado caseínato de plomo (2).
El tiempo de exposición, el peso y la edad, mostraron una débil correlación inversa y negativa, con la concentración de Pb en los dos últimos años (Tabla VII). De hecho, esta acción ha condicionado que el plomo sea la toxina ambiental más abundante y a la que mayor porcentaje de la población mundial se encuentra expuesta. Se estima que cerca del 95% del plomo en la atmósfera proviene de la combustión de gasolina con plomo.

Tabla V. Prueba t de Student.

Tabla VI. Valores de referencia de Pb en muestras de sangre, orina y gasolina.

Tabla VII. Correlación de Pearson.

CONCLUSIONES

El valor de referencia de plomo en sangre para el estudio realizado en la ciudad de Mérida en una población expuesta (operarios de las estaciones de servicio), tomando en consideración la no expuesta, es de 68,79±62,08 µg/L.
Las características analíticas evaluadas muestran que el método desarrollado es confiable y sensible, con un límite de detección de 1,44 µg/L y una precisión de 1,95%. Por otro lado, la exactitud del método fue corroborada mediante el análisis de muestras certificadas de sangre y por estudios de recuperación, encontrando un porcentaje de recuperación entre 96 y 105%.
Los valores descriptos muestran que se ha producido un descenso en la concentración de plomo en sangre en la población expuesta, debido a las medidas tomadas por el gobierno al suprimir el plomo en la gasolina. Sin embargo, siguen siendo elevados los valores encontrados en la población expuesta y aunque no se presentaron casos con signos y síntomas relacionados con toxicidad por plomo, de este trabajo se puede concluir que es fundamental el control de los trabajadores expuestos, a fin de tratar de mantener los valores dentro de los límites aceptables y evitar la aparición de signos y daños clínicos irreversibles.

Correspondencia

DRA. MARÍA LUISA DI BERNARDO
Dr. Química Analítica
Dpto. de Farmacología y Toxicología
Facultad de Farmacia y Bioanálisis
Universidad de los Andes
Mérida, Venezuela
E-mail: girard@ula.ve

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Aceptado para su publicación el 8 de mayo de 2007