BIOQUÍMICA CLÍNICA

Asociación molecular y función del agente tensioactivo pulmonar de ternera

Molecular association and function of calf lung surfactant

María del Lurdez Consuelo Martínez Montaño^1*, José Luis Muñoz Sánchez^2**, Isabel Baeza Ramírez^3**

^1. Maestra en Ciencias (orientación Bioquímica)
^2. Doctor en Ciencias (orientación Bioquímica)
^3. Doctora en Ciencias (orientación Bioquímica)

* Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 13 Sur 2702, Colonia Volcanes, Puebla, México. Teléfono: 52(22) 229 5500, Ext.6080. Fax: 55(22) 229 5648.
E-mail: lumarmon@yahoo.com
** Departamento de Bioquímica, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, 06401 México, D.F., México. Teléfono 52(55) 729 6000, Ext. 62323.
E-mail: pcervan@hotmail.com

Resumen

El agente tensioactivo pulmonar es un material compuesto de fosfolípidos, lípidos neutros y proteínas que se encuentra en la superficie alveolar de los pulmones y facilita la ventilación alveolar. La organización molecular de los componentes del agente tensioactivo aislado de pulmones de ternera fue analizada por calorimetría diferencial de barrido y por dispersión dinámica de luz y posteriormente comparada con los componentes organizados en liposomas uni y multilamelares; además, se probó la actividad de superficie al desarrollar en cobayos el síndrome de dificultad respiratoria. Los estudios de calorimetría mostraron que las interacciones lípido-proteína fueron considerablemente abatidas en el agente tensioactivo nativo, en comparación con las del agente tensioactivo en forma de liposomas uni o multilamelares. Los experimentos de dispersión dinámica de luz indicaron que el agente tensioactivo nativo tiene forma fibrilar con interacciones limitadas entre lípidos y proteínas, lo que sugiere que se encuentra organizado en una estructura en forma de reja formando una película de estructura estable. Los resultados obtenidos resaltan la importancia de la organización molecular del agente tensioactivo. Cuando éste fue usado para tratar a los animales con síndrome de dificultad respiratoria, los valores del pH arterial y de PaCO₂ mejoraron casi hasta alcanzar los valores normales; cuando se utilizó el agente tensioactivo reconstituído como liposomas uni o multilamelares, los animales no se recuperaron. Es importante enfatizar que el método seguido en el protocolo de aislamiento del agente tensioactivo pulmonar de ternera permitió obtenerlo en una forma fisiológicamente activa.

Palabras clave: Agente tensioactivo pulmonar de ternera; Liposomas multilamelares; Liposomas unilamelares; Síndrome de dificultad respiratoria; Calorimetría diferencial de barrido; Dispersión dinámica de luz

Summary

Surfactant, a highly surface-active material composed of phospholipids, neutral lipids and proteins, lines the lungs' alveolar surface facilitating alveolar ventilation. The molecular organization of surfactant components isolated from calf-lungs was analyzed by differential-scanning calorimetry and dynamic light-scattering, and subsequently compared to surfactant components organized in uni and multilamellar liposomes. The respiratory distress syndrome developed in adult guinea pigs was used for assessing surfactant activity. Calorimetry studies showed that lipid-protein interactions were considerably abated in native surfactant as compared to those of surfactant in uni or multi-lamellar liposomes. Light-scattering experiments indicated that native surfactant has a fibrillar shape with limited lipid-protein interactions, suggesting that it is organized in a lattice-like structure forming a stable film. These findings underscore the importance of the native molecular organization of surfactant. When surfactant reconstituted as uni- or multilamellar liposomes was administred to animals under respiratory distress, they did not recover. In contrast, when native surfactant was used to treat sick animals, arterial pH and PaCO₂ values improved, almost reaching normal values. It is important to emphasize that fewer steps in the protocol for isolation of calf lung surfactant made it possible to obtain it in a physiologically active molecular form.

Keywords: Calf lung surfactant; Multilamellar liposomes; Unilamellar liposomes; Respiratory distress syndrome; Differential scanning calorimetry; Light scattering

INTRODUCCIÓN

La sustancia tensioactiva pulmonar es producida por células epiteliales alveolares tipo II, también denominadas neumocitos tipo II (1). En estas células se forman cuerpos lamelares típicos, los cuales son estructuras fijas a la membrana que contienen fosfolípidos y son secretados al interior de la luz alveolar por exocitosis. Se forman tubos de material lipídico llamados mielina tubular, que forman una película de fosfolípidos. Algunos de los complejos proteína-lípido de la sustancia tensioactiva pulmonar son captados por endocitosis en las células alveolares tipo II y son reciclados (2-4).
La sustancia tensioactiva pulmonar es un material con alta actividad de superficie compuesto de fosfolípidos, lípidos neutros y proteínas; una deficiencia en la cantidad o en la composición de la sustancia tensioactiva causa atelectasia, daño alveolar y generalmente compromete la integridad espacial de la superficie de mucosa, necesaria para hacer eficiente el intercambio gaseoso (5). Esto ocaciona el síndrome de dificultad respiratoria neonatal y es una causa importante de mortalidad en todo el mundo (6-8).
La contribución más importante de la sustancia tensioactiva pulmonar a la estabilidad de las vías aéreas periféricas consiste en inhibir el colapso del alvéolo a bajos volúmenes de aire en el pulmón durante la respiración. También inhibe el exudado de líquidos desde la circulación pulmonar a las vías aéreas y así actúa como un factor antiedematoso.
En 1980 Fujiwara y col. (9) desarrollaron un método para extraer agente tensioactivo de pulmones de res triturados. Esto se administró por medio de instilación, a través de un tubo endotraqueal, a 10 bebés prematuros con síndrome de dificultad respiratoria del recién nacido. Todos los bebés mejoraron los valores de los gases sanguíneos entre los veinte minutos y las tres horas de su aplicación y se redujeron las presiones respiratorias. La sustancia de Fujiwara, llamada TA, se encuentra comercialmente disponible en Japón desde octubre de 1987 con el nombre comercial de Surfacten (4).
Se han realizado estudios que tratan de caracterizar la composición y la organización molecular de esta sustancia tensioactiva. Se conoce su composición química, pero aún se realizan estudios para conocer en detalle la estructura y la asociación molecular de sus componentes.
El objetivo de este trabajo fue caracterizar la organización molecular del agente tensioactivo pulmonar de ternera aislado en el laboratorio y establecer el análisis funcional del mismo, ya que mostró actividad terapéutica en modelos experimentales del síndrome de dificultad respiratoria con el fin de obtener preparaciones reproducibles de la misma, en composición y estructura, que puedan aplicarse en el tratamiento de padecimientos que cursan con alteración funcional del agente tensioactivo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento y composición bioquímica del agente tensioactivo de ternera
El aislamiento del líquido bronquioalveolar se realizó por la técnica de Matcalfe y Enhorning (10) modificada en el presente trabajo, a partir del pulmón de ternera y la extracción de la sustancia tensioactiva pulmonar se hizo por solubilidad diferencial, de acuerdo al método de Bligh y Dyer que en el presente trabajo se modificó para hacer la extracción de fosfolípidos a partir del líquido bronquioalveolar (11).
La caracterización cualitativa de la sustancia tensoactiva pulmonar se realizó por cromatografía bidimensional en capa fina y por electroforesis en gel de poliacrilamida (12). El contenido total de fosfolípidos se determinó por el método espectrofotométrico de Mohan Hallen (13) y el contenido de proteínas se evaluó por el método de Lowry (14).

Organización molecular del agente tensioactivo pulmonar de ternera
La organización molecular de los componentes de la sustancia tensioactiva en la forma nativa tal cual se aísla de los pulmones de ternera fue analizada por calorimetría diferencial de barrido (15-17) y por dispersión dinámica de luz (18-21) y se comparó con la organización de los componentes de la sustancia tensioactiva en forma de liposomas uni y multilamelares (22-24). El procedimiento usado para formar liposomas no produce ningún tipo de desnaturalización proteica tal como fue demostrado por Zazueta y col. (25).
La calorimetría diferencial de barrido se empleó para el estudio de parámetros termodinámicos. Las estructuras altamente cooperativas como los biopolímeros (agregados lipídicos o liposomas) son estabilizados por la cooperación de numerosas fuerzas (por ejemplo puentes de hidrógeno, fuerzas electrostáticas e interacciones hidrofóbicas, etc.) y frecuentemente sufren transiciones de fase que resultan de cambios en la conformación, en el punto de ebullición, en el estado de hidratación-deshidratación, agregación y desagregación o una combinación de estos factores. Esta técnica proporciona información sobre la estructura del complejo en estudio (12)(16).
Los estudios de dispersión dinámica de luz se han usado en varios sistemas para distinguir estados de agregación. El método de análisis de los resultados de esta técnica permite conocer el promedio de radio hidrodinámico, el peso molecular y la dispersión del sistema en estudio (20)(21).

Análisis funcional de la sustancia tensioactiva pulmonar por la valoración de su actividad tensioactiva en cobayos
La aplicación del agente tensioactivo pulmonar en su forma nativa o en forma de liposomas en modelos experimentales permitió obtener información respecto a la respuesta biológica frente a la administración de diversas posibilidades de asociación de los componentes del agente tensioactivo pulmonar. Para esta etapa se empleó el modelo de Lachman (26). Con el fin de comprobar que los cobayos empleados en la valoración de la actividad tensioactiva, habían desarrollado el síndrome de membrana hialina al eliminar la sustancia tensioactiva endógena, se realizó un estudio histológico a cada uno de ellos. Se tomó una muestra de tejido pulmonar de cada uno de los cobayos y se procesó para su inclusión, fijación y realización de cortes que luego fueron observados al microscopio.

Análisis estadístico
Los resultados se presentan como el valor medio ± las desviaciones estándar. Las comparaciones de la composición de fosfolípidos y proteína del agente tensioactivo pulmonar de ternera, así como los resultados de su función tanto en los grupos tratados con los diferentes procedimientos como en el grupo control, fueron analizados por medio de la prueba t de Student (27).

RESULTADOS

Aislamiento del agente tensioactivo a partir de pulmones de ternera
Se usó una modificación a la técnica de Metcalfe y col. (10). Se obtuvieron 50 dosis de agente tensioactivo pulmonar de ternera por medio de lavado transtraqueal de 55 pares de pulmones de ternera usando 330 litros de solución salina isotónica a pH 7.4, de los cuales 184 litros de líquido fueron recuperados. Este líquido se usó para el aislamiento del agente tensioactivo pulmonar de ternera nativo. Se prepararon dosis con un volumen de 2 mL que contenían 20 mg/mL de fosfolípidos.

Composición bioquímica del agente tensioactivo pulmonar de ternera
La sustancia tensioactiva pulmonar aislada contenía 92,5±0,5% de lípidos y 7,5±0,1% de proteínas. La fracción de lípidos estuvo compuesta de 90,5±1,7% de fosfolípidos y 9,5±0,1% de colesterol.

Composición de las fracciones del agente tensioactivo pulmonar de ternera
La fracción de fosfolípidos de las muestras del agente tensioactivo pulmonar de ternera se determinó
por cromatografía en capa fina. Contenía: 80,5±0,02%
de fosfatidilcolina, 7,4±0,3% de fosfatidilglicerol, 5,7±0,2% de fosfatidilserina y fosfatidilinositol, 2,2±0,3% de fosfatidiletanolamina, 2,2±0,2% de esfingomielina y 2±0,2% de cardiolipina. La cantidad total de fosfolípidos determinada por el método de Mohan (13) fue de 5,3±0,03 mg/mL.
La fracción de proteínas analizada por electroforesis en condiciones nativas, no reductoras, mostró una proteína como constituyente importante con un peso molecular de 49,3 kDa. La proteína total en el agente tensioactivo pulmonar nativo fue estimada en 429,4±56,4 µg/mL por el método de Lowry y col. (14).
Los valores molares de 7,6 mM para fosfolípidos y 8,7 µM para proteínas fueron estimados a partir de los pesos moleculares de dipalmitoílfosfatidilcolina (el fosfolípido más abundante) y del peso molecular de la proteína más abundante (49,3 kDa), así como de sus correspondientes concentraciones totales. Se encontró una relación molar fosfolípido: proteína, de ca. 879:1 para el agente tensioactivo pulmonar de ternera nativo estudiado.

Organización molecular del agente tensioactivo pulmonar de ternera
El ancho y la forma de las curvas de transición obtenidas por medio de los estudios de calorimetría diferencial de barrido de los arreglos moleculares de los lípidos, proporcionó información sobre la transición de fase, incluyendo el rango de temperatura en que ocurre (temperatura de transición) y el correspondiente cambio de entalpía. Esos parámetros están relacionados con la pureza del sistema de lípidos y la naturaleza de la transición de fase. Las determinaciones de calorimetría diferencial de barrido mostraron claramente termogramas diferentes cuando el agente tensioactivo pulmonar de ternera estaba en la forma nativa y cuando se comparó con preparaciones en las cuales el agente tensioactivo pulmonar de ternera nativo estaba organizado en liposomas uni o multilamelares (Fig. 1 A-C).
Las temperaturas de transición de los termogramas para el agente tensioactivo pulmonar de ternera en las tres asociaciones moleculares estudiadas, así como de los liposomas multilamelares formados solamente con la fracción lipídica del agente tensioactivo (sin proteína) se muestran en la Tabla I. Los valores para la amplitud de los termogramas a la altura media también se muestran en la Tabla I.
La dispersión dinámica de luz proporcionó información sobre los coeficientes de difusión y los radios hidrodinámicos, los cuales, de acuerdo con Buchard y Bloomfield (20)(21) pueden ser equivalentes a radios de esferas duras. Además, como la dispersión dinámica de la luz varía como una función del tamaño, también proporciona información respecto al peso molecular. El presente estudio mostró que los liposomas unilamelares del agente tensioactivo pulmonar presentaron coeficientes de difusión mayores, mientras que el agente tensioactivo pulmonar de ternera en su forma nativa y los asociados en liposomas multilamelares mostraron coeficientes de difusión menores (Tabla II). En relación al radio hidrodinámico, los liposomas unilamelares mostraron los valores más pequeños (38,5 nm), mientras que el agente tensioactivo pulmonar de ternera, tanto en la forma nativa como asociado en liposomas multilamelares mostró valores mayores. Respecto al peso molecular, el agente tensioactivo pulmonar en su forma nativa mostró el mayor peso molecular (Tabla II), valor que fue significativamente diferente de aquellos determinados para el agente tensioactivo pulmonar de ternera asociado en liposomas uni y multilamelares, como lo demostró el análisis estadístico.

Figura 1. Termogramas de los ensayos de calorimetría diferencial de barrido del agente tensioactivo pulmonar de ternera. El agente tensioactivo está organizado en la forma nativa (A), en forma de liposomas multilamelares (B) y en forma de liposomas unilamelares (C).

Tabla I. Temperatura de transición y amplitud de los termogramas del agente tensioactivo pulmonar y de ternera organizado en tres asociaciones moleculares diferentes.

Tabla II. Determinaciones de dispersión dinámica de luz del agente tensioactivo pulmonar de ternera, organizado en tres asociaciones moleculares diferentes.

Análisis funcional de la sustancia tensoactiva pulmonar por la valoración de su actividad tensioactiva en cobayos
El análisis funcional de la sustancia tensioactiva pulmonar se realizó con el modelo de Lachman (26), modificado en el presente trabajo. Con el fin de mantener en mejores condiciones el equilibrio ácido base de los cobayos, de modo que se permitiera la observación de la respuesta ante la aplicación del agente tensioactivo de ternera, se decidió realizar únicamente 3 lavados bronquio alveolares para eliminar el agente tensioactivo endógeno.
En el grupo problema de cobayos, se realizó la reposición del agente tensioactivo a una concentración de 20 mg/mL, en dos tiempos, a los 10 y a los 30 min posteriores al lavado bronquio-alveolar, por instilación de la sustancia tensioactiva obtenida de pulmón de ternera organizado en la forma nativa en el grupo 1, en la forma de liposomas multilamelares en el grupo 2 y de liposomas unilamelares en el grupo 3. El grupo 4 fue el grupo control que no recibió tratamiento con agente tensioactivo pulmonar de ternera y solamente recibió por instilación NaCl 0,15 M.
Las determinaciones de pH y PaCO₂ arteriales se hicieron a los tiempos 0, 10, 30, 50, 70 y 90 min después de la eliminación de la sustancia tensioactiva endógena.
El comportamiento presentado por el grupo problema de cobayos en todas las variables siguió una tendencia hacia la recuperación de los valores normales después de la administración en dos tiempos de la sustancia tensioactiva de pulmón de ternera en su forma nativa, es decir, que ésta mostró un efecto terapéutico en los cobayos en donde se desarrolló experimentalmente el síndrome de dificultad respiratoria. En cambio, los comportamientos de los grupos tratados con la sustancia tensioactiva en forma de liposomas uni o multilamelares y del grupo control, en términos generales presentaron una tendencia a alejarse de los valores normales después de la eliminación del agente tensioactivo endógeno, como puede observarse en la Figura 2.
En el estudio histológico se comprobó el desarrollo del síndrome de dificultad respiratoria en los cortes de los pulmones de los cobayos.

Figura 2. Efecto de los diferentes tratamientos que recibieron los grupos de cobayos con síndrome de dificultad respiratoria mostrando el pH y PaCO₂ arteriales. Cada grupo estuvo formado por por veinticinco cobayos adultos. Cada animal recibió por instilación 20 mg/mL de agente tensioactivo pulmonar de ternera organizado en la forma nativa (línea celeste), de liposoma multilamelar (línea verde) o unilamelar (línea roja). El grupo control no recibió tratamiento con agente tensioactivo pulmonar de ternera (línea negra) y solamente recibieron por instilación NaCl 0,15 M. Se presentan los valores de la media ± DE de cada grupo. El tiempo (min) representa el tiempo después de la remoción del agente tensioactivo alveolar nativo. Las flechas marcan los tiempos en que los cobayos recibieron las instilaciones de agente tensioactivo o de NaCL. Los valores normales de pH y PaCO₂ se representan por líneas punteadas.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Los objetivos de este trabajo fueron caracterizar la asociación molecular de los componentes del agente tensioactivo usado para el tratamiento del síndrome de membrana hialina y establecer el análisis funcional del mismo en un modelo animal. El agente tensioactivo en su forma nativa fue aislado de pulmones de ternera y fue analizado por calorimetría diferencial de barrido y por dispersión dinámica de luz y se comparó la organización molecular de los componentes del agente tensioactivo en su forma nativa y formando liposomas uni y multilamelares. Los resultados de la composición y la cantidad total de fosfolípidos, así como sus proporciones individuales, son consistentes con otros valores reportados para agentes tensioactivos obtenidos de otras fuentes animales (2-5)(10)(28).
Varias proteínas han sido descritas en agentes tensioactivos pulmonares con peso molecular de 5, 18, 26, 32 y 36 kDa. Floros (28) ha propuesto la existencia de varias isoformas de esas proteínas para explicar el amplio rango de pesos moleculares. Cuatro proteínas se han identificado; dos son hidrofílicas: SP-A y SP-D, y dos son hidrofóbicas: SP-B y SP-C (29)(30). SP-A es la más abundante y tiene un peso molecular entre 28 y 36 kDa (31). Posiblemente la proteína encontrada en este trabajo es una isoforma de SP-A, dado que el polipéptido de 49,3 kDa observado en los experimentos corresponde al 86,3% del total de proteína en el surfactante estudiado.
Los fosfolípidos pueden formar diferentes arreglos moleculares (12)(24)(31)(32). De interés particular para los materiales biológicos son los fosfolípidos que forman una bicapa, semejante a la que se encuentra en las membranas celulares, en la cual los lípidos se encuentran organizados en dos monocapas opuestas con sus cadenas hidrocarbonadas entre las monocapas (32). Las bicapas lipídicas forman de manera espontánea micro vesículas cerradas uni y multilamelares o liposomas. Así los liposomas son el arreglo preferido de los fosfolípidos; los liposomas uni y multilamelares fueron preparados a partir de agente tensioactivo de pulmón de ternera. El arreglo molecular de las proteínas y los fosfolípidos en estos liposomas derivados del agente tensioactivo fue comparado con el arreglo molecular del agente tensioactivo nativo aislado de pulmones de ternera.
Cuando la temperatura se incrementa los liposomas pueden sufrir transiciones entre el estado sólido-gel y líquido-cristalino. En esas transiciones ocurre una gran cooperación en el punto de fusión entre las cadenas hidrocarbonadas, lo cual se refleja en las formas de los termogramas con temperaturas de transición características (15).
La temperatura de transición y otros parámetros se reflejan en la forma y ancho de los termogramas, los cuales son profundamente afectados por la pureza de las fases lipídicas (17). Esto puede explicar las temperaturas de transición mayores de los liposomas uni o multilamelares derivados del agente tensioactivo pulmonar de ternera nativo (116,9±9,7 °C y 100,2±3,4 °C, respectivamente) al compararlas con las temperaturas de transición bajas de los liposomas uni y multilamelares hechos solamente de dipalmitoílfosfatidilcolina (37 °C y 41,5 °C, respectivamente). Las mayores temperaturas de transición observadas se debieron a la presencia de proteínas y a los diferentes tipos de fosfolípidos y al colesterol en los liposomas formados a partir del agente tensioactivo pulmonar de ternera nativo; además, los termogramas también indican que hay una interacción fuerte entre esos fosfolípidos y las proteínas. En consecuencia, interacciones fuertes entre fosfolípidos y proteínas afectan el punto de fusión de las cadenas hidrocarbonadas de los fosfolípidos; las temperaturas de transición de los liposomas son mayores en presencia de proteínas, como fue confirmado por la temperatura de transición (53,9±1,2 °C) de liposomas formados solamente con la fracción lipídica del agente tensioactivo, evitando la proteína, la cual fue más cercana a la temperatura de transición de los liposomas que solamente contenían dipalmitoílfosfatidilcolina.
En este trabajo se encontró que el termograma del agente tensioactivo en la forma nativa fue muy diferente de los termogramas del agente tensioactivo en liposomas uni y multilamelares. La baja temperatura de transición (67,1±10,2 °C) del agente tensioactivo nativo fue un reflejo de las interacciones lípido-proteína, que fueron considerablemente disminuidas, al compararlas con las interacciones fuertes detectadas en los liposomas formados con agente tensioactivo. Además, la notable amplitud y asimetría del termograma (Fig. 1A) también reveló una reducción en las fuerzas cooperativas de los fosfolípidos en el estado de transición en el agente tensioactivo nativo debido a la presencia de proteínas y al arreglo molecular de los fosfolípidos que difiere del liposomal.
Sin embargo, el análisis de dispersión dinámica de la luz mostró coeficientes de difusión y valores de radio hidrodinámico similares para el agente tensioactivo pulmonar de ternera en su forma nativa o asociada en liposomas multilamelares. Se encontraron diferencias significativas en los pesos moleculares, lo cual puede indicar que el agente tensioactivo pulmonar de ternera adopta una forma diferente dependiendo de sus asociaciones moleculares.
Se ha sugerido que el agente tensioactivo en su forma nativa no tiene forma esférica, más bien es de forma fibrilar. Esto coincide con los resultados obtenidos del análisis calorimétrico y con los resultados de Gustafsson et al. (29) y Taneva y Keough (31), quienes describieron que una capa interfacial rica en fosfatidilconina es responsable de la propiedad de reducir la tensión superficial del agente tensioactivo. Pérez-Gil y Keough (32) y Wright (33) propusieron que la proteína SP-A forma trímeros que a su vez se asocian para formar octadecámeros (Fig. 3A). En este arreglo SP-A se une a los lípidos formando una estructura tipo enrejado. Con base en el análisis calorimétrico, se llegó a la conclusión que los lípidos que se unen a SP-A presentan probablemente un arreglo de mielina fibrilar (Fig. 3B) que es muy parecido a una estructura de tipo enrejado (Fig. 3C) y esta estructura es la que posiblemente se altera cuando se presenta daño pulmonar. Estos resultados concuerdan con los de Wright (33) y los de Amiya y col. (34).
La estructura tipo enrejado podría explicar por qué un ensamble con un peso molecular mayor que una forma liposomal tiene una velocidad de difusión cercana a la de los liposomas. Las interacciones entre lípidos y proteínas son lo suficientemente débiles como para permitir un rápido arreglo entre los octámeros, produciendo relativamente una rápida velocidad de difusión. La estructura tipo enrejado de los octámeros podría ser la razón por la cual se encontró un peso molecular de 24.680 kDa para el agente tensioactivo en la forma nativa. Si se considera una masa de 700 kDa para cada octadecámero (32), se puede suponer que la radiación fue dispersada por un complejo que contenía 35 de estas unidades octadecaméricas.
Es importante indicar que el procedimiento usado para formar liposomas, no produce desnaturalización de proteínas, como fue demostrado para DNAsa pancreática I, (35) citocromo C oxidasa y el canal de calcio mitocondrial (25). De acuerdo con el análisis anterior, los cambios calorimétricos y de dispersión dinámica de la luz observados en los liposomas son atribuibles a las interacciones fosfolípido-proteína y no a la desnaturalización de la proteína.
La eliminación del agente tensioactivo pulmonar endógeno de los cobayos generó el desarrollo de membrana hialina en el 73% de los animales estudiados. En estas condiciones, los valores arteriales iniciales de pH y presión parcial de CO₂ se afectaron (pH @ 7,47; PaCO₂ @ 26 mmHg). El agente tensioactivo en forma nativa fue el arreglo molecular más efectivo que permitió recuperar los niveles arteriales basales de pH y presión parcial de CO₂ (pH = 7,4±0,12; PaCO₂ = 34±0,7 mm Hg). Esta recuperación indica que el agente tensioactivo pulmonar de ternera en su forma nativa, como fue aislado en este estudio, fue efectivo en la reducción de la tensión alveolar superficial y mejoró la ventilación en los animales en los que se había inducido el síndrome de dificultad respiratoria; en tanto el agente tensioactivo administrado como liposomas uni o multilamelares no fue capaz de mejorar el deterioro en la presión parcial de CO₂, ni en el pH arterial en este estudio.
Los estudios de calorimetría y de dispersión dinámica de la luz revelaron que la organización molecular que confiere funciones fisiológicas al agente tensioactivo pulmonar de ternera nativo, es similar a la de los cuerpos lamelares extendidos de superficie activa y a la mielina tubular, la cual ha sido descrita como el revestimiento de las cavidades alveolares pulmonares (36)(37). Estas estructuras extendidas del agente tensioactivo pulmonar pueden ser absorbidas en la interfase aire-agua, donde forman una película estable que presenta propiedades antiatelectásicas y antiedematosas durante el proceso de respiración. Esto puede explicar por qué la aplicación del agente tensioactivo nativo restableció la función respiratoria normal en los cobayos afectados con el síndrome de dificultad respiratoria.
También es importante enfatizar que la versión modificada del protocolo de Bligh y Dyer (11) que se usó para aislar el agente tensioactivo pulmonar de ternera nativo, minimiza el número de pasos en los cuales el agente tensioactivo pulmonar de ternera es manipulado. De lo anterior se concluye que reducir la manipulación de las preparaciones de surfactante permite obtener una forma fisiológicamente activa de agente tensioactivo, más cercana a la descrita en las cavidades alveolares (36-38).

Figura 3. Representación de SP-A en una estructura octadecamérica y su probable asociación con fosfolípidos. A) Propuesta octadecamérica para SP-A, de Wright (33). B) Adaptación de Pérez-Gil y Keough (32) para un modelo de trímeros de SP-A y fosfolípidos. C) Las asociaciones octadecaméricas de SP-A y fosfolípidos podrían interactuar para formar posteriores asociaciones en las cuales se podrían formar estructuras tipo enrejado del agente tensioactivo pulmonar de ternera. Cada triángulo representa una unidad octadecamérica. Los fosfolípidos conectados a los trímeros de SP-A no se representan para claridad.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado parcialmente por el Instituto Politécnico Nacional (CGPI20030157 a MIB y CGPI20030187). Los autores agradecen al Dr. Manuel Soriano de la Universidad Nacional Autónoma de México (México), por permitir el uso del DynaPro-801TC Molecular Sizing Instrument, reconocen el apoyo del Dr. Guillermo López y de la Dra. Consuelo Ortiz del Hospital Universitario y de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Puebla (México), respectivamente, y del Dr. Miguel Cervantes, por la lectura crítica del documento.

Correspondencia

DRA. MARÍA DEL LURDEZ CONSUELO MARTÍNEZ MONTAÑO
Río Verde 5721, Col. San Manuel 72570, Puebla, Pue., México
Teléfono: 52(22) 245 3414.
Fax: 55(22) 229 5648
E-mail: lumarmon@yahoo.com

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Aceptado para su publicación el 13 de abril de 2007