MICOLOGÍA

Comparación de las coloraciones de Giemsa y Grocott en el diagnóstico de la histoplasmosis

Comparison of Giemsa and Grocott stains in the diagnosis of histoplasmosis

Amadeo Javier Bava^1*, María Fernanda Zuiani^2**

1. Doctor en Medicina.
2. Bioquímica.

* Sección Parasitología. Hospital de Infecciosas "Francisco J. Muñiz". Uspallata 2272. Buenos Aires. Argentina.
** Cátedra de Micología y Parasitología. Facultad de Ciencias Exactas. Universidad Nacional de La Plata. Calle 1 y 47. La Plata. Argentina.

Resumen

El diagnóstico de histoplasmosis se realiza tradicionalmente mediante el reconocimiento de típicas levaduras intracelulares de Histoplasma capsulatum en preparaciones microscópicas teñidas con Giemsa. Se comparó la eficacia de una modificación rápida de la técnica de Grocott (MRG) y la tradicional de Giemsa para el diagnóstico de la histoplasmosis, a partir de la aplicación de ambas a 10 secreciones respiratorias, 8 escarificaciones de lesiones cutáneas y una biopsia ganglionar, pertenecientes todas a pacientes con sospecha clínica de esta micosis. En 15 de las 19 muestras no se encontraron diferencias significativas en la capacidad y rapidez para arribar al diagnóstico, mientras que en las 4 restantes, fueron reconocidas con la MRG estructuras que pasaron desapercibidas con la coloración de Giemsa. La modificación rápida permitió un reconocimiento más rápido del H. capsulatum en materiales donde este hongo se observó en escaso número y permitió además identificar con seguridad otros patógenos fúngicos diferentes de H. capsulatum, como Pneumocystis jiroveci, Paracoccidioides brasiliensis y Cryptococcus neoformans, difíciles de observar con la coloración de Giemsa. Se propone la técnica de Grocott o su modificación rápida para el diagnóstico de la histoplasmosis, especialmente cuando el empleo de la coloración de Giemsa da lugar a resultados negativos o dudosos.

Palabras clave: Coloración de Giemsa; Coloración de Grocott; Histoplasmosis; Diagnóstico micológico

Summary

The diagnosis of histoplasmosis is traditionally achieved by recognizing the typical intracellular yeasts of Histoplasma capsulatum, in smears stained with Giemsa stain. The usefulness of a rapid modification of Grocott and of traditional Giemsa stains for the diagnosis of histoplasmosis was compared applying both techniques in 10 respiratory secretions, 8 cutaneous lesions scrapings and 1 adenomegaly biopsy, all of them belonging to patients with clinically suspected histoplasmosis. In 15 out of the 19 evaluated samples, no significant differences were found in the ability or speed to reach the diagnosis with the applied techniques; while in the remaining 4 samples, structures that had not been observed with Giemsa stain were recognized with the rapid modification. The modification enabled quicker recognition of H. capsulatum than Giemsa stain in those clinical samples where the number of these fungal pathogens was scant. Additionally, the rapid modification also enabled the recognition of fungal pathogens other than H. capsulatum, as Pneumocystis jiroveci, Paracoccidioides brasiliensis and Cryptococcus neoformans, difficult to observe with the Giemsa stain. Use of Grocott technique or rapid modification stain is proposed for the diagnosis of histoplasmosis, when the result obtained with the Giemsa stain is doubtful or negative.

Keywords: Giemsa stain; Grocott stain; Histoplasmosis; Mycologic diagnosis

INTRODUCCIÓN

La histoplasmosis es una micosis sistémica endémica de la Pampa húmeda y aquella que se asocia en este medio con mayor frecuencia al SIDA (1). Habitualmente, el diagnóstico se realiza por la visualización microscópica de la fase levaduriforme de su agente causal, Histoplasma capsulatum, en preparaciones teñidas con Giemsa, su aislamiento por cultivo o la determinación de anticuerpos específicos en sangre (2)(3).
En las preparaciones microscópicas teñidas con Giemsa, las levaduras se observan en número variable dentro del citoplasma de las células fagocitarias, teñidas parcialmente, con una disposición denominada "en casquete" y rodeadas de un pequeño halo, erróneamente considerado una cápsula (3).
La coloración de Grocott (4), empleada de rutina para la búsqueda de hongos en cortes histopatológicos, no es usada en los laboratorios de diagnóstico micológico, debido a la necesidad de un elevado número de reactivos y al prolongado tiempo requerido para su realización.
Para obviar las dificultades antes mencionadas se han desarrollado modificaciones rápidas, las cuales, a pesar de su efectividad, no han ganado aceptación en los laboratorios de diagnóstico (5-7). En este laboratorio se emplea una modificación rápida (MRG), sencilla y adaptable sin dificultades a laboratorios de baja complejidad (8).
Para evaluar la efectividad de la coloración de Giemsa y una MRG en la visualización de H. capsulatum, se aplicaron ambas a preparaciones microscópicas de materiales provenientes de pacientes con diagnóstico clínico presuntivo de histoplasmosis.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se investigó mediante microscopía la presencia de H. capsulatum en 10 secreciones respiratorias obtenidas por lavado broncoalveolar (LBA), 8 raspados de lesiones cutáneas y un material obtenido por punción de un ganglio cervical. Los materiales pertenecían a pacientes con SIDA y diagnóstico clínico presuntivo de histoplasmosis, asistidos en diferentes Salas y Servicios del Hospital de Infecciosas "Francisco Javier Muñiz" de la ciudad de Buenos Aires.
En ellos, la sospecha clínica fue confirmada por la recuperación de H. capsulatum a partir de muestras de hemocultivos y/o su visualización microscópica en muestras obtenidas por escarificación o punción.
Los extendidos realizados con los materiales clínicos luego de centrifugarlo durante 5 min a 1.500 rpm. en el caso de las secreciones respiratorias obtenidas por LBA, fueron fijados a la llama del mechero o cubiertos con alcohol metílico durante 5 min previo a la realización de las tinciones de Grocott y Giemsa, respectivamente.
Se cubrieron las preparaciones con una solución según Giemsa (Merck) 1:10 en agua destilada durante 20 min, mientras que el procedimiento completo de la MRG, que empleó un tiempo similar, se describe con detalle en un trabajo anterior (8). Brevemente, este último consistió en cubrir la preparación con una solución acuosa de ácido crómico durante 10 min y luego del lavado con agua se procedió de igual forma, durante 1 min, con una solución acuosa de bisulfito de sodio al 1%. Tras un nuevo lavado se cubrió la preparación con la solución de metenamina-plata, la cual se calentó suavemente con la llama de un hisopo de algodón embebido en alcohol, hasta que el material fijado adquiriera color pardo oscuro.
Se procedió luego al secado de los extendidos al aire y a la observación al microscopio con 100, 400 y 1.000 aumentos por el mismo observador, en primer término el teñido con Giemsa y luego el teñido con la MRG.

RESULTADOS

En 15 (79%) de los materiales no hubo dificultad para detectar las levaduras de H. capsulatum con ambas coloraciones y llegar al diagnóstico a partir de hallazgos microscópicos habituales. En los 4 restantes (2 LBA, una escarificación cutánea y una punción ganglionar) hubo diferencias entre los hallazgos obtenidos con una y otra tinción.
Las diferencias observadas en los resultados obtenidos con la coloración de Giemsa y la MRG en la búsqueda de H. capsulatum en 4 de las 15 preparaciones microscópicas correspondientes a los materiales estudiados se resumen en la Tabla I.
En un LBA sólo la MRG reveló escasas levaduras de pequeño tamaño, ubicadas dentro de elementos celulares. Días después, en hemocultivos de este paciente realizados con la técnica de lisis-centrifugación, desarrolló H. capsulatum.
Otro LBA mostró con la MRG abundantes levaduras deterioradas, sólo teñidas a nivel de la pared y escasas levaduras teñidas totalmente. Estas fueron observadas posteriormente, tras una nueva revisión y con suma dificultad, con la coloración de Giemsa. La paciente se encontraba tratada con itraconazol desde tiempo atrás, lo que podría haber afectado la tinción de las levaduras. Idénticos hallazgos a los antes descriptos se obtuvieron con el material de punción ganglionar de un paciente que recibía tratamiento antifúngico sistémico.
Finalmente, en una escarificación de una lesión cutánea, tratada localmente con una crema que contenía corticoides, antibacterianos y antifúngicos, la MRG pero no la coloración de Giemsa, reveló formas "aberrantes" de H. capsulatum (levaduras de mayor tamaño, seudomicelios y formas netamente pleomorfas).

Tabla I. Diferencias observadas en los resultados obtenidos con la coloración de Giemsa y la modificación rápida de Grocott (MRG) en la búsqueda de H. capsulatum en 4 de las 15 preparaciones microscópicas correspondientes a los materiales estudiados.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos sugieren una mayor sensibilidad de la MRG respecto de la coloración de Giemsa para el diagnóstico de la histoplasmosis, la cual ha sido evidenciada por estudios anteriores, respecto de la técnica original de Grocott (9).
La fase levaduriforme de H. capsulatum se tiñó bien con la MRG, con una tonalidad variable, desde el pardo claro a negro, según el caso, y fue fácilmente reconocible sobre el fondo amarillento, aún con el menor aumento. Sin embargo, puede ser difícil para observadores poco entrenados, establecer su ubicación intracitoplasmástica, tarea que, por el contrario, es sencilla con la coloración de Giemsa (4).
La MRG resultó más efectiva para revelar la presencia de H. capsulatum en preparaciones de materiales pertenecientes a pacientes con tratamiento antifúngico sistémico, así como para evidenciar las formas "aberrantes" de H. capsulatum.
A diferencia de la coloración de Giemsa, la MRG permitió visualizar otros elementos fúngicos de valor diagnóstico: quistes de Pneumocystis jiroveci, levaduras de Paracoccidioides brasiliensis y Cryptococcus neoformans y filamentos de Aspergillus sp., eventualmente presentes en materiales respiratorios (8). En la neumocistosis, si bien la técnica de Giemsa evidencia los mayoritarios trofozoítos, posee una sensibilidad y especificidad menores a la de Grocott en el diagnóstico de esta enfermedad (9).
A pesar del número elevado de casos de histoplasmosis diagnosticados en el Hospital Muñiz, la mayoría se realiza mediante el aislamiento del agente causal en hemocultivos o su visualización en preparaciones microscópicas de material obtenido por escarificación de lesiones cutáneas o mucosas (10).
Los diagnósticos logrados en ellos a partir de materiales respiratorios son proporcionalmente escasos, teniendo en cuenta que los pulmones son el sitio de localización primaria, punto de partida de la diseminación sanguínea y que en muchos casos las imágenes radiológicas revelan el compromiso pulmonar.
Esto sugeriría un diagnóstico tardío, cuando la enfermedad se ha diseminado por vía sanguínea, localizado en múltiples tejidos y existen menores posibilidades de éxito terapéutico. El deterioro de estos pacientes se evidencia desde el punto de vista inmunológico por recuentos de linfocitos T CD4+ menores a 100 células/µL (11).
El empleo de la MRG mejoró las posibilidades de visualizar las levaduras de H. capsulatum y de otros patógenos fúngicos en los materiales investigados respecto de la coloración de Giemsa, sobre todo cuando estuvieron presentes en número escaso. Esto último ocurrió en secreciones respiratorias y en la biopsia ganglionar, mientras que en las escarificaciones de lesiones cutáneas, tal cual es común en los pacientes con SIDA, el número de levaduras fue elevado y la coloración de Giemsa fue muy efectiva.
Lamentablemente, no fue posible la comparación de ambas coloraciones en escarificaciones cutáneas de pacientes con histoplasmosis no asociada al SIDA, en las cuales la cantidad de levaduras debería ser significativamente menor.
Debe destacarse la asociación observada entre la falta de visualización óptima de las levaduras intracelulares con la técnica de Giemsa, pero no con la MRG, en los materiales de pacientes que al momento del diagnóstico habían recibido tratamiento antifúngico durante lapsos prolongados.
Por las razones antes mencionadas, y no obstante la utilidad y fácil disponibilidad de la coloración de Giemsa en la mayor parte de los laboratorios, los autores creen que la técnica de Grocott o su modificación rápida, debería emplearse en los laboratorios de Micología para la identificación H. capsulatum y eventualmente otros patógenos fúngicos, sobre todo cuando los resultados de la coloración de Giemsa son negativos o dudosos.

Correspondencia

DR. AMADEO JAVIER BAVA
Darregueyra 2470. 7° "C".
1425 CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES, Argentina
Tel.: 4773-6458
E-mail: javibava@biol.unlp.edu.ar

Referencias bibliográficas

1. Rippon JW. Histoplasmosis. Mexico DF: Interamericana, Mc Graw-Hill; 1990. p. 410-66.
2. Arechavala A, Robles AM, Negroni R, Bianchi M, Taborda A. Valor de los métodos directos e indirectos de diagnóstico en las micosis asociadas al SIDA. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1993; 35: 163-9.
3. Hendrickson DA, Krenz MD. Reagents and stains. En: A. Ballows, Hausler WJ, Herrman KL, Isenberg HD, Shadomy HJ. Manual of Clinical Microbiology. 5th Edition. Washington DC: ASM Press; 1992. p. 1289-314.
4. Grocott RG. A stain for fungi in tissue and smears. Am J Clin Pathol 1955; 25: 975-9.
5. Brinn NT. Rapid metallic histological staining using the microwave oven. J Histotechnol 1983; 6: 125-9.
6. Pintozzi RL. Modified Grocott's methenamine silver nitrate method for quick staining of Pneumocystis carinii. J Clin Pathol 1978; 31: 803-5.
7. Musto L, Flanigan M, Elbadawi A. Ten minute silver stain for Pneumocystis carinii and fungi in tissue sections. Arch Pathol Lab Med 1982; 106: 292-4.
8. Bava AJ. Coloración rápida para la identificación de quistes de Pneumocystis carinii en materiales respiratorios. Acta Bioquím Clín Latinoam 2003; 37: 189-92.
9. Procop GW, Hadad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, et al. Detection of Pneumocystis jiroveci in respiratory specimens by four staining methods. J Clin Microbiol 2004; 42: 3333-5.
10. Bava AJ. Histoplasmosis in the Muñiz Hospital of Buenos Aires. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1995; 37: 531-5.
11. Trombetta L, Bava AJ. Laboratorio clínico y micológico en pacientes con histoplasmosis y síndrome de inmunodeficiencia adquirida. Acta Bioquím Clín Latinoam 2005; 39: 471-6.         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]

Aceptado para su publicación el 11 de septiembre de 2006