HEMOSTASIA Y TROMBOSIS

Efecto del inhibidor lúpico o anti-factor VIII sobre la actividad del factor VIII-sustrato cromogénico*

Lupus anticoagulant or anti-factor VIII effect on factor VIII activity-chromogenic substrate

Alicia Noemí Blanco^1, Andrea Peirano², Silvia Grosso², María Angela Lazzari³

1. Doctora en Bioquímica.
2. Bioquímica.
3. Médica.

* Departamento de Hemostasia y Trombosis, Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex", Academia Nacional de Medicina, Pacheco de Melo 3081. 1425 Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

Resumen

El objetivo del trabajo fue analizar el efecto de inmunoglobulinas (IgG) purificadas con actividad anti-factor VIII neutralizante o inhibidor lúpico, sobre el factor VIII medido por sustrato cromogénico (factor VIII_SC), con el propósito de validar el método para detectar anti-factor VIII en presencia de inhibidor lúpico. Se aisló la fracción IgG (cromatografía de afinidad) a partir de plasmas normales (IgG-N), con anti-factor VIII (IgG-aFVIII) o con inhibidor lúpico (IgG-IL), preparándose un pool normal como aporte de factor VIII en los ensayos de inhibición. Se analizaron las mezclas del pool normal con IgG-N, IgG-aFVIII, IgG-IL o la combinación de IgG-aFVIII+IgG-IL, inmediatamente y luego de 2 h a 37 °C, determinándose la actividad del factor VIII_SC y el índice de inhibición inmediato (Ii) o post-incubación (Ip). La inhibición y la potenciación producida por IgG-aFVIII+IgG-IL (Ii:30%±0,7; Ip:55%±2,7), fueron similares a las observadas con IgG-aFVIII sola (Ii:30%±0,6; Ip:55%±2,7). La IgG-IL no afectó la actividad de factor VIII_SC. Semejante a lo observado en plasma, la IgG-IL no interfirió en la inhibición del factor VIII_SC mediada por IgG-aFVIII. Se confirmó así la especificidad del método amidolítico, que permite detectar inhibidores anti-factor VIII independientemente de la coexistencia con el inhibidor lúpico, solucionando el problema diagnóstico planteado en hemofilia A.

Palabras clave: Inhibidor anti-factor VIII; Inhibidor lúpico; Factor VIII

Summary

To analyse the effect of purified immunoglobulins (IgG) with anti-factor VIII or lupus anticoagulant activity on factor VIII measured by chromogenic substrate (factor VIIICS), in order to validate the chromogenic substrate method for detection of anti-factor VIII activity in the presence of lupus anticoagulant. IgG fractions were purified (affinity chromatography) from normal plasmas (IgG-N) and plasmas with anti-factor VIII (IgG-aFVIII) or lupus anticoagulant (IgG-LA). A normal plasma pool was prepared as source of factor VIII in the inhibition tests. Mixtures of this pool with IgG-N, IgG-aFVIII, IgG-LA or IgG-aFVIII+IgG-LA were tested immediately or after 2 h at 37 °C by factor VIIICS method; inhibition index (Ii) and post-incubation index (Ip) were calculated. The inhibitory and progressive inhibitory effects produced by IgG-aFVIII+IgG-LA (Ii:30%±0.7; Ip:55%±2.7) were similar to those observed with IgG-aFVIII (Ii:30%±0.6; Ip:55%±2.7). The IgG-LA did not inhibit the factor VIIIcs activity. As was observed in plasma samples, IgG-aFVIII and the mixture of IgG-aFVIII+IgG-LA inhibited factor VIIICS, whereas IgG-LA did not. These results confirm the specificity of the amidolytic method in detecting anti-factor VIII inhibitors independently of the presence of lupus anticoagulant, thus solving the diagnostic problem in haemophilia A.

Key words: Anti-factor VIII antibodies; Lupus anticoagulant; Factor VIII

INTRODUCCIÓN

Existe la posibilidad teórica de que coexistan en un mismo paciente hemofílico, el anticuerpo anti-factor VIII neutralizante (1) y el inhibidor lúpico (2)(3). De hecho, el desarrollo concomitante de anticuerpos anti-factor VIII neutralizantes e inhibidor lúpico ha sido sugerido tanto en pacientes hemofílicos (4)(5) como en no-hemofílicos (6-11). De acuerdo con lo observado por los autores en estudios previos, ello debería sospecharse en aquellos pacientes hemofílicos con criterios de inhibidor lúpico y claro efecto tiempo y temperatura-dependiente, característico de los inhibidores anti-factor VIII (4)(12).
La confirmación de ambas actividades en un mismo plasma es compleja. Más allá de la posibilidad de falsos positivos en las pruebas confirmatorias para inhibidor lúpico, este anticuerpo puede enmascarar o interferir en la identificación del anticuerpo neutralizante (13)(14), por lo cual el diagnóstico definitivo requiere de una prueba específica para el inhibidor anti-factor VIII (12)(15). La prueba del tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) y la determinación de la actividad coagulante del factor VIII, en la cual se basan la detección y la titulación del inhibidor anti-factor VIII por el método Bethesda, no son específicas, pudiendo ser afectadas justamente por la presencia del inhibidor lúpico (13)(14). Dada la importancia clínica y terapéutica de la detección e identificación del inhibidor anti-factor VIII en los pacientes hemofílicos (1)(16), el objetivo fue desarrollar una prueba específica para el mismo.
El método de detección de anti-factor VIII por la técnica de ELISA (17-20), si bien no presenta interferencia alguna por la presencia de inhibidor lúpico (21), tiene la limitación de reconocer también anticuerpos no neutralizantes (1)(20-22), requiriendo de pruebas adicionales para verificar la inhibición de la actividad coagulante del factor VIII (21).
Surgió así la idea de evidenciar el efecto inhibitorio aplicando un principio diferente (13), el método amidolítico (23)(24), en base a las evidencias de que el inhibidor lúpico no interfiere en la determinación de la actividad de factor VIII medida por sustratos cromogénicos (factor VIII_SC) (25).
La técnica amidolítica permite detectar la inhibición, principalmente luego de la incubación a 37 °C del factor VIII exógeno, tanto en las muestras con inhibidor anti-factor VIII como en aquellas con presumible inhibidor lúpico + anti-factor VIII (26), no detectándose inhibición o interferencia por efecto de los plasmas con inhibidor lúpico.
Más allá de las evidencias a favor de la especificidad del método para detectar anti-factor VIII por sustratos cromogénicos (26), era necesario validar la posibilidad de detectar inhibidores anti-factor VIII en presencia de inhibidor lúpico, verificando su comportamiento en un sistema tal que asegure la acción conjunta de ambos inhibidores. Es por este motivo que se analizó el efecto de inmunoglobulinas purificadas con actividad anti-factor VIII neutralizante o inhibidor lúpico, agregadas a un pool de plasmas normales, sobre la actividad de factor VIII medida por el método de sustrato cromogénico.

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos
Para la determinación del factor VIII por el método de sustrato cromogénico se utilizó el reactivo COAMATIC®‚ Factor VIII (S-2765), de Chromogenix (Milán, Italia). La Proteína G-Sepharose, para la separación de la fracción inmunoglobulina G, fue proporcionada por Pharmacia (Upsala, Suecia) y las placas para su cuantificación por inmunodifusión radial por Kallestad Diagnostics (Austin, EE.UU.). Pruebas de coagulación: se utilizó caolín (Carlo Erba, Milán, Italia) y cefalina preparada aplicando el método de Bell WN & Alton HG, (27); la tromboplastina (Thromboplastin-S) y la trombina fueron provistas por Biopool (Trinity Biotech Company, Bray, Irlanda); el veneno de víbora Russell fue provisto por SIGMA Chemical Co. (St. Louis, EE.UU.), al igual que el imidazol; los plasmas deficientes en factor VIII y en factor IX fueron suministrados por Instrumentation Laboratory (Milán, Italia) o Diagnostica Stago (Ansnières, Francia).

Sujetos
Con el propósito de proceder a aislar la fracción inmunoglobulina G a partir de plasma, se seleccionaron individuos definidos como: -Normales (IgG-N): sin efecto inhibitorio sobre ninguna de las pruebas de coagulación, -Anti-factor VIII (IgG-aFVIII): con efecto neutralizante exclusivamente contra el factor VIII y criterios negativos para inhibidor lúpico, -Inhibidor lúpico (IgG-IL): con criterios positivos, según el "Subcommittee on Lupus Anticoagulant/Antiphospholipid Antibody of the Scientific and Standardisation Committee of the ISTH" (13), para ambos sistemas, TTPA y tiempo con veneno de víbora Russell diluido (dRVVT) a fin de evitar falsos positivos por inhibidores neutralizantes anti-factor VIII (14)(28)(29). Para preparar el pool utilizado como aporte de factor VIII, en los ensayos de inhibición con inmunoglobulina G aislada, se seleccionaron individuos normales sin efecto inhibitorio sobre ninguna de las pruebas de coagulación.

Muestras
Muestras individuales: La sangre obtenida por punción venosa fue recogida en tubos plásticos que contenían citrato de sodio 0,11M (9:1 v/v), obteniéndose inmediatamente plasma pobre en plaquetas (plaquetas residuales <3x109/L) por doble centrifugación a 1.500 g durante 15 min, evitando la fragmentación de las plaquetas (13)(14)(28). Las muestras de plasma pobre en plaquetas fueron en parte analizadas inmediatamente o congeladas en atmósfera de nitrógeno líquido y conservadas a -70 °C para su posterior análisis. La fracción inmunoglobulina G fue aislada a partir de plasmas normales, sin efecto inhibitorio sobre ninguna de las pruebas de coagulación (IgG-N) y plasmas de pacientes con inhibidor anti-factor VIII (IgG-aFVIII) y de individuos con inhibidor lúpico (IgG-IL), definidos según los criterios antes mencionados. Pool normal: Con los plasmas obtenidos de individuos normales se preparó un pool que fue fraccionado en alícuotas e inmediatamente congelado en atmósfera de nitrógeno líquido y conservado a -70 °C, para ser posteriormente utilizado como aporte de factor VIII en los ensayos de inhibición con IgG aislada.

Separación de inmunoglobulina G
La fracción inmunoglobulina se aisló utilizando cromatografía de afinidad con Proteína G-Sepharose. La fracción inmunoglobulina fue eluida de la columna con tampón glicina-ClH 0,1M pH 2,3; neutralizada con TRIS y dializada contra tampón fosfato-salino 0,01M pH 7,3. La concentración de IgG se controló mediante el método de inmunodifusión radial.

Factor VIII, método de sustrato cromogénico (factor VIII_SC).
La medida de la actividad del factor VIII se realizó por el método manual de punto final. La reacción tiene lugar en presencia de factor IXa, trombina, Ca2+, fosfolípidos y un exceso de factor X. El factor VIII actúa como cofactor en la activación del factor X a factor Xa, liberándose un grupo cromóforo por la actividad amidolítica del factor Xa sobre un sustrato cromogénico (S-2765). La absorbancia leída a 405 nm es proporcional a la cantidad de factor VIII presente en la muestra (23). En cada caso se analizaron al menos 4 diluciones progresivas de la muestra problema y del normal.

Ensayos de inhibición con IgG aislada
Se prepararon mezclas de plasma normal con IgG-N, IgG-aFVIII, IgG-IL o la combinación de IgG-aFVIII+IgG-IL. Una fracción de cada una de las mezclas fue analizada inmediatamente y la otra fue incubada durante 2 h a 37 °C, para luego determinar en ambas la actividad del factor VIII_SC en diluciones progresivas de las mezclas. Paralelamente se determinó la actividad de factor VIII_SC presente en el plasma normal. Se consideró como 100% de factor VIII residual la concentración presente en la mezcla que contenía IgG-N, se calculó el porcentaje de inhibición inmediato y el porcentaje de inhibición luego de la incubación a 37 °C, correspondientes a las mezclas con IgG provenientes de los plasmas con inhibidor (IgG-IL o IgG-aFVIII). Se realizaron tres ensayos sucesivos, cada uno de ellos por duplicado.

Estudios de coagulación
Pruebas globales. En las muestras de plasma en las cuales se evaluó la presencia de inhibidores, se midió el tiempo de trombina, el tiempo de protrombina, el TTPA y el dRVVT, aplicando los métodos previamente descriptos (30-33). Para determinar el TTPA, se utilizó una mezcla (1:1) de cefalina y caolín, con alta sensibilidad a la presencia de inhibidor lúpico (34). La determinación del tiempo de trombina permitió descartar posibles alteraciones debidas a la presencia de heparina o heparinoide (13)(14).
Actividad coagulante de factores VIII y IX. Se utilizó el método en una etapa (35)(36) en diluciones progresivas de muestras de pacientes y controles (13)(14)(37).
Corrección con plasma normal. Se realizaron las mezclas 1:1 de plasma del paciente y del normal, tanto para el sistema del TTPA como para el dRVVT (13)(14). Para definir el carácter inhibitorio de las muestras, se calculó el índice de Rosner ([mezcla (1:1)-normal]/paciente) para ambas pruebas (TTPA_índice y dRVVT_índice) (13)(38).
Efecto tiempo y temperatura-dependiente. El plasma del paciente, del normal y la mezcla de ambos plasmas fueron incubados 1 h a 37 °C, usando como control la mezcla inmediata de los plasmas del paciente y del normal, previamente incubados (1 h a 37 °C) por separado; se determinó el TTPA y se calculó en cada caso el índice de Rosner (TTPAíndice37).
Pruebas confirmatorias para inhibidor lúpico. Se efectuaron procedimientos de neutralización con plaquetas (39) tanto para el sistema del TTPA (DTTPA-PNP) como para el dRVVT (DdRVVT-PNP) en muestras de plasma del paciente (13)(14), así como en las mezclas 1:1 con plasma normal (40)(41).
Pruebas para Inhibidor anti-factor VIII. La detección se basó en el efecto que ejerce el inhibidor sobre el TTPA y sobre la actividad coagulante del factor VIII (1), constatándose que el mismo fuese exclusivo sobre dicho factor y se potenciase por la incubación a 37 °C.
Valores de referencia. Los valores de corte (>media+2DE) utilizados para clasificar las diferentes pruebas en anormales o positivas, fueron establecidos previamente (34) a partir del comportamiento de las mismas en plasmas de individuos normales o deficientes en factores, sin efecto inhibitorio alguno.
Análisis estadístico. Los resultados se expresaron como la media ± el error estándar de la media (EEM). De acuerdo con el número de muestras a analizar se aplicaron pruebas no-paramétricas. El análisis de varianza univariado de Kruskal-Wallis fue utilizado para evaluar diferencias en la tendencia central entre más de dos grupos de muestras independientes (no apareadas) y la prueba de Mann-Whitney para comparar valores entre dos grupos. Para analizar las diferencias entre las respuestas en una misma muestra se aplicó la prueba de Wilcoxon para muestras apareadas. Los cálculos se efectuaron mediante el programa "Statistical Package for Social Sciences" (SPSS Inc, Chicago IL, USA, versión 9.0), considerándose de significación estadística un nivel de 5%.

RESULTADOS

Estudios de coagulación. Los resultados de los plasmas a partir de los cuales se aisló la fracción inmunoglobulina G se resumen en la Tabla I. En todos lo casos, el tiempo de protrombina y el tiempo de trombina fueron normales.
Efecto de ensayos de inhibición con IgG aislada. La Figura 1 resume los resultados obtenidos. Se observó que la IgG-aFVIII inhibió significativamente la actividad de factor VIII_SC (Li: 30%±0,6) y su efecto fue potenciado por la incubación (Lp: 55%±2,7). En cambio, la IgG-IL no afectó la actividad de factor VIII_SC. Al analizar el resultado de ambas inmunoglobulinas, IgG-aFVIII e IgG-IL juntas, se advirtió que la inhibición y la potenciación fueron similares a las observadas con la IgG-aFVIII sola (Li: 30%±0,7 y Lp: 55%±2,7).

Tabla I. Estudios de coagulación. Los resultados son expresados como el valor de la media ± EEM para cada uno de los grupos analizados: plasmas con inhibidor anti-factor VIII (aFVIII); plasmas con inhibidor lúpico (IL) y plasmas normales (Normal). Los valores mínimos y máximos se muestran entre paréntesis. Para cada prueba se indica, entre paréntesis, el valor de corte correspondiente.

Figura 1. Inhibición de la actividad de factor VIII por IgG aislada.
Efecto inhibitorio de las fracciones de inmunoglobulina G (IgG) aislada sobre la actividad de factor VIII evaluada por sustrato cromogénico (factor VIII_SC). Se indica el promedio del porcentaje de inhibición de tres ensayos sucesivos, cada uno de ellos por duplicado. Considerando como 100% de factor VIII_SC residual, la concentración presente en la mezcla que contenía IgG normal (IgG-N), se calculó el porcentaje de inhibición inmediato y luego de la incubación durante 2 h a 37 °C, correspondientes a las mezclas con IgG provenientes de los plasmas con inhibidor lúpico (IgG-IL) o anti-factor VIII (IgG-aFVIII).

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

De acuerdo con lo mencionado en la introducción, se consideró preciso verificar el comportamiento del método de detección de inhibidores anti-factor VIII por sustratos cromogénicos en un sistema tal que asegurase la acción conjunta de ambos inhibidores. De hecho, el análisis no se podía limitar a los resultados obtenidos en las muestras de pacientes con, presumiblemente, ambos inhibidores. Se evaluó entonces el efecto de inmunoglobulinas purificadas con actividad anti-factor VIII neutralizante o inhibidor lúpico, agregadas a un pool de plasmas normales.
Las inmunoglobulinas se comportaron de modo similar a los plasmas de pacientes con uno u otro inhibidor de la coagulación. La presencia concomitante de anticuerpos con actividad de inhibidor lúpico no interfirió en la inhibición del factor VIII_SC mediada por las inmunoglobulinas con actividad anti-factor VIII.
Se confirmó así la especificidad del método amidolítico al corroborar que permite detectar inhibidores anti-factor VIII, en forma aislada o en coexistencia con el inhibidor lúpico, aportando, de este modo, una solución al problema diagnóstico planteado en los pacientes con hemofilia A.
Estos resultados adquieren relevancia, en primer término, por el reconocimiento de la posible coexistencia del inhibidor anti-factor VIII con el inhibidor de tipo lúdico, inhibidor de comportamiento clínico diferente que puede, no sólo enmascarar la detección del inhibidor anti-factor VIII, sino afectar los resultados del control de la terapéutica de reemplazo y, por ende, el adecuado manejo terapéutico de los pacientes. Además, el desarrollo de una prueba específica para el inhibidor anti-factor VIII, más allá de confirmar o descartar fehacientemente la sospecha clínica, evita, en el caso de los pacientes con ambos inhibidores, la interpretación inadecuada de la respuesta terapéutica lograda, dado que la interferencia en el tubo de ensayo no se correlaciona con una inhibición de la función coagulante in vivo. Considerando el altísimo costo de las terapias para el tratamiento de los inhibidores anti-factor VIII, esto puede representar una ventaja no sólo clínica, sino también económica. Si bien el presente trabajo fue enfocado a la resolución del problema de identificación del anti-factor VIII en los pacientes hemofílicos, la metodología desarrollada es aplicable a los pacientes no-hemofílicos (42) cuyo manejo terapéutico también es complejo, existiendo pacientes que no responden adecuadamente a las terapias inmunosupresoras. A pesar de que no existe el déficit concomitante de factor VIII, pueden presentarse situaciones de difícil diagnóstico, como en el caso de inhibidores anti-factor VIII que no muestran un claro efecto tiempo y temperatura-dependiente o cuando la clínica hemorrágica es menos evidente o se asocia a manifestaciones trombóticas.

Correspondencia

DRA. ALICIA NOEMÍ BLANCO
Departamento de Hemostasia y Trombosis
Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex",
Academia Nacional de Medicina
Pacheco de Melo 3081
1425 Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
E-mail: blanco@hematologia.anm.edu.ar

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Aceptado para su publicación el 26 de junio de 2007