BIOQUÍMICA CLÍNICA

 

Estabilidad de muestras conservadas en tubo primario: un estudio de 25 analitos de química clínica*

Stability of specimens stored in primary tube: a study on 25 analytes of clinical chemistry

Mirta Beatriz Caracciolo¹, Sandra Daniela Muzietti², Marcela Susana Pandolfo², Gustavo Alberto Negri³, Daniel Nicolás Bustos⁴

1. Bioquímica. Especialista en Bacteriología Clínica.
2. Bioquímica.
3. Dr. en Bioquímica Clínica.
4. Dr. de la Universidad de Buenos Aires.

* Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Hospital de Clínicas José de San Martín. Departamento de Bioquímica Clínica. Área Gestión de la Calidad. Av. Córdoba 2351 1er Piso. 1120 Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

Resumen

Se estudió la estabilidad de veinticinco analitos conservados durante siete días en dos tipos de tubos primarios: tubos de polimetilmetaacrilato (PMMA) con gránulos y tubos con gel separador, ambos con acelerador de la coagulación. El objetivo fue determinar en qué tubo los analitos tenían mayor estabilidad y como consecuencia, cuánto tiempo podían conservarse las muestras en ambos tubos. Las muestras fueron conservadas en el tubo primario a 4-8 °C y se analizaron por duplicado diariamente durante siete días. La estabilidad de los analitos se determinó comparando los resultados de los siete días con los valores obtenidos el primer día y los límites de aceptabilidad derivaron del coeficiente de variación (CV) de cada determinación, de la variabilidad biológica (VB) intraindividual y de un análisis multivariado de varianza MANOVA. Los promedios de aldolasa, fósforo, glucosa, lactatodehidrogenasa, potasio y sodio cuando la muestra se conservó con gránulos, tuvieron diferencias estadísticamente significativas al compararlos con los promedios de los mismos analitos conservados en gel; resultados similares se obtuvieron cuando se tomó como límite de aceptabilidad el CV y la VB intraindividual. Cada laboratorio debería establecer la estabilidad de sus analitos según el tubo primario utilizado, con el objetivo de responder a no conformidades que requieran el procesamiento de analitos sobre muestras previamente extraídas en el caso de que éstas se conserven en tubo primario.

Palabras clave: Estabilidad de analitos; Gestión en el laboratorio clínico; Manejo y procesamiento de muestras

Summary

The stability of 25 analytes during a seven-day storage in two different kinds of tubes was studied. PMMA (polimetilmetaacrilate) tubes contain a clotting activator (glass particles) and the other tubes contain a gel barrier. The aim was to determine the analytes' stability in both kinds of tubes and, as a consequence, to determine the optimal time for storage of the samples in the primary tube. The specimens were maintained at 4-8 °C and analyzed in duplicate during seven days. The analytes' stability was determined by comparing the results obtained each day with those obtained on the first day. The significant change limits were based on the determination of the variation coefficient, on the biological variation and on statistically significant changes using a MANOVA test. Mean values of aldolasa, phosphate, glucose, lactic dehydrogenase, potassium and sodium stored in tubes with a clotting activator had statistical differences in comparison with the mean values of the same analytes stored with a gel barrier. Each laboratory should investigate the specific analytes' stability according to the collection device used.

Key words: Analytes' stability; Clinical laboratory management; Specimen's handling and processing

INTRODUCCIÓN

La gestión de no conformidades es de gran importancia en un sistema de gestión de la calidad porque permite registrar los eventos que impiden o alteran el cumplimiento de sus procesos o procedimientos adoptando las medidas necesarias para prevenirlos y/o corregirlos (1).
En relación a los resultados de los análisis de laboratorio pueden surgir no conformidades como consecuencia de una discordancia entre el diagnóstico presuntivo y los resultados informados o debido a diferentes errores que pueden existir en los procesos y que provoquen la falta de procesamiento de algún analito, o errores de transcripción en relación a la solicitud de prácticas que lleven al laboratorio a cambiar el procesamiento de un analito por otro (2).
Con el objetivo de responder a estas no conformidades es conveniente conservar las muestras de sangre en tubos primarios. Sin embargo, la estabilidad de los analitos dependerá del sistema de recolección de muestra utilizado.
Existen en el mercado distintos tipos de tubos primarios. Los más habituales son:
a) Tubos de polimetilmetaacrilato y tubos al vacío con gránulos que permiten acelerar el proceso de coagulación, donde la principal desventaja es que el suero permanece en contacto con el coágulo.
b) Tubos con gel separador (mezcla de siliconas y aceites vegetales) el cual produce un tapón biológico que separa la muestra en tres capas; suero-gel-coágulo. La ventaja fundamental consiste en separar la muestra sin contaminación del coágulo.
Cuando una muestra de sangre es centrifugada y el suero queda en contacto con las células sanguíneas durante varios días se pueden producir cambios importantes en las magnitudes medidas de diversos analitos, inclusive si las muestras se guardan refrigeradas. Lo ideal es separar el suero lo más rápido posible para prevenir el efecto del metabolismo celular y el movimiento de analitos entre éste y los compartimentos celulares (3)(4). Los tubos con gel separador son una buena solución para evitar el contacto prolongado (5). Sin embargo, en este país, por razones de costo se siguen utilizando tubos con gránulos.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar la conservación de las muestras sanguíneas en tubos primarios analizando la estabilidad de diferentes analitos en dos tipos de tubos: PMMA con gránulos y tubos con gel.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron 10 muestras de sangre de individuos que concurrieron al Laboratorio Central del Hospital de Clínicas José de San Martín durante septiembre de 2005, rango de edad entre 25 y 63 años (5 hombres y 5 mujeres). Las muestras fueron separadas de la identificación del paciente y rotuladas por orden de llegada desde el número 1 al 10 con el objetivo de realizar el presente trabajo.
Se estudió la estabilidad de 25 analitos durante 7 días.
Las muestras de sangre se recolectaron en dos tipos de tubos: PMMA y con gel separador, ambos de la marca KIMA con acelerador de la coagulación. Las muestras fueron centrifugadas dentro de los 30 minutos posteriores a la extracción, a 3.500 rpm durante 10 min en el primer caso y durante 30 min en el segundo; las mismas no presentaban hemólisis. Los analitos fueron procesados por duplicado y su medición se realizó inmediatamente en un analizador Hitachi 917 a 37 °C. Luego fueron conservadas entre 4-8 °C y se analizaron diariamente por duplicado durante 7 días procesando las muestras entre las 9 y 10 h.
Se analizaron los siguientes metabolitos: glucosa (Glu), urea (U), creatinina (Creat), ácido úrico (AU), colesterol (Col), triglicéridos (Tri), sodio (Na), potasio (K), cloro (Cl), calcio (Ca), fósforo (P), magnesio (Mg), proteínas totales (Pt), albúmina (Alb), hierro (Fe) y bilirrubina total (BT); y las siguientes enzimas: alanino amino transferasa EC 2.6.1.2 (ALAT), aspartato amino transferasa EC 2.6.1.1 (ASAT), fosfatasa alcalina EC 3.1.3.1 (FAL), gammaglutamil transpeptidasa EC 2.3.2.2 (gGT), lactatodeshidrogenasa EC 1.1.1.27 (LDH), creatinfosfoquinasa EC 2.7.3.2 (CK), amilasa EC 3.2.1.1 (AMI), aldolasa EC 4.1.1.13 (ALD) y lipasa EC 3.1.1.3 (LIP).
La estabilidad de los analitos se determinó calculando el promedio de los datos obtenidos por duplicado y comparando la media de los resultados de los 7 días con la media de los valores obtenidos el primer día. En el presente trabajo, los límites de aceptabilidad derivaron de: a) el coeficiente de variación (CV) del analito multiplicado por 1,96 para abarcar el 95,5% de los resultados en una curva de distribución gaussiana (rango analítico); b) de la variabilididad biológica (VB) intraindividual (rango biológico) y c) del análisis multivariado de varianza MANOVA con un número de observaciones para cada analito de 140 y con un nivel de significación menor a 0,05 (p<0,05).
Los cambios fueron considerados significativos si la media de los resultados de cada día superaba el rango del límite de aceptabilidad.

RESULTADOS

Los analitos donde no se observaron diferencias estadísticamente significativas en ambos tubos a lo largo de los 7 días fueron U, AU, Col, Tri, Cl, Fe, BT, ALAT, gGT, CK, AMI y LIP.
En los analitos ASAT, FAL, Creat, Ca, Mg, Pt y Alb no se observaron diferencias estadísticamente significativas en los tubos conservados en gel durante los 7 días mientras que sí lo fueron en el 5° y 6° día cuando las muestras fueron conservadas en tubos con gránulos.
Los promedios de valores de ALD, P, Glu, LDH, Na y K provenientes de muestras conservadas en gránulos tuvieron diferencias estadísticamente significativas cuando se los comparó con los conservados en gel, y estos promedios excedieron rangos de aceptabilidad basados en VB y VA. En las Tablas I y II se muestra el tiempo de conservación óptimo para cada analito, según el tubo utilizado en la experiencia realizada durante 7 días.
En la Figura 1 se muestra la curva de variación de la gGT a modo de ejemplo de los analitos en donde el comportamiento en gránulo o en gel no es estadísticamente significativo. En el caso de Glu, Na, K, LDH, P y ALD, la curva de variación difiere según se conserve en gránulo o gel.

Tabla I. Conservación de los metabolitos.

Tabla II. Conservación de las enzimas.

Fig.1. Estabilidad del analito en función del tiempo.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

En el presente trabajo se evaluó la conservación de la muestra en dos tipos de tubos primarios teniendo en cuenta la estabilidad de los analitos a lo largo de siete días. Según la definición propuesta por Guder, la estabilidad de la muestra es la capacidad de la misma de mantener los valores de sus propiedades biológicas dentro de límites preestablecidos bajo condiciones específicas (6).
Trabajos previos han utilizado la variación analítica de la medición para determinar los límites de aceptabilidad, tales como 2 ó 3 DE (desviación estándar) o su expresión porcentual mediante uso del coeficiente de variación (CV) (4). En este trabajo se aplicó como límites de aceptabilidad los criterios de VB en forma comparativa con la medición de la variabilidad analítica (CV).
Los valores obtenidos en forma periódica de un mismo individuo sano para un mismo analito utilizando el mismo sistema de medición, así como para individuos diferentes, arrojan resultados distintos dentro de un cierto rango, es decir se obtendrán resultados semejantes pero no idénticos para una misma técnica de medición debido a la variabilidad biológica del analito medido (7)(8). La variabilidad biológica es la fluctuación del valor de un analito alrededor de un punto homeostático. Los valores de VB han sido propuestos como especificaciones de calidad analítica y están directamente relacionados con la utilidad clínica de la prueba (9). En este sentido, las recomendaciones internacionales sugieren que el CV debe ser siempre menor que la VB del analito que se está midiendo; si esta premisa se cumple, el límite del CV será siempre más estricto que el de VB (10). Los CV obtenidos en este laboratorio no fueron en todos los casos menores que la VB, sobre todo en aquellos analitos donde la VB es muy baja, como el sodio o el calcio. Por lo tanto, los límites tomados de la VB y el CV actuaron en forma independiente entre ellos y estuvieron en relación con cada analito medido. La aplicación de estos dos criterios y el análisis estadístico MANOVA permitió evaluar la estabilidad del analito. Los cambios fueron considerados significativos si la media de los resultados de cada día superaba el rango del límite de aceptabilidad.
Tomando como límite la VB del analito los resultados obtenidos muestran que U, AU, Col, Tri, Cl, Fe, BT, ALAT, gGT, CK, AMI y LIP pueden conservarse siete días a 4-8 °C, independientemente del tubo primario utilizado en este trabajo. Si bien, en el caso de U, Tri, Cl, Fe, ALAT, CK y LIP se observó que superaron el límite analítico previamente establecido dentro de los 7 días, no superaron el límite biológico establecido por la VB intraindividual lo que sugiere que estas diferencias no tienen significancia clínica.
Se observa que los analitos menos estables en ambos tubos fueron: Glu, P, Na, K, LDH y ALD. En el caso de ALD los límites de aceptabilidad derivaron del CV y del estudio estadístico MANOVA dado que no hay bibliografía correspondiente a la VB.
La concentración de Glu disminuye en los tubos con gránulos debido al contacto prolongado del suero con el coágulo. Está bien documentado que la glucólisis de las células consume glucosa y causa una disminución de la concentración de glucosa en sangre durante el transporte y que la velocidad de disminución es sensible a la temperatura. La pérdida de glucosa en una muestra de sangre debida a la glucólisis (por parte de los hematíes y leucocitos), oscila entre 5 y 10 mg/100 mL/hora a temperatura ambiente, y de 10 a 20 mg/100 mL/hora a 37 °C, lo que permite explicar la menor estabilidad observada en este analito (11).
El aumento de la concentración de P a lo largo de los siete días coincide con las observaciones de otros autores que usaron suero en contacto prolongado con las células (12). Los fosfatos orgánicos son susceptibles a la hidrólisis y producen fósforo inorgánico, el cual es liberado del eritrocito y consecuentemente aumenta su concentración en suero (13).
El aumento de la concentración de K, después del primer día, puede ser explicado por una falla en la regulación de la Na+-K+-ATPasa que no mantiene el gradiente intracelular, resultando en un aumento del K plasmático por liberación de los eritrocitos y otras células (14) y la variación en la concentración de Na puede atribuirse a la inhibición de la glucólisis y a la falta de regulación de la Na+-K+-ATPasa (15).
El aumento de la actividad de LDH al cabo del tercer día en los tubos con gránulos puede deberse a cambios en la integridad de la membrana celular liberando al espacio extracelular las isoenzimas 1 (eritrocitaria) y 3 (plaquetaria) (16).
Con respecto a la ALD, su aumento al cabo del segundo día en los tubos con gránulos puede deberse a la liberación de la enzima proveniente de las plaquetas (17).
Al analizar los resultados obtenidos se observa que todos los analitos son más estables conservados en los tubos con gel que en los tubos con gránulos. Sin embargo, hay que considerar que el gel actúa como barrera por un tiempo limitado, ya que tiene una viscosidad controlada y una gravedad específica entre el suero y el coágulo.
Debido a que cada laboratorio utiliza diferentes marcas comerciales de tubos primarios es difícil que los resultados obtenidos en este trabajo puedan ser aplicables a todas las marcas de tubos, que pueden ser diferentes en cuanto a la composición de la pared, de los gránulos o del gel utilizado.
De acuerdo con estas consideraciones es conveniente que cada laboratorio estudie la estabilidad de sus analitos según el tubo primario utilizado y establezca el tiempo óptimo de conservación de las muestras.

Agradecimiento

Los autores agradecen al Dr. Vicente C. Castiglia de la Sección de Asesoría Científica del Hospital de Clínicas "José de San Martín" por el aporte realizado a este trabajo.

Correspondencia

DRA. MIRTA B. CARACCIOLO
Universidad de Buenos Aires
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Hospital de Clínicas "José de San Martín"
Av. Córdoba 2351, 1er. Piso
CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES
E-mail: mbcaracciolo@ffyb.uba.ar

Referencias bibliográficas

1. Organización Panamericana de la Salud. Documentos técnicos. Política y Regulación. THS/EV-2005/008. Curso de Gestión de no conformidades. Washington D.C, 2005.
2. NCCLS. Aplication of Quality Management System Model for Laboratory Services; Approved Guideline-Third Edition. NCCLS document GP26-A3. Pennsylvania 19087 USA, 2004.
3. Zhang DJ, Elswick RK, Greg Miller W, Bailey. Effect of serum-clot contact time on clinical chemistry laboratory results. Clin Chem 1998; 44 (6): 1325-33.
4. Bobby l, Boyanton Jr, Blick KE. Stability studies of twenty-four analytes in human plasma and serum. Clin Chem 2002; 48 (12): 2242-7.
5. Ramayo Barrio E, Recio Quijano F, Torres Pérez LM, Benitez Jiménez S. Ausencia de estabilidad en algunos analitos en plasma heparinizado. VIII Reunión de la Sociedad Andaluza de Análisis Clínicos. Huelva 2001. Disponible en: http://w.w.w.sanac.org/sanac2/ viiicongreso/titulos.pdf [fecha de acceso 6 de diciembre de 2006].
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8. Gonzalez de la Presa B. Incertidumbre asociada a los resultados obtenidos con ciertos procedimientos de medida bioquímico-clínicos. Barcelona: Universidad Autónoma de Barcelona (Facultad de Medicina); 2002.
9. Westgard JO. Base de datos de variabilidad biológica. 2006. Disponible en http://www.westgard.com. [Fecha de acceso: 18 de mayo de 2006].
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Aceptado para su publicación el 20 de abril de 2007