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Acta bioquímica clínica latinoamericana

Print version ISSN 0325-2957On-line version ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.41 no.4 La Plata Oct./Dec. 2007

 

HEMOSTASIA Y TROMBOSIS

Anticoagulante Lúpico: Sensibilidad de 19 reactivos comerciales de tiempo de tromboplastina parcial activado

Lupus Anticoagulant: Sensitivity of 19 commercial activated partial thromboplastin time reagents

Germán Alejandro Detarsio1**, Cristina Soler2*, Josefina Paredes3*, Ángela Cristina Milani4**, José Ordi-Ros5*

1. Bioquímico. Especialista en Hematología. Especialista en Hemostasia.
2. Doctora en Medicina. Especialista en Medicina Interna.
3. Bióloga.
4. Doctora en Bioquímica. Especialista en Hematología.
5. Doctor en Medicina. Especialista en Medicina Interna.

* Hospital Vall D'Hebron, Departamento de Medicina Interna, Laboratorio de Investigación de Enfermedades Autoinmunes, Barcelona, España.
** Cátedra de Hematología, Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario. Argentina.

Resumen

El Anticoagulante Lúpico (AL) constituye una familia de inmunoglobulinas que interfieren las pruebas de coagulación dependientes de fosfolípidos. Hay una gran variedad de pruebas que permiten detectar y confirmar la presencia de AL en el plasma de un paciente. Sin embargo, el tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) sigue siendo una de las pruebas más utilizadas para la detección de dicho inhibidor. Teniendo en cuenta la importancia clínica de su diagnóstico de laboratorio, se dicidió estudiar la sensibilidad, para detectar AL, de 19 reactivos comerciales de TTPA. Se obtuvieron varias conclusiones importantes: No se encontró relación entre sensibilidad y tamaño de los liposomas; tampoco con la uniformidad de los mismos. La fuente de fosfolípido y el tipo de activador no son suficientes para explicar las diferencias en sensibilidad de los reactivos. Finalmente, se encontró una correlación negativa entre la sensibilidad y la concentración total de fosfolípido del reactivo. A menor concentración de fosfolípido, mayor sensibilidad.

Palabras clave: Anticoagulante lúpico; Tiempo de tromboplastina parcial activado; Síndrome antifosfolípido

Summary

Lupus anticoagulants (LA) are immunoglobulins which interfere in in vitro phospholipid-dependent coagulation tests. Various methods have been proposed; however, activated partial thromboplastin time (APTT) is the most used screening test for lupus anticoagulant. Previous studies have shown that sensitivity to the lupus anticoagulant defect varies considerably with different APTT reagents. In view of the undoubted clinical importance of lupus anticoagulants, the sensitivity of 19 commercial APTT reagents has been evaluated. The study raises several important conclusions: No difference was found in sensitivity associated with a narrower distribution of liposomes' diameter, considering the latter as a marker of uniformity in phospholipid distribution. The source of the platelet substitute and the nature of the contact phase activator are unlikely to determine such varied sensitivity. Finally, a significant negative correlation between APTT sensitivity and total phospholipid concentration was found. The lower the phospholipid concentration, the higher the APTT sensitivity to AL.

Key Words: Lupus anticoagulant; Activated partial thromboplastin time; Antiphospholipid syndrome

INTRODUCCIÓN

El Anticoagulante Lúpico (AL) es un inhibidor adquirido de la coagulación constituido por una familia de inmunoglobulinas que interfieren en las pruebas de laboratorio dependientes de fosfolípidos. Actualmente se sabe que estos anticuerpos no reaccionan con los fosfolípidos, sino que reconocen epitopes expuestos por diferentes proteínas con afinidad por los fosfolípidos, como son la protrombina y la b2 glicoproteína I (b2GPI) (1-3).
Desde comienzos de la década del 90 la búsqueda de este inhibidor en el laboratorio clínico se ha incrementado debido a su asociación con trombosis, tanto venosa como arterial y con muertes fetales y abortos espontáneos recurrentes (4)(5).
Hay una gran variedad de pruebas que permiten detectar y confirmar la presencia de AL en el plasma de un paciente (6-10). A pesar de ello, el tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) sigue siendo una de las pruebas más utilizadas para la detección de dicho inhibidor. En los últimos años se han fabricado reactivos diseñados especialmente para detectar el AL. Sin embargo, los reactivos comerciales de TTPA varían ampliamente en su sensibilidad para evidenciar dicho efecto inhibitorio (11-14).
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la sensibilidad de 19 reactivos comerciales de TTPA para detectar el AL. Además, se analizó el tipo de activador, el origen de los fosfolípidos, la concentración fosfolipídica y el diámetro de los liposomas de cada uno de ellos, con el propósito de comprender o explicar las diferencias observadas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes

Se analizaron 56 plasmas de pacientes con AL positivo que concurrieron al Hospital para su control y tratamiento. La edad promedio de los pacientes fue de 40 años (rango: 17-72 años). El diagnóstico clínico fue el siguiente: lupus eritematoso sistémico (LES) (n:5), síndrome antifosfolípido (SAF) primario (n:20), SAF secundario (n:21) y sin enfermedad autoinmune conocida (n:10). El SAF secundario siempre se encontró asociado a LES, excepto en un caso que se asoció a dermatopolimiositis.

Pool normal

Fue preparado a partir de plasma de 20 voluntarios sanos, que no estaban tomando medicamentos y no presentaban antecedentes de alteraciones hemostáticas.

Muestras

Las muestras de plasma fueron obtenidas por punción venosa utilizando tubos de sistema de vacío que contenían citrato de sodio 0,11M, en una relación de 9 partes de sangre con 1 parte de anticoagulante. El plasma pobre en plaquetas se obtuvo por doble centrifugación a 2.500 g durante 15 min, en una centrífuga refrigerada a 4 °C. Las alícuotas de plasma así obtenidas se congelaron a -80 °C hasta ser procesadas.

Diagnóstico de AL

La presencia del AL fue definida siguiendo los criterios del Subcomité de Estandarización de la Sociedad Internacional de Hemostasia y Trombosis (SSC-ISTH) (15). Se detectó la presencia del inhibidor a través de la prolongación de al menos una prueba de coagulación dependiente de fosfolípidos y su no corrección por el agregado de plasma normal, confirmándose luego la dependencia del efecto inhibitorio de la concentración de fosfolípidos en el sistema. En los pasos de detección y mezcla con plasma normal se utilizaron las siguientes pruebas: TTPA empleando un reactivo de probada sensibilidad al inhibidor lúpico (16) (PTT-LA, Stago), tiempo de coagulación con caolín (6) (KCT) y tiempo de coagulación con veneno de víbora Russell diluido (8) (dRVVT) (RVV, Stago). La dependencia de fosfolípidos se confirmó utilizando la prueba de inhibición con fosfolípidos hexagonales (Staclot-LA, Stago) y el cociente Textarín/Ecarín (Stago).

Reactivos de TTPA

Se emplearon 19 reactivos comerciales diferentes [PTT-R®, PTT-a‚, PTT-a liquid®‚ y PTT-LA® (Stago); Actin FSL® y Actin FS® (Dade-Behring); Cefalina-L®, APTT-L y APTT-LA (Grifols); Platelin LS®‚ y Automated APTT®‚ (Organon Teknika); APTT-P® y APTT-EA®‚ (Biopool); Neothrontin® y Pathrontin® (Behring); Trombosil®, Trombofax® y Synthasil® (Ortho) y APTT-S® (IL)]. Cada reactivo fue utilizado siguiendo las especificaciones recomendadas por los fabricantes. Las características de cada uno de ellos se muestran en la Tabla I. La respuesta de cada uno de los reactivos (un solo lote) fue evaluada frente a los plasmas con AL positivo y sus respectivas mezclas (1:1) con plasma normal, utilizando un coagulómetro ACL 300 Research (Instrumentation Laboratory, Milán, Italia). Todas las determinaciones fueron procesadas por duplicado.

Tabla I. Características principales de los 19 reactivos de TTPA analizados en el estudio.

Estudio del contenido fosfolipídico

Se realizó una extracción clorofórmica siguiendo el método de Bligh y Dyer (17) y el extracto se conservó bajo atmósfera de nitrógeno a -70 °C hasta el momento de realizar los estudios. La cuantificación de los fosfolípidos se realizó según el método de Bartlett modificado (18), para trabajar con pequeñas muestras y la concentración se expresó en micro moles de fósforo orgánico por mililitro (µmol/mL).
El tamaño de los liposomas de cada reactivo se midió con un analizador de partículas ultrafinas 'Microtrac' (Leeds & Northrup, Pennsylvania, EE.UU.), cuyo principio de funcionamiento se basa en medir la dispersión de la luz generada por las partículas.

Análisis de los datos

Para cada reactivo de TTPA se determinaron los coeficientes de variación (CV) y la amplitud de los valores obtenidos para el pool de 20 plasmas normales procesado en diferentes días. En la evaluación de los plasma AL (+), el valor de corte aplicado para definir la presencia de inhibidor (no corrección con plasma normal) con cada uno de los reactivos de TTPA fue un Índice de Rosner (IR) 15% (19). La sensibilidad de cada reactivo, definida como el porcentaje de plasma AL(+) detectado, fue calculada siguiendo el criterio del IR. Se analizó, además, la relación entre sensibilidad y concentración de fosfolípidos y sensibilidad y tamaño de los liposomas, calculándose en cada caso el coeficiente de correlación (r) mediante la curva de regresión lineal.

RESULTADOS

- Comportamiento de los reactivos de TTPA frente al pool de plasma normal
El CV de 18 de los reactivos que pudieron ser estudiados varió entre 1,05% (reactivo XVII) y 5,21% (reactivo XIX). El valor normal de TTPA más corto fue obtenido con el reactivo XV y el más largo con el reactivo IV (Tabla I). A pesar de que el reactivo Pathromtin (reactivo XIII) puede ser utilizado en una gran variedad de coagulómetros automáticos, con el ACL 300 Research se obtuvieron valores muy erráticos, posiblemente debido a su mayor turbidez.

- Comportamiento de los reactivos de TTPA frente a los plasmas AL(+)
Los reactivos de TTPA difirieron considerablemente en su habilidad para detectar la presencia de inhibidores AL(+). La sensibilidad, expresada en porcentaje, para cada reactivo de TTPA se muestra en la Tabla I. En las condiciones de trabajo del presente estudio, los reactivos menos sensibles fueron: PTT-a liquid, Actin FS y Neothromtin (51,7% a 60,7%) y los más sensibles fueron: PTT-a, Cefalina L, Platelin LS, y Automated APTT (100%). Acorde con el criterio adoptado para definir AL(+), la sensibilidad del PTT-LA fue 100%.

- Efecto de la concentración de fosfolípidos y el tamaño de los liposomas
La Tabla II muestra la concentración de fosfolípidos y el tamaño de los liposomas obtenidos para cada uno de los reactivos analizados. La concentración de fósforo varió entre 0,039 µmol/mL (Automated APTT) y 0,265 µmol/mL (Actin FS) y los liposomas de los reactivos PTT-LA y Actin FS fueron los más pequeños y de tamaño más uniforme. Se obtuvo una correlación significativa entre la sensibilidad para detectar AL y la concentración de fosfolípidos (r=-0,9371; p<0,0001) (Fig. 1). En cambio, no existe correlación significativa entre el tamaño de los liposomas y la sensibilidad al AL (r=0,0062; p=0,982) (Fig. 2).

Tabla II. Concentración de fósforo, tamaño de los liposomas y sensibilidad para cada uno de los reactivos de TTPA estudiados.


Figura 1. Curva de regresión entre sensibilidad de los reactivos de TTPA y la concentración de fosfolípidos de cada uno.


Figura 2. Curva de regresión entre sensibilidad de los reactivos de TTPA y el tamaño de los liposomas de cada uno.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

La detección del AL es cada vez más solicitada en la práctica médica. Varias determinaciones han sido propuestas para su detección, siendo el TTPA una de las más utilizada en el screening. Estudios previos han demostrado que la sensibilidad del TTPA para detectar la presencia del AL varía considerablemente, según el tipo de reactivo utilizado (12)(20)(21). Es por este motivo que se decidió realizar el presente estudio comparativo, en el cual se evaluó la sensibilidad de 19 reactivos comerciales de TTPA de diferentes marcas y presentaciones frente a 56 plasmas de pacientes que reunían criterios de LA(+).
Se discuten a continuación las conclusiones del análisis efectuado.
La sensibilidad al AL disminuye conforme aumenta el contenido de fosfolípidos del reactivo. Se obtuvo una correlación negativa entre la concentración de fosfolípidos y la prolongación de las pruebas de TTPA.
Stevenson y otros autores (12)(22) postularon que la presentación de los fosfolípidos procoagulantes sobre la superficie de liposomas uniformemente organizados, aumenta la interacción de los mismos con los factores de coagulación. Usando un analizador de partículas ultrafinas no se pudo demostrar que a menor dispersión de tamaño liposomal hubiera mayor sensibilidad para detectar los plasmas AL(+).
El origen de los fosfolípidos (vegetal, animal o sintético) y el tipo de activador de contacto en los reactivos de TTPA, no parecen poder explicar las diferencias encontradas en la sensibilidad al AL, dado que el mismo tipo de activador y de fosfolípidos fueron encontrados tanto entre los reactivos de mayor sensibilidad, como en los de menor sensibilidad. Los reactivos con fosfolípidos de origen animal no mostraron ser más sensibles que aquellos con fosfolípidos de origen vegetal.
En conclusión, según los datos obtenidos en el presente estudio, la característica más importante a la hora de seleccionar un reactivo de TTPA para el estudio de AL, es su concentración de fosfolípidos totales. Mientras menor sea la concentración total de fosfolípidos, mayor será la sensibilidad del TTPA frente al AL.

Agradecimiento

Los autores agradecen especialmente a la Dra. Alicia Blanco por la ayuda ofrecida en la revisión de este manuscrito

Correspondencia

DR. GERMÁN ALEJANDRO DETARSIO
Chaco 239 bis
2252 Gálvez - Santa Fe - Argentina
E-mail: gyrdetarsio@cablenet.com.ar

Referencias bibliográficas

1. Triplett DA. Antiphospholipid-protein antibodies: Laboratory detection and clinical relevance. Thromb Res 1995; 78: 1-31.
2. Triplett DA. Protean clinical presentation of antiphospholipid-protein antibodies (APA). Thromb Haemost 1995; 74: 329-37.
3. Roubey RAS. Autoantibodies to phospholipid binding proteins: a new view of lupus anticoagulants and other 'antiphospholipid' autoantibodies. Blood 1994; 84: 2.854-67.
4. Asherson RA, Khamashta MA, Ordi-Ros J, Derksen MD, Machin SJ, Barquinero J, et al. The primary antiphospholipid syndrome: major clinical and serological features. Medicine 1989; 68(6): 366-72.
5. Alarcón-Segovia D, Delezé M, Oria CV, Sanchez-Guerrero J, Gomez-Pacheco L. Antiphospholipid antibodies and the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus. A prospective analysis of 500 consecutive patients. Medicine (Baltimore) 1989; 68: 353-65.
6. Exner T, Richard KA, Kronembourg H. A sensitive test demonstrating lupus anticoagulant and its behavioural patterns. Br J Haematol 1978; 40: 143-51.
7. Triplett DA, Brandt JT, Kaczor D, Schaeffer MS. Laboratory diagnosis of lupus inhibitors: A comparison of the tissue thromboplastin inhibition procedure with a new platelet neutralization procedure. Am J Clin Pathol 1983; 79: 678-82.
8. Thiagarajan P, Pengo V, Shapiro SS. The use of dilute Russell's viper venom time for the diagnosis of lupus anticoagulant. Blood 1986; 68: 869-84.
9. Rauch J, Tannembaum M, Janoff AS. Distinguishing plasma lupus anticoagulant from antifactor antibodies using hexagonal (II) phase phospholipids. Thromb Haemost 1989; 62: 892-6.
10. Arnout J, Huybrecht E, Vanrusselt M, Vermylen J. A new lupus anticoagulant neutralization test based on platelet derived vesicles. Br J Haematol 1992; 80: 341-6.
11. Kelsey PR, Stevenson KJ, Poller L. The diagnosis of lupus anticoagulants by the activated partial thromboplastin time - the central role of phosphatidylserine. Thromb Haemost 1984; 52: 172-5.
12. Stevenson KJ, Easton AC, Curry A, Thompson JM, Poller L. The reliability of partial thromboplastin time methods and the relationship to lipid composition and ultraestructure. Thromb Haemost 1986; 55: 250-8.
13. Brandt JT, Triplett DA, Rock WA, Bovill EG, Arkin CF. Effect of lupus anticoagulants on the activated partial thromboplastin time. Arch Pathol Lab Med 1991; 115: 109-4.
14. Adcock DM, Malar RA. Activated partial thromboplastin time reagent sensitivity to the presence of the lupus anticoagulant. Arch Path Lab Med 1992; 116: 837-40.
15. Brandt JT, Triplett DA, Alving B, Scharrer I. Criteria for the diagnosis of lupus anticoagulants: An update. Thromb Haemost 1995; 74: 1185-90.
16. Forastiero RR, Cerrato GS, Carreras LO. Evaluation of recently described tests for detection of the lupus anticoagulant. Thromb Haemostasis 1994; 72, 5: 728-33.
17. Bligh EG, Dyer WJ. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 1959; 37: 911-7.
18. Barrowcliffe TW, Gray E. Studies of phospholipid reagents used in coagulation. I: some general properties and their sensitivity to factor VIII. Thromb Haemost 1981; 46: 629-33.
19. Rosner E, Pauzner R, Lusky A, Modan M, Many A. Detection and quantitative evaluation of lupus circulating anticoagulant activity. Thromb Haemost 1987; 57: 144-7.
20. Denis-Magdelaine A, Flahault A, Verdy E. Sensitivity of sixteen APTT reagents for the presence of lupus anticoagulants. Haemostasis 1995; 25: 98-105.
21. Mannucci PM, Canciani MT, Mari D, Meucci P. The varied sensitivity of partial thromboplastin and prothrombin time reagents in the demonstration of the lupus-like anticoagulant. Scand J Haematol 1979; 22: 423-32.
22. Zwaal RFA, Comfurius P, van Deenen LLM. Membrane asymmetry and blood coagulation. Nature 1977; 268: 358-60.
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Aceptado para su publicación el 12 de junio de 2007

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