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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. v.41 n.3 La Plata jul./sep. 2007

 

MICROBIOLOGÍA

 

Actividad antimicrobiana de plantas medicinales argentinas sobre bacterias antibiótico-resistentes

Antimicrobial activity of Argentine medicinal plants on antibiotic-resistant bacteria

Iris Catiana Zampini1*, Norma Cudmani2**, María Inés Isla3*

1. Farmacéutica, estudiante de doctorado de la Universidad Nacional de Tucumán. Becaria del CONICET. Auxiliar Docente de 1a Categoría.
2. Bioquímica. Bacterióloga
3. Doctora en Bioquímica. Investigador del CONICET. Profesora Asociada.

* Cátedra de Fitoquímica. Instituto de Estudios Vegetales "Dr. Antonio R. Sampietro". Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Universidad Nacional de Tucumán.
** Hospital de Clínicas "Dr. Nicolás Avellaneda". San Miguel de Tucumán - Tucumán. Argentina.

Resumen

El propósito del presente trabajo fue determinar la potencia antimicrobiana de extractos alcohólicos de plantas utilizadas popularmente en Argentina como antisépticos y antiinflamatorios: Dasyphyllum diaconthoides, Erythrina cristagalli, Larrea cuneifolia, Larrea divaricata, Phytolacca dioica, Pithecoctenium cynanchoides, Prosopanche americana, Schinus molle, Schkuhria pinnata, Senna aphylla y Solidago chilensis. La inhibición del crecimiento bacteriano se determinó a través de ensayos de difusión en agar, macrodilución en medio sólido y microdilución en medio líquido frente a 47 aislamientos clínicos multirresistentes a antibióticos, obtenidos de pacientes de un hospital de Tucumán, Argentina: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Morganella morganii, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia. De acuerdo con los valores de concentración inhibitoria mínima (CIM), tres de las once especies ensayadas fueron las más activas: L. divaricata, L. cuneifolia, y S. aphylla (CIM de 25 a 200 µg/mL). P. mirabilis, A. baumanni y S. maltophilia fueron las cepas más susceptibles con valores de CIM entre 25 y 50 µg/mL seguido por P. aeruginosa con valores de CIM de 50 a 100 µg/mL. Los valores de concentración bactericida mínima (CBM) fueron semejantes o dos veces superiores a los valores de CIM. Mediante ensayos bioautográficos se comprobó que los extractos más activos presentaban al menos dos principios antimicrobianos. Análisis fitoquímicos indican que estos compuestos son de naturaleza fenólica. Los resultados obtenidos justificarían el uso de estos extractos para el tratamiento de infecciones bacterianas, especialmente aquellas de origen dérmico.

Palabras clave: Plantas medicinales argentinas; Actividad antimicrobiana; Bacterias gram negativas multirresistentes a antibióticos; Compuestos fenólicos

Summary

The present study was conducted to investigate antimicrobial activity of alcoholic extracts of Argentine medicinal plant species (Dasyphyllum diacanthoides, Erythrina cristagalli, Larrea cuneifolia, Larrea divaricata, Phytolacca dioica, Pithecoctenium cynanchoides, Prosopanche americana, Schinus molle, Schkuhria pinnata, Senna aphylla and Solidago chilensis) against multidrug resistant human pathogen gram negative bacteria isolated from a Hospital in Tucumán, Argentina. Inhibition of bacterial growth was investigated using disc diffusion, agar macrodilution and broth microdilution methods against multiresistant clinical isolates of nine different specie of gram negative bacteria: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Morganella morganii, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia. A significant antimicrobial activity was found in three of the eleven plant species studied. Based on minimal inhibitory concentration (MIC) values, three plant species, L. divaricata, L. cuneifolia, and S. aphylla were the most potent ones with MIC values between 25-200 µg/mL. Overall, P. mirabilis, M. morganii and P. aeruginosa isolates were the most susceptible to these extracts with MIC values of 25 to 50 µg/mL. All extracts showed significant inhibitory activities on bacteria growth in a dose phenolic compound-dependent fashion. The minimal bactericidal concentration (MBC) values were identical to the MIC values or twofold higher than the corresponding MIC. Contact bioautography indicated that crude extracts possess several major antibacterial components. Phytochemical screening showed that the bioactive compounds correspond to polyphenols. Investigations are in progress to purify the bioactive principles.

Keywords: Argentine medicinal plants; Antimicrobial activity; Antibiotic-multiresistant gram negative bacteria; Phenolic compounds

INTRODUCCIÓN

Los principales problemas de resistencia detectados en América latina lo producen las bacterias gram negativas, principalmente los bacilos no fermentadores como Pseudomonas sp. y Acinetobacter sp.(resistencia a carbapenem), Escherichia sp. y Klebsiella sp.(altas tasas de resistencia a b-lactámicos y con producción de b-lactamasa de espectro extendido), Enterobacter sp. y otras enterobacterias como Serratia sp. y Citrobacter sp. (productoras de b-lactamasas cromosómicas inducibles). Es importante resaltar que los grados de resistencia pueden variar mucho de un hospital a otro, de ciudad a ciudad y de una nación a otra. Las realidades pueden ser completamente diferentes, de allí, la importancia de regionalizar los estudios, analizando los efectos de potenciales antibióticos sobre patógenos aislados localmente. Las infecciones intrahospitalarias más graves en Argentina son producidas por: bacilos gram negativos no fermentadores, enterobacterias multirresistentes y cocos gram positivos con sensibilidad disminuida a b-lactámicos y/o glucopéptidos (1). En general, la multirresistencia se ha desarrollado debido al uso indiscriminado de antibióticos comerciales comúnmente utilizados para tratar las enfermedades infecciosas. Esta situación, así como la aparición de efectos indeseables de ciertos antibióticos, ha llevado a los científicos a investigar nuevas sustancias antimicrobianas a partir de plantas consideradas popularmente medicinales. Los ensayos realizados hasta este momento revelan que las plantas representan una potencial fuente de nuevos agentes antimicrobianos (2-13). Las plantas examinadas en este trabajo son utilizadas popularmente en Argentina como antisépticos, antiinflamatorios y cicatrizantes (14-16).
El propósito del presente trabajo fue investigar la actividad antimicrobiana de plantas utilizadas como medicinales en el norte argentino sobre microorganismos multirresistentes a antibióticos, obtenidos de aislamientos clínicos de un hospital de Tucumán.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal
Las especies vegetales seleccionadas para este trabajo fueron: Schinus molle L.(IEV 1036), Senna aphylla Cav. (IEV 1021), Erythrina cristagalli L.(IEV 1028); Dasyphyllum diaconthoides Less (IEV 1024), Phytolacca dioica (L) Moq. (IEV 1022), Prosopanche americana (R.Br.) Baillon. (IEV 1044) que se recolectaron de la zona de Trancas, Tucumán a 700 metros sobre el nivel del mar (msnm), mientras que Larrea cuneifolia Cav. (IEV 1023), Larrea divaricata Cav. (IEV 1032), Pithecoctenium cynanchoides D.C.(IEV 1037), Schkuhria pinnata Lam.(IEV 1041), Solidago chilensis Meyer (IEV 1010) se recolectaron en Amaicha del Valle, Tucumán a 2.400 m.s.n.m. Fueron identificadas por personal especializado y los ejemplares herborizados se encuentran en el Instituto de Estudios Vegetales (IEV) de la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia de la Universidad Nacional de Tucumán. Se utilizaron las partes aéreas de estas plantas.

Preparación de preparados fitoterápicos
La droga seca y finamente dividida (1 g) se maceró en 5 mL de alcohol 96° a temperatura ambiente (18 a 24 °C) durante 7 días, con agitación (40 ciclos/min). Se filtró y se conservó a 4 °C hasta su uso (17).

Determinación del contenido de compuestos fenólicos totales y flavonoides totales
El contenido de compuestos fenólicos totales se determinó por el método de Folin-Ciocalteau (18). Los resultados se expresaron como equivalentes de cumarinas.
El contenido de flavonoides totales se determinó espectrofotométricamente a 420 nm utilizando el método de Woisky y Salatino (19). Los resultados se expresaron como equivalentes de quercetina.

Análisis fitoquímico
Los componentes de los diferentes extractos fueron separados por cromatografía en capa fina (CCF) en Silica gel 60 F-254 (0,2 mm, Merck). Se utilizó como solvente de corrida cloroformo: metanol (9:1). Se sembraron 20 µg de compuestos fenólicos de cada uno de los extractos.
Los componentes separados se visualizaron bajo luz ultravioleta (254 y 365 nm, Lámpara UV Modelo UV 5L-58 Mineralight Lamp) y se revelaron con tricloruro férrico 1%, reactivo de productos naturales (1% 2-aminoetil difenilborato, NP) (20) o cloruro de aluminio para compuestos fenólicos, hidróxido de potasio para cumarinas, reactivo de Dragendorff para alcaloides y anisaldehído/ácido sulfúrico para esteroides y terpenos (21).

Microorganismos y medios de cultivo
Todas las cepas bacterianas se obtuvieron de aislamientos de pacientes del Hospital de Clínicas "Dr. Nicolás Avellaneda", San Miguel de Tucumán, (Tucumán, Argentina) durante 1999, a saber: Escherichia coli (n=12), Klebsiella pneumoniae (n=7), Proteus mirabilis (n=6), Enterobacter cloacae (n=9), Serratia marcescens (n=2), Morganella morganii (n=2), Acinetobacter baumannii (n=2), Pseudomonas aeruginosa (n=4), Stenotrophomonas maltophilia (n=3). Se incluyeron en este estudio las siguientes cepas de referencia: Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Identificación, tipificación y conservación de las cepas bacterianas aisladas
La identificación y tipificación de las cepas bacterianas aisladas se realizaron conforme a perfiles bioquímicos y a las recomendaciones del Manual de Microbiología Clínica (22). Todos los aislamientos fueron mantenidos en BHI (infusión cerebro corazón) que contenía 30% (v/v) de glicerol y 0,6% de agar a -20 °C.
Las colonias aisladas se resuspendieron en caldo Müller Hinton adicionado de cationes divalentes (CAMHB). La turbidez de la suspensión se ajustó a 0,5 de la escala de Mc Farland. Para llegar al inóculo adecuado, en cada caso se empleó como diluyente CAMHB. El número de colonias en CAMHB se estimó usando la técnica de dilución seriada de acuerdo a recomendaciones del CLSI 2006 (Clinical Laboratory Standards Institute) (23).

Susceptibilidad bacteriana evaluada por el método de difusión en agar
Tres mL de medio BHI que contenía 0,6% de agar se inocularon con 30 µL de cada suspensión bacteriana (105 bacterias/mL). Se distribuyó sobre placas de Petri de 9 cm de diámetro con 10 mL de agar Müller Hinton (AMH). Se realizaron cuatro perforaciones con sacabocados de 5 mm de diámetro y se cargaron con cantidades crecientes de cada fitocomplejo (hasta 400 µg de compuestos fenólicos). Se realizaron controles con antibióticos comerciales: imipenem, meropenem, cefotaxima, ceftazidina, vancomicina, oxacilina, ampicilina, gentamicina, penicilina. Las placas se incubaron aeróbicamente a 35 °C durante 16-20 horas.
La actividad antibacteriana fue determinada como la media del diámetro de inhibición producido alrededor de cada perforación o disco. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado.

Ensayos bioautográficos
Se sembraron 20 µg de compuestos fenólicos de cada uno de los extractos en placas de Sílica gel 60 F-254 (0,2 mm, Merck). Se utilizó como fase móvil cloroformo: metanol, 9:1 v/v. Dos mililitros de infusión cerebro-corazón que contenía 0.6% de agar inoculado con 105 unidades formadoras de colonias/mL (UFC/mL), de Pseudomonas aeruginosa (F305) se dispersaron sobre la placa de sílica gel. Las placas se incubaron a 35 °C durante 16-20 h. Transcurrido este tiempo las placas se rociaron con una solución de MTT, 2,5 mg de 3-(4,5 dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil tetrazolio en 1 mL de tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7, que contenía NaCl 0,15 M. Se incubaron las placas a 35 °C durante 1 h en la oscuridad. Se evaluó la viabilidad celular mediante la reducción de la sal de tetrazolio en azul de formazán observándose áreas de inhibición del crecimiento bacteriano de color amarillo sobre un fondo azul (24).

Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida mínima (CBM) Método de macrodilución seriada en agar
Se realizaron diluciones en etanol 96° de cada extracto (volumen final de 1 mL). Se agregaron 9 mL de medio AMH llegando a una concentración final de 25 a 1.000 µg de compuestos fenólicos/mL. Se homogenizó la mezcla y se colocó en placas de Petri de 9 cm de diámetro. Cada placa fue inoculada con 2 µL de suspensión bacteriana (105 UFC) e incubada aeróbicamente durante 16-20 h a 35 °C. Se incluyó en cada tratamiento un control de crecimiento bacteriano y un control negativo de etanol 96°.
La concentración inhibitoria mínima (CIM) del desarrollo bacteriano se consideró como la mínima concentración de extracto, en equivalentes de compuestos fenólicos, necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano.
Se determinaron los valores de CIM para levofloxacina, piperacilina/tazobactam, imipenem, meropenem, ceftriaxona, cefotaxima, ceftazdina, cefuroxima, cefepima, amikacina y ampicilina/sulbactam para bacterias gram negativas. Cada tratamiento fue realizado por triplicado. Los agentes antimicrobianos fueron de Sigma Chemical (EE.UU.) y Laboratorio Britania S.A. (Argentina).

Método de microdilución seriada en medio líquido
Por el método de microdilución en medio líquido se determinaron los valores de CIM y CBM de los fitocomplejos en estudio contra los organismos de prueba, siguiendo recomendaciones del CLSI 2006 (Clinical Laboratory Standards Institute) (23).
Los extractos fueron transferidos a pocillos de policubetas estériles de modo de obtener una dilución seriada al doble (25 a 1.000 µg de compuestos fenólicos/mL). Cien µL de cada suspensión bacteriana (5.105 UFC) se colocaron en cada uno de los pocillos. Se realizaron controles de esterilidad, viabilidad bacteriana, controles positivos con los agentes antimicrobianos comerciales y controles negativos.
Las placas se incubaron aeróbicamente a 35 °C durante 16-20 h. Al término de la incubación, el crecimiento bacteriano fue evaluado espectrofotométricamente midiendo los valores de absorbancia a 625 nm mediante un lector de ELISA (BioRad).
La CIM se consideró como la menor concentración de extracto necesaria para inhibir el crecimiento a un nivel <0,05 a 625 nm (ningún crecimiento visible macroscópicamente).
Para determinar los valores de CBM se tomaron 10 µL de cada pocillo de la microplaca sin crecimiento visible y se transfirieron a placas que contenían 15 mL de MHA las que se incubaron 16-20 h a 35 °C.
La CBM se consideró como la menor concentración necesaria para producir la muerte del 99,9% de las bacterias.
Los valores de CIM fueron determinados para levofloxacina, piperacilina/tazobactan, imipenem, meropenem, ceftriaxona, cefotaxima, ceftazidima, cefuroxima, cefepima, amikacina y ampicilina/sulbactan frente a bacterias gram negativas.

Análisis estadístico
Los datos fueron analizados utilizando el programa estadístico SPSS 7.5 para Windows. Los resultados se expresaron como medias ± desviación estándar.

RESULTADOS

La Tabla I resume los datos etno-botánicos de las diez especies de plantas medicinales recolectadas en dos ambientes fitogeográficos de Tucumán. Estas especies, en general, son utilizadas popularmente como antisépticos y antiinflamatorios. Las especies vegetales fueron extraídas con etanol 96°. Los análisis fitoquímicos revelaron que estas especies presentan un elevado contenido de compuestos fenólicos, principalmente flavonoides, y no contienen alcaloides.

Tabla I. Usos populares de las plantas medicinales estudiadas.

Actividad antibacteriana
Se utilizaron bacterias gram negativas multirresistentes aisladas de muestras de líquido cefalorraquídeo, lavado broncoalveolar, herida de sitio quirúrgico, catéteres, sangre y orina de pacientes del Hospital de Clínicas "Dr. Nicolás Avellaneda", Tucumán, Argentina. Las cepas aisladas incluyen K. pneumoniae, cefotaxima resistente (CIM igual o mayor a 124 µg/mL);
E. cloacae, E. coli, S. marcescens, cefotaxima resistente (CIM igual o mayor a 64 µg/mL); P. aeruginosa y A. baumanii ceftazidima resistente (CIMs igual o mayor a 32 µg/mL). Imipenem y meropenem fueron efectivos frente a enterobacterias cefotaxima resistentes (más del 90% de los aislamientos fueron susceptibles). Por otro lado, meropenem (carbapenem) mostró una limitada actividad frente a cepas ceftazidima resistente (Tabla II). P. aeruginosa F 305 fueron resistentes a imipenen y sensible a meropenem.
A concentraciones de 400 µg/mL, L. divaricata, L. cuneifolia y S. aphylla mostraron actividad contra todas las cepas de bacterias gram negativas ensayadas mediante ensayos de difusión en agar. E. crista-galli, D. diacanthoides, P. dioica, P. cynanchoide, P. americana, S. molle, S. pinnata, y S. chilensis fueron activas contra algunas de las cepas ensayadas (Tabla III). Los diámetros de los halos de inhibición de los extractos más activos (L. divaricata, L. cuneifolia, P. cynanchoides, S. chilensis y S. aphylla) estuvieron en el rango de 1,5 a 2,5 cm. L. divaricata, L. cuneifolia y S. aphylla presentaron valores de CIM  200 µg/mL (Tabla IV). P. mirabilis, A. baumanni y S. maltophilia fueron las más susceptibles, con valores de CIM entre 25 y 50 µg/mL seguido por P. aeruginosa con valores de CIM de 50 a 100 µg/mL.
P. cynanchoides resultó activo contra todas las bacterias analizadas con valores de CIM de 400 µg/mL, excepto sobre K. pneumoniae, mientras que S. chilensis tuvo actividad contra todas las bacterias ensayadas (valores de CIM de 200 a 600 µg/mL) excepto sobre E. coli y S. marcescens. En todos los casos, los valores de CBM fueron similares o dos veces superiores a los valores de CIM.
Las bioautografías de contacto indicaron que los extractos totales de las tres especies más activas presentan al menos dos compuestos químicos con capacidad antibiótica. Las bandas de inhibición del crecimiento microbiano son coincidentes con los valores de Rf obtenidos en los ensayos fitoquímicos para los polifenoles (Fig. 1).

Tabla II. Caracterización de las cepas bacterianas utilizadas para realizar los ensayos.

Tabla III. Actividad antibacteriana de extractos de plantas medicinales argentinas
mediante método de difusión en agar.

Tabla IV. CIM (µg/mL). Efecto de extractos de plantas medicinales argentinas sobre el crecimiento de bacterias patógenas humanas aisladas de pacientes del Hospital de Clínicas "Dr. Nicolás Avellaneda" así como cepas de referencia.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

S. aphylla, L. divaricata y L. cuneifolia son especies ampliamente distribuidas en regiones áridas y semiáridas de la Argentina. Son utilizadas en medicina popular argentina como anti-inflamatorios, vulnerarios, antirreumáticos y emenagogos. En trabajos previos se ha demostrado que el extracto acuoso de Larrea divaricata tiene actividad antiproliferativa (25-27) y antimicrobiana sobre bacterias gram positivas (28). Por otro lado, extractos alcohólicos de L. cuneifolia, y L. divaricata presentan actividad antifúngica (29) y antibacteriana contra bacterias gram positivas (30). No existen antecedentes acerca de la composición química ni sobre las potencialidades medicinales de S. aphylla. Los resultados obtenidos en este trabajo revelan una marcada actividad sobre bacterias gram negativas multirresistentes. Aunque los valores de CIM son altos comparados a los antibióticos comerciales, los resultados obtenidos resultan interesantes ya que se ensayó el extracto total y no los compuestos puros (31).
Los efectos antimicrobianos obtenidos son altamente reproducibles y los compuestos químicos responsables parecen ser químicamente estables ya que el efecto se mantiene en el tiempo. Por otro lado, se demostró que 20 µg de compuestos fenólicos separados por TLC son suficientes para inhibir el crecimiento de P. aeruginosa y K. pneumoniae. Se están realizando investigaciones para purificar los principios activos.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Consejo de Investigación de la Universidad Nacional de Tucumán, Argentina (CIUNT), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, Argentina (CONICET) y Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT) por el financiamiento de este trabajo de investigación.

Correspondencia

Dra. María Inés Isla
Instituto de Estudios Vegetales.
Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia.
Universidad Nacional de Tucumán.
Ayacucho 471
4000 - SAN MIGUEL DE TUCUMÁN. ARGENTINA
E-mail: misla@tucbbs.com.ar

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Aceptado para su publicación el 18 de mayo de 2007