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Acta bioquímica clínica latinoamericana

Print version ISSN 0325-2957On-line version ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.41 no.4 La Plata Oct./Dec. 2007

 

INMUNOLOGÍA

Ascaris lumbricoides: Capacidad de unión a hialuronato

Ascaris lumbricoides: Hyaluronan binding capacity

Patricia Ponce de León1*, Patricia Foresto2**, Juana Valverde2**

1. Bioquímica.
2. Dra. en Ciencias Bioquímicas.

* Laboratorio de Parasitología. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario.
** Laboratorio de Inmunohematología, Hemorreología e Inmunogenética. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario. Argentina.

Resumen

El ácido hialurónico tiene importantes funciones en los procesos inflamatorios y de reparación tisular. Sus principales receptores son CD44, RHAMM e ICAM-I. Debido a la variedad de estrategias utilizadas por los parásitos para evadir la respuesta inmune del hospedador y considerando las múltiples funciones e importancia fisiológica del ácido hialurónico, el objetivo de este trabajo fue determinar si Ascaris lumbricoides tiene capacidad de unión a hialuronato. Se trabajó con 36 extractos de A. lumbricoides obtenidos por remoción quirúrgica de la cutícula y ruptura mecánica refrigerada. Se modificó la técnica de detección de CD44 soluble en suero por Inhibición de la Agregación por adhesión. Los resultados demostraron que 23 de los 36 extractos estudiados tenían capacidad de unión a hialuronato. Este hecho podría deberse a la existencia de algún receptor en el parásito que une hialuronato y que eventualmente competiría con los receptores habituales del hospedador. A. lumbricoides podría utilizar este mecanismo para evadir la respuesta inmune.

Palabras clave: Ascaris lumbricoides; Hialuronato

Summary

Hyaluronan acid has important functions in inflammatory and tissue reparation processes. Its main receptors are CD44, RHAMM and ICAM-I. Owing to the varied strategies of the parasites to evade the host´s immune response, and also considering the multiple functions and physiological importance of hyaluronan acid, the aim was to study if Ascaris lumbricoides has hyaluronan binding capacity. Extracts of A. lumbricoides were prepared by surgical remotion of the cuticle and refrigerated mechanical rupture. The study was done on 36 parasite extracts. The test of serum soluble CD44 Detection by Aggregation Inhibition was modified. Of the 36 extracts studied, 23 presented hyaluronan binding capacity. This fact can possibly be due to the existence of a receptor with hyaluronan acid binding capacity in the parasite, which eventually might compete with the usual receptors of the host. A. lumbricoides might use this mechanism to evade the immune response.

Keywords: Ascaris lumbricoides; Hyaluronan

INTRODUCCIÓN

El ácido hialurónico (AH), bajo la forma de hidrato de carbono, representa el componente fundamental de la matriz extracelular de la piel, tejido mucoso, articulaciones, ojo y de muchos órganos y tejidos. Su función es reconocida en los procesos de reparación tisular, siendo un componente esencial en la reepitelización de la epidermis mediante su interacción con los receptores CD44, evitando la formación de cicatrices (1).
Aún no están muy claramente establecidos los mecanismos relacionados con su función como parte integral y estructural de la matriz extracelular y a sus complejas interacciones con componentes celulares y extracelulares.
La característica osmótica del ácido hialurónico restituye la hidratación tisular durante el proceso inflamatorio y su viscosidad ayuda a prevenir el pasaje de virus y bacterias por la zona pericelular (2)(3). Es un estimulador del proceso inflamatorio debido a sus propiedades antioxidantes, a su capacidad para eliminar radicales libres y a su acción como barrera de degradación tisular (4-6).
Los oligosacáridos del ácido hialurónico, de bajo peso molecular, han demostrado ser capaces de promover la angiogénesis y estimular la producción de colágeno por parte de las células endoteliales (7)(8). Diferentes estudios clínicos sobre la aplicación exógena de hialuronato para la cura de las heridas a nivel de piel, de membrana timpánica y del epitelio de la córnea, han demostrado que acelera la curación y que su presencia es necesaria para la ausencia de cicatrices (9-11).
Los principales receptores del ácido hialurónico son CD44, RHAMM e ICAM-I (12-15). También fue descrito como receptor de hialurónico en angiosarcoma y sarcoma de Kaposi, el marcador LYVE-1 que se expresa en las células endoteliales de los vasos linfáticos pero no en los vasos sanguíneos y está ausente en las injurias vasculares benignas (16)(17).
Durante la evolución, los parásitos han sufrido una fuerte presión selectiva y han podido sobrevivir hasta estos días debido a su aptitud para manipular la respuesta inmune del hospedador en diferentes niveles o bien interferir en los mecanismos efectores. Por ejemplo, los helmintos que no pueden ocupar espacios intracelulares y no tienen una alta tasa de replicación o de variación antigénica, subsisten en gran medida por su capacidad de suprimir la respuesta protectora generada por el hospedador, por ejemplo codificando proteínas homólogas a citocinas humanas que pueden unirse a los receptores, o bien actuando no sólo sobre los linfocitos T sino también sobre neutrófilos, monocitos y macrófagos como ocurre en Tenias spp. Otras estrategias de evasión de la respuesta inmune descritas en los parásitos comprenden la síntesis de proteínas con actividad de proteasas, el cambio en la composición química de la membrana durante el pasaje de una forma evolutiva a otra, la inducción de apoptosis de las células involucradas en la respuesta inmune y la expresión sobre sus superficies de proteínas reguladoras, inhibidores que bloquean la actividad de proteasas, receptores y proteínas homólogas a las del sistema del complemento (12).
Debido a las múltiples funciones del ácido hialurónico y a su importancia fisiológica, así como también considerando las variadas estrategias parasitarias para evadir la respuesta inmune del hospedador, el objetivo de este trabajo fue estudiar si Ascaris lumbricoides tiene capacidad de unión a hialuronato.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se trabajó con 36 extractos parasitarios (EA) preparados por remoción quirúrgica de la cutícula de ejemplares adultos de A. lumbricoides y ruptura mecánica refrigerada (18).
Se utilizó la técnica de Inhibición de la Agregación por adhesión para detección del receptor CD44 soluble de hialuronato en suero humano. El fundamento de esta técnica es la competencia por la unión de ácido hialurónico entre el CD44 soluble del suero y la molécula de adhesión CD44 (receptor de los eritrocitos). La concentración de CD44 soluble en el suero de individuos normales es 2,7+/-1,1 nM pero se encuentra aumentada cuando hay liberación del mismo a partir de membranas celulares alteradas.
Se preparó una serie de diluciones al medio del suero donde se deseaba investigar la presencia de CD44 soluble. Se agregó ácido hialurónico y se reveló con eritrocitos Grupo O. Cuando el receptor soluble en suero estaba presente se produjo la inhibición de la adhesión de ácido hialurónico a CD44 de los eritrocitos. Se determinó el título del receptor CD44 soluble en suero (19)(20).
Esta técnica fue modificada a los fines de la experiencia.
En primer lugar, se titularon varios pooles de sueros con el objeto de seleccionar los que presentaban CD44 soluble con un título igual o mayor a 16 para evitar trabajar en el límite de sensibilidad de la técnica. Para esto se prepararon series de diluciones al medio de los pooles de sueros (puro hasta 1/512). El volumen final de cada dilución fue 50 µL. A todos los tubos se les agregó igual volumen de ácido hialurónico, concentración 1/128 en PBS pH 7,4 y se dejó reaccionar 15 min a 4 °C. Pasado este tiempo se adicionaron 50 µL del sistema revelador (suspensión al 2% de eritrocitos Grupo O, lavados 3 veces en PBS pH: 7,4 y en medio enzimático de bromelina). Después de 24 h a 4 °C se determinó el título de CD44 soluble en los pooles de sueros, siendo éste la inversa de la última dilución que presentó agregación.
Se incluyó un testigo positivo de agregación por adhesión.
Testigo +: 50 µL de AH+ 50 µL del plasma autólogo de los eritrocitos Grupo O + 50 µL de eritrocitos Grupo O (19).
Una vez seleccionados los pooles de sueros a utilizar en la experiencia de Inhibición de la Agregación por adhesión, se preparó una suspensión en partes iguales de acido hialurónico (1/64 en PBS pH 7,4) y extracto parasitario, de tal manera que la concentración final fuera 1/128, y se dejó en contacto 60 min a 4 °C (mezcla AH-EA) a los fines de posibilitar la unión entre el parásito y el ácido hialurónico.
Se prepararon dos series de diluciones del pool de sueros seleccionado (puro hasta 1/512). El volumen final de cada dilución fue 50 µL. A cada tubo de la primera serie se le agregaron 50 µL de AH (1/128), y a los tubos de la segunda serie igual cantidad de la mezcla AH-EA. Ambas series fueron colocadas durante 15 min a 4 °C. En esta etapa ocurre la unión entre el AH y el receptor soluble del pool de sueros. Si el parásito presenta capacidad de unión a hialuronato, la cantidad de AH libre en la mezcla AH-EA disminuye y, por lo tanto, es menor la unión a CD44 soluble.
A todos los tubos de ambas series se les adicionaron 50 µL del sistema revelador (suspensión al 2% de eritrocitos frescos Grupo O en medio enzimático de bromelina).
La lectura de inhibición de la agregación por adhesión se realizó después de 24 h a 4 °C determinando el título de CD44 soluble en el pool de sueros de las dos series. Se consideró significativa una diferencia entre ambos títulos de dos o más diluciones.

RESULTADOS

Los resultados mostraron que de los 36 EA estudiados, 23 tenían capacidad de unión a AH.
En la primera experiencia se usó un pool de sueros con un título de CD44 soluble de 64 para estudiar 10 extractos parasitarios. La inhibición de la agregación por adhesión mostró que 7 EA unían hialuronato.
El título de CD44 soluble en los pooles utilizados en las demás experiencias, donde se estudiaron los 26 extractos restantes, fue 16. Las pruebas realizadas indicaron que 16 EA tenían capacidad de unión a hialuronato.
La titulación de CD44 soluble en suero mostró una diferencia de título, entre ambas series, de dos diluciones con 11 de los extractos investigados e igual o mayor a tres diluciones con los 12 extractos restantes.
Los resultados se muestran en la Tabla I.


Tabla I. Estudio de la capacidad de unión de A. lumbricoides a hialuronato: Resultados de la Inhibición de la Agregación por adhesión.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Los niveles circulantes de CD44 y de las isoformas solubles de CD44 se asocian con metástasis tumorales y condiciones inflamatorias como la artritis reumatoidea, colitis y bronquitis (21-26).
La técnica utilizada en esta experiencia se fundamenta en la competencia por la unión de ácido hialurónico entre el CD44 soluble presente en el suero y el CD44 presente en los eritrocitos. Ha sido comunicada para el estudio de pacientes hipertensos (20) pero por su fácil implementación y buena sensibilidad puede ser útil para estudiar el sistema CD44 hialuronato en otras patologías.
En esta experiencia, la técnica se ha modificado a los fines de evaluar la unión de ácido hialurónico a los extractos de A. lumbricoides, incorporando un primer paso donde ambos se ponen en contacto para permitir la reacción (mezcla AH-EA), de tal manera que la concentración final de ácido hialurónico se mantenga en 1/128 que es la descrita en la técnica original. La primera serie de diluciones del pool se enfrenta con AH (1/128), y la segunda con la mezcla AH-EA. Cuando el extracto parasitario no tiene capacidad de unión a ácido hialurónico, el título de CD44 soluble en las dos series es el mismo, y por el contrario difiere si el parásito captó ácido hialurónico. Se considera significativa una diferencia igual o mayor a 2 diluciones entre los títulos de CD44 soluble en las dos series.
Los resultados mostraron que 23 de los 36 extractos de A. lumbricoides estudiados tenían capacidad de unión a AH lo que probablemente ocurra a través de un receptor presente en el parásito.
El AH es un glicosaminoglicano constituido por residuos alternantes de ácido glucurónico y N-acetil-glucosamina. No tiene una forma definida en el espacio, sino que se extiende aleatoriamente tendiendo a ocupar un volumen muy grande debido a la repulsión electrostática de los grupos carboxilo del ácido urónico.
La quitina es otro polisacárido de función estructural, indispensable para el desarrollo de las cubiertas de los helmintos. Está constituida por un derivado de la glucosa que es la N-acetil-glucosamina.
Recientemente se ha demostrado similitud entre los mecanismos biosintéticos del AH y de la quitina, y se sugiere un ancestro común entre las enzimas ácido hialurónico sintasa y quitina sintasa (27).
Se necesitan estudios posteriores para determinar cuál es la especificidad de este posible receptor presente en A. lumbricoides, pero independientemente de su naturaleza, esta experiencia ha demostrado su capacidad de unión a AH.
La matriz extracelular está formada por macromoléculas que forman el ecosistema donde las células cumplen sus funciones vitales. El ácido hialurónico tiene un papel importante en la migración celular, contribuye a la adhesividad de las células y facilita la hidratación de los tejidos por sus radicales libres que se ligan a las moléculas de agua. Puede unirse a la proteína B y formar un complejo que se asocia al estímulo de la actividad de proteína quinasa, participando en la traducción a nivel celular y en la interacción de la superficie celular con el citoesqueleto (28).
La respuesta inicial a los ataques de los tejidos incluye la formación de una matriz extracelular rica en AH y fibrina que soporta la influencia de fibroblastos y células endoteliales dentro de la zona del ataque y la siguiente formación de tejido de granulación. La matriz de tejido de granulación, rica en AH, desarrolla una serie de funciones útiles a la reparación tisular. Además de tener una función de estimulación del proceso inflamatorio, el ácido hialurónico se caracteriza por su función moderadora de la inflamación debido a sus propiedades antioxidantes, por la eliminación de radicales libres y por su acción como barrera de degradación de los tejidos (29).
Teniendo en cuenta las múltiples formas de evasión de la respuesta inmune que pueden utilizar los parásitos, la capacidad de A. lumbricoides de unir ácido hialurónico demostrada en esta experiencia, podría eventualmente ser utilizada por este nematodo para competir con los receptores de ácido hialurónico habituales del hospedero y de esa manera modificar su respuesta inmune.
Estudios previos han revelado la presencia de los mismos epitopes de los Sistemas de Grupo Sanguíneo ABO y P en A. lumbricoides y en sus hospedadores, lo que supone una estrategia parasitaria de mimetismo antigénico (18)(30-33). La unión a ácido hialurónico podría ser una forma alternativa de mimetismo que consiste en la síntesis, por parte del parásito, de receptores semejantes a los del hospedador, o bien un mecanismo de evasión por modulación o supresión de la respuesta inmune inflamatoria. Los hallazgos de esta experiencia podrían colaborar en la comprensión del complejo mecanismo de evasión parasitaria de este nematodo.

Correspondencia

DRA. PATRICIA PONCE DE LEÓN
Laboratorio de Parasitología
Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas - UNR
Suipacha 531
2000 ROSARIO
E-mail: tefu1958@hotmail.com

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Aceptado para su publicación el 29 de junio de 2007

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