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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. v.42 n.1 La Plata ene./mar. 2008

 

TEMAS DE INTERÉS

Evaluación del riesgo materno-fetal y valores de referencia en el embarazo

SECCIÓN VIII a X

ÍNDICE

• Preámbulo
• Sección I
Evaluación del riesgo materno-fetal y valores de referencia en el embarazo.
• Sección II
Vacunación durante el embarazo
• Sección III
Screening prenatal del tercer trimestre y evaluación diagnóstica.
• Sección IV
Screening prenatal del segundo trimestre: resultados de un amplio programa de Screening.
• Sección V
Evaluación diagnóstica de seguimiento en el embarazo de riesgo.
• Sección VI
Guías para la práctica en el laboratorio clínico en la evaluación del embarazo de alto riesgo.
• Sección VII
Prácticas actuales y guías para la evaluación del recién nacido.
• Sección VIII
Screening metabólico del recién nacido.
• Sección IX
Avances en el Screening del recién nacido usando MS/MS.
• Sección X
Recomendaciones para la medición de ácidos orgánicos urinarios.
• Referencias

COMITÉ DE LAS GUÍAS

Editor
John E. Sherwin, PhD, DABCC, FACB
Chief, Genetic Disease Laboratory, Department of Health Services of California, Richmond, CA

Comité

Gillian Lockitch, MD, MBChB, FRCPC
Professor, Pathology & Laboratory Medicine, University of British Columbia; Director of Laboratories, and
Head, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Children's and Women's Health Centre of British
Columbia, Vancouver, BC, Canada

Philip Rosenthal, MD, FAAP, FACH, FACG
Professor of Pediatrics and Surgery, University of California, San Francisco, CA

Stephanie Rhone, MD, RDMS, FRCSC
Clinical Assistant Professor, Department of Obstetrics and Gynecology and Centre for Healthcare Innovation and Improvement, University of British Columbia and the Children's and Women's Health Centre of British
Columbia, Vancouver, BC, Canada

Laura A. Magee, MD
Internist (Medical Disorders of Pregnancy), Children's and Women's Health Centre of BC, Vancouver, BC,
Canada

Edward R. Ashwood, MD, FACB
Professor of Pathology, University of Utah, Director of Laboratories and Chief Medical Officer, ARUP
Laboratories, Inc., Salt Lake City, UT

Barbara M. Goldsmith, PhD, FACB
Director, Laboratory Services, Caritas St. Elizabeth's Medical Center, Boston, MA

Carol R. Lee, MS (ret.)
Beckman Coulter, Inc., Chaska, MN

Sharon Geaghan, MD
Clinical Laboratory, Lucile Packard Children's Hospital, Palo Alto, CA

David Millington, PhD
Duke University Medical Center, Pediatrics, Medical Genetics, Research Triangle Park, NC
Michael Bennett, PhD, FACB
Department of Pathology, Children's Medical Center of Dallas, Dallas, TX

Otras contribuciones

Peter von Dadelszen, PhD, MBChB, FRCSC, MRCOG
Perinatologist, Children's and Women's Health Centre of BC, Vancouver, BC, Canada

Bob Currier, PhD; George Helmer, PhD; and Fred Lorey, PhD
Genetic Disease Laboratory, State of California, Richmond, CA
Laboratory Medicine Practice Guidelines

Esta publicación se realiza con la ayuda de los siguientes Comités de la NACB:

Comité de publicaciones de la NACB

Kiang-Teck Yeo, PhD, DABCC, FACB (Chair)
Dartmouth-Hitchcock Medical Center and Dartmouth Medical School, Lebanon, NH

Charlie Hawker, PhD, DABCC, FACB
ARUP Laboratories, Inc., Salt Lake City, UT

Stanley Lo, PhD, DABCC, FACB
Children's Hospital of Wisconsin, Wauwatosa, WI

James Ritchie, PhD, FACB
Emory University Hospital, Atlanta, GA

Sayed Sadrzadeh, PhD, FACB
University of Washington School of Medicine, Seattle, WA

Comité de asuntos educativos y científicos de la NACB

Catherine Hammett-Stabler, PhD, DABCC, FACB (Chair)
University of North Carolina, Chapel Hill, NC

Michael Bennett, PhD, FACB
Children's Hospital of Philadelphia, Philadelphia, PA

D. Robert Dufour, MD, FACB
10316 Gainsborough Rd., Potomac, MD

Shirley Welch, PhD, DABCC, FACB
Kaiser Permanente NW Regional Laboratory, Portland, OR

SECCIÓN VIII

Screening metabólico del recién nacido

Cada año se le realiza screening a cuatro millones de recién nacidos en los Estados Unidos para detectar condiciones que amenacen sus vidas y su salud a largo plazo (151). La realización de pruebas al nacer sirve para detectar un recién nacido con alguna alteración metabólica, evaluar la posibilidad de anemia, detectar genes anormales y, si correspondiera, determinar la necesidad materna de globulina Rh inmune. El screening para las alteraciones metabólicas es obligatorio en todos los Estados Unidos y en sus territorios y posesiones. Cada estado es responsable de determinar cuáles son las pruebas que se les deberían realizar a los recién nacidos; sin embargo, los proveedores pueden seleccionar la realización de alguna prueba adicional.
El Título XXVI de la Ley 2000 de Salud de los Niños se promulgó para proporcionar guías nacionales y estandarización para ampliar los programas de screening de recién nacidos y niños en el Screening de Alteraciones Hereditarias en Recién Nacidos y en Niños (152). La implementación involucra cuatro agencias: la Administración de Recursos y Servicios Sanitarios (HRSA); la Agencia para la Investigación y la Calidad en el Cuidado de la Salud (AHRQ); los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC); y los Institutos Nacionales de la Salud (NIH). En todo el mundo, la Asociación de Laboratorios de la Salud Pública incluye a más de 250 laboratorios en los Estados Unidos y en otros 45 países, y está asociada con los CDC para ofrecer servicios que tienen como objetivo asegurar la calidad de las pruebas. Estos servicios incluyen la evaluación del papel de filtro, capacitación, asesoría y pruebas de excelencia (152).

Condiciones y Evaluación del screening metabólico

Las deficiencias metabólicas originan síntomas que varían en su severidad. En la actualidad, todos los Estados demandan la realización del screening para fenilcetonuria (PKU) e hipotiroidismo congénito (glándula tiroides inactiva), que originan retrasos mentales cuando no se tratan. En 2001, todos los Estados excepto Washington requirieron la evaluación para galactosemia, y todos excepto tres estados ofrecieron un screening para la hemoglobinopatía que ocasiona la enfermedad de células falciformes (151). Se encuentran disponibles otras pruebas de screeening metabólico y se las puede realizar basándose en el requerimiento del Estado en el que vivan o en la historia familiar, o para diagnosticar a un bebé sintomático. La realización de pruebas por Estado se realiza generalmente por elusión de sangre seca de tarjetas de papel de filtro estandarizadas (tarjetas Guthrie) preparadas dentro de las primeras horas de nacido el bebé, luego de la extracción de sangre por punción del talón (153-155).

Tabla VIII-1. Número de Estados (incluyendo el Distrito de Columbia) que realizan el screening de las condiciones metabólicas (151).

Las estadísticas de California en el período que va desde 1980 a 1997 (156) dan un ejemplo de la eficacia de la realización de las pruebas. A más de 8,5 millones de recién nacidos se los evaluó con las pruebas del programa de screening del recién nacido. Estas pruebas detectaron 2.664 casos de hipotiroidismo congénito primario, 320 casos de fenilcetonuria clásica (1 en 12.000) y 116 casos de galactosemia por deficiencia de transferasa. Desde que se inició el screening de las alteraciones de la hemoglobina, se han evaluado más de 4 millones de recién nacidos. Desde 1995 a 1997, se identificaron casi 1.000 casos de anemia drepanocítica y 131 casos de hemoglobinopatías clínicamente significativas fueron derivados para su seguimiento. En 1997, la Legislatura del Estado de California aprobó la Ley del Senado 537, autorizando oficialmente que se agreguen 17 alteraciones al programa actual. En la lista se incluyeron fibrosis quística, hiperplasia adrenal congénita, deficiencia de biotinidasa así como una variedad de aminoacidopatías y de alteraciones de la oxidación de ácidos grasos.

Screening y pruebas de confirmación

En los distintos Estados se realizan pruebas que incluyen tanto screenings como pruebas de confirmación. La realización de algunas de las pruebas puede externalizarse pidiéndoselas a laboratorios que tienen contratos con el Estado. Los laboratorios de screening comprueban la posible presencia de algún defecto de nacimiento o de alguna alteración congénita. Cuando el resultado de alguna prueba es positivo, a la paciente se la deriva para una evaluación clínica definitiva que incluya la realización de una prueba de diagnóstico en un laboratorio confirmatorio. Los laboratorios confirmatorios realizan una batería de pruebas de diagnóstico para ayudar a determinar si en realidad se encuentra presente algún defecto de nacimiento o alguna alteración congénita (152-156).

Metodologías

Las pruebas de screening se realizan sobre especímenes de manchas de sangre seca extraídas de recién nacidos. Dependiendo de la prueba en particular, se utilizan distintos métodos estándar y novedosos entre los que se encuentran análisis colorimétricos, inmunoensayos, HPLC, fluorométricos, PCR o métodos de ADN alternado. Una de las técnicas que está ganando cada vez más aceptación es la espectrometría de masas en tandem (MS/MS), que puede detectar hasta 30 enfermedades específicas. Unos pocos hospitales ofrecen esta prueba para todos los padres aunque en la mayoría de los casos, éstos deben pedir que se realice este screening, que es extensivo pero relativamente barato.

Interés del Congreso

En los Estados Unidos, se convocó un comité del Congreso para realizar una supervisión nacional de los aspectos que rodean al screening neonatal. En este informe, el Comité exigió que los servicios de screening de recién nacidos estén disponibles y sean accesibles para aplicar las recomendaciones de salud pública y así ampliar las estrategias efectivas. A la HRSA, en colaboración con los CDC y la NIH, se le pidió que implementara una estrategia para evaluar y ampliar los programas de screening de recién nacidos, los proyectos de demostraciones piloto, y el uso de recomendaciones de salud pública contemporánea en afecciones específicas, tales como fibrosis quística y síndrome del cromosoma X frágil. El Comité, además, indicó que "se tomen medidas tangibles para proteger la privacidad del paciente y para prevenir discriminación basada en la información derivada de los screenings."
La Fuerza de Trabajo de Screening del Recién Nacido fue convocada por la Academia Norteamericana de Pediatría (AAP) y financiada por el Bureau de Salud Materno-Infantil, la Administración de Recursos y Servicios de la Salud (MCHB, HRSA). En el resumen de recomendaciones de la Fuerza de Trabajo de la Academia Norteamericana de Pediatría (AAP) se incluyen las siguientes (154):
Usar un enfoque de sistemas -no sólo la realización de la prueba.
• Seguir guías aceptadas.
• Coordinar e integrar los programas y los datos.
• Pilotear las pruebas nuevas.
• Monitorear el desempeño y evaluar el programa.
• Involucrar e informar a los padres.
• Convocar a un grupo de ayuda a nivel estatal.
• Salvaguardar las muestras de sangre.
• Otorgar la adecuada financiación para pruebas, diagnóstico y tratamiento.

Pruebas para afecciones específicas detectables en el recién nacido

Hipotiroidismo congénito (154)(156)(157). El hipotiroidismo congénito ocurre debido a un mal funcionamiento del desarrollo de la glándula tiroides (ya sea su ausencia por completo [aplasia], desarrollo glandular parcial [hipoplasia], o una localización ectópica) que da lugar a insuficiente producción de tiroxina, siendo ésta la hormona primaria reguladora del crecimiento, necesaria para el correcto desarrollo del sistema nervioso. La ausencia de esta hormona ocasiona crecimiento lento y retardo mental. Éste último puede evitarse si se realiza detección y tratamiento con suplementos tiroideos dentro de los primeros días de vida. El hipotiroidismo congénito no tratado es la causa más común de retardo mental y afecta a casi 500 recién nacidos por año en los Estados Unidos.

Pruebas realizadas. El screening consiste en la medición de tiroxina total (T4), de la hormona estimuladora de tiroides (TSH) o de ambas. El punto de corte para la T4 total varía, dependiendo del programa y de la variabilidad de la imprecisión del fabricante en las concentraciones bajas necesarias para detectar los especímenes presuntamente positivos en muestras de sangre seca lavada.

Limitaciones del screening de hipotiroidismo congénito. La prueba de tiroides mide la cantidad de hormona que se encuentra presente cuando se extrae la sangre. En el momento del nacimiento, las hormonas tiroideas de la madre se encuentran presentes en la circulación del bebé. La presencia de las hormonas tiroideas de la madre puede ocultar el bajo nivel de hormonas tiroideas del bebé. Si al bebé se le da el alta inmediatamente después del parto, no se le da suficiente tiempo para que las hormonas tiroideas de la madre desaparezcan de su circulación. Para poder diagnosticar de manera más precisa un hipotiroidismo congénito, se recomienda que el espécimen se recoja entre los dos y los seis días de vida. La gran mayoría de los recién nacidos con hipotiroidismo congénito son detectados con el primer espécimen, pero los médicos deberían mantenerse alertas a un desarrollo de síntomas clínicos a pesar de un screening inicial normal. La causa más significativa de un resultado inicial falso-positivo para hipotiroidismo congénito es que se hayan recogido especímenes de recién nacidos con menos de 24 horas de vida. Las mejoras que se han realizado recientemente a la formulación de ensayos parecen haber reducido significativamente los resultados iniciales falso-positivos.
Si al bebé se le da el alta antes de las 48 horas de vida, la prueba de tiroides debería realizarse lo más cerca posible a la fecha del alta, pero no después de los siete días de vida. Si la sangre del bebé se hubiera extraído antes de sus 12 horas de vida, se debería analizar un segundo espécimen antes de las dos semanas.

GUÍA 35: Prueba de tiroides para recién nacidos.
Los fabricantes deberían proveer ensayos de tiroides que sean compatibles con la prueba de manchas de sangre seca lavada.

Recién nacidos prematuros. En algunos recién nacidos prematuros, un efecto fisiológico transitorio que se debe a la inmadurez del eje hipotalámico-pituitario origina resultados de TT4 bajos con una concomitante TSH elevada. Tales observaciones requieren de un monitoreo exhaustivo para garantizar que los niveles de T4/TSH se acerquen a los valores normales de los recién nacidos maduros.

Fenilcetonuria (PKU). La PKU es la anomalía genética más corriente en los Estados Unidos, en donde 1 de cada 50 individuos porta ese gen, y donde 1 de cada 15.000 bebés resulta positivos. La PKU es una deficiencia autosómica recesiva de la enzima fenilalanina hidrolasa, que previene la conversión del aminoácido esencial fenilalanina en tirosina, utilizando tetrahidrobiopterina como cofactor. El metabolismo normal de la fenilalanina resulta en una concentración en suero entre 30 µM y 180 µM (0,5-3 mg/dL). Cuando los individuos afectados consumen alimentos altos en proteínas como leche (inclusive la formula infantil), carne, huevos y queso, la fenilalanina se acumulará en sangre, en orina y en el sistema nervioso central. La fenilanina abunda en estos alimentos con alto contenido de proteínas y es el componente predominante del endulzante artificial, aspartamo. La herencia de PKU origina retrasos en el desarrollo, apoplejía, olor ácido y retardo mental severo, si no se la detecta y se la trata de manera temprana. Ha resultado ser efectivo restringir la dieta en fenilalanina y controlar los niveles en suero para así tratar esta afección, si se comienza a hacerlo lo antes posible y antes de las cuatro semanas de vida. El tratamiento debe continuar a lo largo de toda la vida del paciente (154).

PKU materna e hiperfenilalanina. Con el advenimiento de los programas de screening en los últimos 40 años, más mujeres con PKU expresada en forma homocigota han llegado a la edad de procrear. Tales mujeres no debidamente controladas respecto a la PKU pueden desarrollar un mayor riesgo de aborto espontáneo; más del 90% de sus hijos exhiben retrasos del desarrollo intrauterino, microcefalia, retraso mental y/o defectos cardíacos congénitos. Estos recién nacidos muestran un aumento transitorio de los valores de PKU, que luego bajan a la normalidad dentro de las 24 horas de vida. Las madres con PKU deberían mantener los niveles de fenilalanina entre 120 y 360 µM para evitar daños al feto en desarrollo.

Limitación de la prueba de PKU. La recolección de una insuficiente cantidad de espécimen afectará el resultado de la prueba. Los especímenes para la realización de la prueba deberían ser extraídos de niños de más de 24 horas de vida y menores de 7 días. Realizar en screening antes de las 24 horas de vida puede arrojar resultados inexactos. Entre las causas que ocasionan falsos positivos para PKU se encuentran la prematuridad y la alimentación parenteral.

Fibrosis quística. La fibrosis quística es una alteración autósomica recesiva que está caracterizada por la disfunción de varios sistemas exócrinos. La incidencia de la fibrosis quística es de 1 en 2.500 recién nacidos caucásicos. Sin embargo, es bastante más baja entre otros grupos étnicos (154).
Inicialmente se puede presentar en el periodo neonatal con íleo meconial o posteriormente en la infancia o niñez con problemas de crecimiento, mala absorción o malnutrición y/o enfermedad pulmonar. La severidad de los síntomas es variable. Generalmente se desencadena la muerte entre la segunda y la cuarta década de vida debido a enfermedad pulmonar obstructiva y a infección.

Pruebas de laboratorio. La elevación del tripsinógeno inmuno-reactivo (IRT) en una mancha de sangre seca es el método corriente de screening para FC. Se sabe que se presentan falsos positivos y falsos negativos; los falsos negativos se presentan más frecuentemente en neonatos con íleo meconial.

Consideraciones para la práctica del screening (Tabla VIII-2). Los aumentos de tripsinógeno disminuyen luego de los primeros meses de vida, por eso aunque no sea decisivo el momento exacto de la extracción del espécimen en el período neonatal, la extracción de la segunda muestra para el seguimiento de un screening inicial anormal debería realizarse no antes de los 21 días, para evitar un número mayor de falsos positivos, y no luego de 60 días para reducir el riesgo de falsos negativos. El uso de la prueba de IRT en recién nacidos mayores y en niños no se recomienda; sin embargo, sí está recomendada la realización de una prueba de sudor si se sospecha CF en este grupo de mayor edad. Es esencial que la prueba de sudor la realice personal entrenado específicamente en un método exacto para hacer un diagnóstico apropiado de fibrosis quística.


Tabla VIII-2. Ejemplos de árbol de decisión para prueba de fibrosis quística en tres Estados (de los Estados Unidos de América).

Galactosemia. La prueba de galactosemia se realiza en los 50 Estados de los Estados Unidos y además en el Distrito de Columbia. Es una alteración autosómica recesiva con una incidencia de 1 en 60.000 a 1 en 80.000 para la deficiencia enzimática más común GALT (galactosa-1-fosfato uridil transferasa) que previene la descomposición de galactosa en glucosa. Otras deficiencias enzimáticas como las de galactoquinasa y/o uridina-disfosfatogalactosa-4-epimerasa son menos comunes. Los bebés que heredan esta alteración no pueden metabolizar la galactosa del azúcar que se encuentra en la leche, la leche materna, la fórmula y otros alimentos. Dentro de las primeras dos semanas de vida, los recién nacidos no tratados que hayan nacido con esta afección sufren vómitos, enfermedad hepática, retardos mentales, cataratas, e imposibilidad de desarrollarse. Se puede presentar sepsis por E. coli y ocasionar la muerte si no se la detecta de manera temprana. El tratamiento recomendado para galactosemia es una dieta libre de leche que puede mejorar el pronóstico.

Prueba. Pueden detectarse niveles de galactosa elevados utilizando una prueba microbiológica de E. coli, pero la mayoría de los laboratorios de screening usan una combinación de prueba de fluorescencia de Buetler para deficiencia de GALT y/o una prueba fluorómetrica para galactosa (Prueba de Hill).

Limitación de screening de galactosemia. La prueba no detecta portadores. Los pacientes que hayan recibido transfusiones probablemente tengan niveles adecuados de enzimas durante dos o tres meses, dificultando una detección. Para la galactosemia, la causa más común de falsos positivos ha sido la desnaturalización de la enzima por calor durante el transporte (154).

Hemoglobinopatías. Los recién nacidos con enfermedad de células falciformes u otras hemoglobinopatías son altamente susceptibles a infecciones virales y bacterianas que aumentan de manera pronunciada la morbilidad y la mortalidad. El screening neonatal para hemoglobinopatías es de rutina en los Estados Unidos y en muchos otros países debido a que el diagnóstico y el tratamiento tempranos (por ejemplo, uso profiláctico de penicilina) mejoran tanto la supervivencia como los resultados a largo plazo (154).

Deficiencia de biotinidasa. La biotinidasa es una enzima que libera el cofactor esencial biotina de su forma ligada para que el organismo pueda utilizarla. La deficiencia de la enzima en suero da por resultado el incorrecto funcionamiento de otros sistemas enzimáticos, que llevan a daño neurológico irreversible. Esta alteración autosómica recesiva tiene una incidencia estimada de 1 en 60.000 nacimientos (154).

Tipo de prueba. Se realiza un ensayo colorimétrico para biotinidasa en una mancha de sangre seca. Los recién nacidos y los niños afectados tienen de 0% a 10% de la actividad normal del adulto. Los niveles que se encuentran entre 10% y 30% de la actividad normal media se consideran deficiencia de biotinidasa parcial.

Tiempo. Se desconoce cuál es el tiempo óptimo para la realización de la prueba. Se ha demostrado deficiencia enzimática en sangre del cordón umbilical; por lo tanto, se anticipa que cualquier espécimen obtenido luego del nacimiento es adecuado. En la mayoría de los pacientes los síntomas no se han desarrollado antes de los dos meses de vida, pero un paciente resultó sintomático a las tres semanas. Por lo tanto, probablemente se necesite tiempo de respuesta rápida. La edad media al comienzo de los síntomas es de cinco a seis meses.

Estabilidad del espécimen. Las muestras conservadas durante más de 18 meses a temperatura ambiente o mayor no tuvieron actividad detectable. La actividad se detectó en muestras de menos de 18 meses de edad. Las muestras analizadas 1, 30, y 60 días luego de la extracción se mantuvieron estables. Los especímenes son estables congelados a -70 ºC durante 3 años; las muestras congeladas a temperaturas superiores (-20 ºC) pueden perder actividad, lo cual puede dar lugar a un diagnóstico inapropiado de deficiencia parcial.

Confirmación. Se puede utilizar tanto un ensayo colorimétrico como otro más sensible para confirmar los resultados del screening. Sobre la base de las familias que se estudiaron hasta la actualidad, se pueden detectar los heterozigotos (portadores) de los individuos afectados y normales con una precisión de 90-95%.

Precisión de la prueba de screening. La tasa de falsos negativos es desconocida. Pueden presentarse resultados falsos negativos raros (<1%) con el uso de sulfonamidas. Se deberían controlar las muestras analizadas luego del período de recién nacido para detectar la presencia de sulfonamidas. Se desconoce la tasa de falsos positivos.

Estudios en curso. En el Medical College de Virginia, Barry Wolf inició un programa piloto de screening. El screening también se está llevando a cabo en 15 países en todo el mundo. Se está trabajando para poder realizar el seguimiento de los casos de screening. Se necesita información relativa a la incidencia, la historia natural, la eficacia del tratamiento (incluyendo la evaluación de pacientes de más edad, previamente asintomáticos), parámetros para un tratamiento óptimo y heterogeneidad de la alteración.

Hiperplasia adrenal congénita. La hiperplasia adrenal congénita (HAC) incluye un grupo de alteraciones autosómicas recesivas, cada una de las cuales se caracteriza por una deficiencia en una de las enzimas necesarias para transformar colesterol en cortisol (hidrocortisona) (Tabla VIII-3). Estas enzimas son la 20,22-hidroxilasa; 3-hidroxiesteroide-deshidrogenasa; 17-hidroxilasa; 21-hidroxilasa; y 11-hidroxilasa. La incidencia en poblaciones seleccionadas varía de aproximadamente 1 en 10.000 a 1 en 25.000 (154).
Un recién nacido afectado está caracterizado por la hiperfunción y el mayor tamaño (hiperplasia) de las suprarrenales, de ahí el nombre de hiperplasia adrenal congénita. Entre las distintas formas de HAC, la deficiencia de la 21-hidroxilasa es la más frecuente, representando más del 90% de todos los casos. La forma más severa de deficiencia de la 21-hidroxilasa está asociada con la pérdida de sal. La incapacidad de sintetizar cortisol da lugar a un aumento de ACTH y la síntesis de precursores de cortisol (es decir 17-hidroxiprogesterona y andrógenos). La producción de aldosterona se ve también impedida debido a la ausencia total de la 21-hidroxilasa. A pesar de que hay un aumento tanto de renina como de angiotensina, la producción de aldosterona sigue siendo baja o no existe. La no detección de un recién nacido de sexo masculino afectado puede llevar a muerte temprana dentro de las dos primeras semanas de vida.
La forma virilizante simple de la HAC está ocasionada por una deficiencia de la enzima 21-hidroxilasa. Debido a que la deficiencia de esta enzima es solamente parcial, estos sujetos pueden producir cantidades de cortisol cercanas a lo normal o normales a causa de un incremento de la producción de ACTH. Sin embargo, de manera similar a los pacientes que sufren pérdida de sal, los que padecen la forma virilizante simple experimentan un aumento de la producción de 17-hidroxiprogesterona así como de los andrógenos adrenales. La 17-hidroxiprogesterona elevada produce una tendencia a la pérdida de sal. Debido a que la deficiencia de la 21-hidroxilasa es parcial, las suprarrenales son capaces de incrementar la producción de aldosterona para compensar la pérdida de sal.
En ambas formas de HAC, la mayor producción de andrógenos suprarrenales es preocupante. El andrógeno suprarrenal más importante secretado en grandes cantidades es la androstenediona. Este esteroide no es androgénico en sí mismo. Sin embargo, aproximadamente el 10% de la androstenediona se metaboliza en el organismo a testosterona, un andrógeno potente. El exceso de producción de andrógeno durante la vida fetal, asociado con la HAC perdedora de sal y virilizante simple, masculiniza los órganos genitales externos de los recién nacidos de sexo femenino, lo que da lugar a una potencial clasificación errónea de un recién nacido de sexo femenino como varón.
La HAC de inicio tardío se refiere a la deficiencia moderada de la 21-hidroxilasa, que se manifiesta con una producción excesiva de andrógenos en la niñez o adolescencia. Mientras que la deficiencia parcial hace posible la producción compensada de cantidades normales de cortisol y aldosterona, los individuos afectados producen mayores cantidades de precursores de cortisol (17-hidroxiprogesterona) y andrógenos suprarrenales. Tanto en varones como en mujeres, esto da por resultado un rápido crecimiento y una virilización temprana. En las mujeres, esto también puede dar origen a masculinización y menstruaciones anormales.


Tabla VIII-3. Características de tres tipos de Hiperplasia Adrenal Congénita (HAC).

Tipo de prueba. Se puede realizar el inmunoensayo enzimático o el radioinmunoensayo por medición de 17-OHP en la deficiencia de 21-hidroxilasa en manchas de sangre seca.

Tiempo. Un aumento de 17-OHP se encuentra presente en el nacimiento, a pesar de que los niveles obtenidos antes de las 24 horas de vida pueden ser fisiológicamente altos. Probablemente se necesite un tiempo de respuesta rápida para detectar a los niños y a aquellas niñas no virilizadas que no hayan sido detectadas y que puedan presentar crisis suprarrenales de comienzo temprano y pérdida de sal. Los recién nacidos prematuros pueden tener resultados falsos- positivos de la prueba. El screening en las primeras 48 horas puede incrementar la tasa de falsos- positivos, pero se necesitan más estudios. El screening en la primera o segunda semana de vida detecta algunos casos adicionales de HAC virilizante simple y números mayores de forma no clásica de deficiencia de 21-hidroxilasa.

Estabilidad del espécimen. No se ha producido la descomposición de 17-OHP luego de períodos de hasta 30 días en muestras de sangre seca en papel de filtro almacenadas a temperatura ambiente.

Confirmación. Muchas firmas comerciales tienen disponible la medición cuantitativa de 17-OHP en plasma. Se necesita una muestra de sangre relativamente pequeña.

Precisión de la prueba de screening. La tasa de falsos negativos es baja y la prueba de screening detecta la mayoría de los casos (95%) de deficiencia de 21-hidroxilasa. Con un screening inicial de más de 65 ng/mL, se puede no detectar un 3% de perdedores de sal si el screening se realiza antes de las 24 horas de vida.
La tasa de falsos positivos varía de 0,2% a 0,5%, dependiendo del nivel de corte seleccionado. La reacción cruzada de los compuestos esteroides relacionada con 17-OHP depende del antisuero utilizado en los inmunoensayos de esteroides y de si ha sido incluida en el protocolo de la prueba la extracción con solvente orgánico (154).

GUIA 37: Calidad de la prueba de screening del recién nacido.
Para una óptima detección de screening y un óptimo resultado, los bebés no deberían ser dados de alta del hospital antes de que los especímenes para el screening demuestren de manera precisa las concentraciones de las sustancias que se analizan bajo los estatutos del organismo gobernante.

SECCIÓN IX

Avances en el screening neonatal utilizando MS/MS

La espectrometría de masas como técnica analítica se ha utilizado durante muchos años en aplicaciones de investigación cualitativa y cuantitativa. Generalmente, las aplicaciones para compuestos biológicos implicaban el uso de cromatografía de gases para separar los compuestos de interés, antes de la inyección en un espectrómetro de masas y su posterior análisis. La GC/MS constituye típicamente un proceso lento que no se presta bien a aplicaciones de screening de masas. Con el desarrollo de la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) estas dificultades se superaron y fue posible realizar un análisis que resultaba ser rápido y también sensible. Inicialmente se utilizó este análisis para pruebas clínicas específicas, para medir los ésteres de carnitina en sangre y orina de niños que tienen diagnóstico presuntivo de errores innatos del metabolismo (158).
La espectrometría de masas separa y mide la relación masa a carga (m/z) de los iones que se han producido por fragmentación de las moléculas originales en la cámara de ionización del espectrómetro de masas. Las técnicas más comunes consisten en separar las sustancias que van a medirse en un cromatógrafo de gases, y luego fragmentar y medir en un espectrómetro de masas simple. El espectrómetro de masas en tándem usualmente consiste en un par de espectrómetros de masas analíticos cuadrupolos separados por una cámara de reacción o celda de colisión. (En la mayoría de los instrumentos la celda de colisión es en realidad un tercer cuadrupolo).
La sustancia que va a ser analizada sufre un procedimiento de ionización suave (ej. bombardeo atómico rápido o electrospray) para crear iones causimoleculares. Luego se inyecta la sustancia en el primer cuadrupolo lo cual separa a los iones iniciales uno del otro. Los iones pasan (en orden de relación m/z) a la cámara de reacción o celda de colisión, donde quedan sujetos a una fragmentación controlable por colisiones con gases inertes (como el argón o el helio). Estos fragmentos de los iones iniciales luego pasan al segundo cuadrupolo analítico donde se los analiza de acuerdo con las relaciones m/z de los fragmentos.
La ionización por electrospray es una técnica de "ionización suave" que permite realizar el análisis directo de sustancias biológicas con peso molecular alto tales como las proteínas, previamente consideradas no-candidatas para la espectrometría de masas. Los compuestos pueden detectarse y cuantificarse directamente a partir de la solución ya que no hay necesidad de volatilizar la muestra. Esta técnica ofrece una excelente baja sensibilidad (límites de detección de fentomoles). Debido a que los compuestos en la mezcla se separan por medio de espectrometría de masas y no por medio de cromatografía, el proceso en su totalidad, desde la ionización e inyección de la muestra hasta que se obtiene la información en la computadora, lleva solamente unos segundos.
Los datos obtenidos por la computadora se pueden analizar de distintas maneras. Se puede utilizar un modo de ión original para obtener una gama de todos los iones iniciales que se fragmentan para producir un ión hijo en particular; o un modo de pérdida neutral para obtener una gama de todos los iones originales que pierden un fragmento neutral común. Además, estas funciones de scanning se pueden cambiar muchas veces durante el análisis para que se puedan detectar y medir butil ésteres de acilcarnitinas (por medio del ión testigo a m/z 85) y los ésteres butil de alfa aminoácidos (por medio de la pérdida de un fragmento neutro 102) en la misma muestra.
La MS/MS permite que se realicen mediciones precisas, muy rápidas, sensibles y con los estándares internos apropiados de muchos tipos diferentes de metabolitos, con una mínima preparación de la muestra y sin separación cromatográfica previa. Debido a que muchas amino-acidemias, acidemias orgánicas y alteraciones de la oxidación de ácidos grasos pueden detectarse en uno o dos minutos, el sistema tiene un procesamiento adecuado para manipular el gran número de muestras que se procesan en los programas de screening del recién nacido (159). Algunas de las afecciones que pueden diagnosticarse por MS/MS se presentan en la lista de la Tabla IX-I, junto con el o los compuestos sobre los que se basa el diagnóstico (160-165).
Es importante notar que la MS/MS no puede reemplazar a los programas corrientes que detectan deficiencia de biotinidasa, hipotiroidismo, hemoglobinopatías, hiperplasia adrenal virilizante y galactosemia; estas afecciones no pueden ser identificadas por medio de MS/MS hasta el momento y deben ser detectadas por medio de otros métodos.


Tabla IX-1. Algunas alteraciones detectables por medio de Espectrometría de Masas en Tandem (158) (160-165).

SECCIÓN x

Recomendaciones para la medición de ácidos orgánicos en orina

La medición de ácidos orgánicos en orina es un importante componente en la investigación de la enfermedad metabólica heredada. De utilizarse de manera correcta, este ensayo es capaz de identificar perfiles metabólicos anormales que se presentan en aproximadamente 150 alteraciones genéticas bien diferenciadas. Un número significativo de enfermedades metabólicas puede identificarse solamente usando este procedimiento. El diagnóstico precoz antes de que se produzcan episodios recurrentes de descompensación metabólica es muy probable que redunde en mayores beneficios para el paciente en el caso de varias alteraciones. Para otras afecciones que en la actualidad no son tratables, el diagnóstico precoz posibilita que se proporcione asesoramiento genético antes de que se dé a luz a más de un hermano afectado.

GUIA 38: Análisis de ácidos orgánicos en orina.
El análisis de ácidos orgánicos en orina, utilizando los procedimientos identificados más adelante, debería estar a disposición de todos los pacientes (niños y adultos) en los que se sospeche enfermedad metabólica.

Preocupaciones preanalíticas

Tiempo de toma de la muestra. Muchas alteraciones del metabolismo de ácidos orgánicos se presentan con perfiles metabólicos anormales en todos los grados de severidad clínica. Estas alteraciones deberían poder identificarse muy fácilmente en los pacientes afectados independientemente del momento de la toma de la muestra. Sin embargo, algunas alteraciones del metabolismo de la energía solamente presentan perfiles de ácidos orgánicos anormales durante los períodos de descompensación metabólica.

Terapias actuales. Ciertas modalidades terapéuticas pueden producir perfiles de ácidos orgánicos en orina que pueden enmascarar una enfermedad metabólica. Entre las interferencias terapéuticas se puede poner como ejemplo el tratamiento de ciertos ataques con ácido valproico y suplementación calórica con triglicéridos de cadena media. Si se identifica una etiología infecciosa o toxicológica aceptable para la presentación aguda, probablemente no sean necesarios estudios metabólicos como el análisis de ácidos orgánicos en orina.

Conservación de la muestra. Los ácidos orgánicos en orina se mantienen estables durante largos períodos de tiempo (varios años) si se los conserva a -70 °C y durante varios meses a -20 °C.

GUIA 40: Conservación de la muestra.
Las muestras deberían conservarse a -20 °C antes del análisis a menos que éste sea inmediato, en cuyo caso no será necesario congelarla.

Preocupaciones analíticas. El único método aceptable de análisis para ácidos orgánicos en orina es el de cromatografía de gases-espectrometría de masas.

Preparación de las muestras. Un volumen de orina descongelada cuidadosamente mezclada, equivalente a una cantidad constante de creatinina, se alicuota para la extracción. Típicamente es el volumen equivalente que contiene alrededor de 1-2 µmol (0,1-0,2 mg) de creatinina. Para la mayoría de las muestras esto da por resultado entre 0,5 y 3,0 mL de orina para extraer. Para valores extremos de concentración, se recomienda que el volumen mínimo a extraerse sea de 0,5 mL y el máximo de 3,0 mL.
A este volumen de orina se le agrega un volumen fijo de estándar interno. También es aceptable alicuotar una cantidad fija de orina y agregarle una cantidad variable de estándar interno para lograr la misma proporción de los dos componentes. El estándar interno elegido no deberá ser un metabolito que pueda ser detectado en orina normal o patológica, ni tampoco deberá co-cromatografiarse con metabolitos significativos. Entre los estándares internos típicos se encuentran el ácido heptadecanoico, el ácido 2-fenilbutírico y el ácido dimetilmalónico. Debería elegirse la concentración final del estándar interno para generar un pico sobre el cromatograma de iones totales que sea similar en altura al ácido orgánico detectado en mayor cantidad.

Oximación. El agregado de un reactivo de oximación como el hidrocloruro de etoxilamina sirve para preservar los cetoácidos que se encuentran presentes en la orina. Entre los cetoácidos importantes se incluyen los ácidos 2-cetoisocaproico, 2-ceto-3-metilvalérico, y 2-cetoisovalérico presentes en la enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce. Cuando no hay oximación, una proporción importante de cetoácidos se convierte en el correspondiente 2-hidroxiácido. El ácido 2-hidroxiisovalérico es un indicador importante de enfermedad de jarabe de arce en orina, que se puede identificar de manera rápida en muestras de orina no-oximadas.

Método de extracción de la muestra. La orina y el estándar interno deberían ser acidificados a pH 1-2 y extraídos en un volumen igual de un solvente orgánico. Es muy común el empleo de la extracción en etil acetato. La muestra puede extraerse hasta tres veces para mayor eficiencia. El agregado de cantidades saturantes de cloruro de sodio antes del proceso de extracción puede reducir la eficacia de la extracción de la urea, lo que puede interferir con la identificación de otros ácidos orgánicos. También se ha empleado exitosamente la extracción en fase sólida utilizando minicolumnas de ácido salicílico para la extracción de las muestras. Recomendamos que aquella información relativa a todas las terapias concurrentes sea presentada junto con la orden para que el paciente se haga el análisis de ácidos orgánicos en orina.

Método de derivatización de la muestra. La mayoría de las bases de datos de espectros de ácidos orgánicos se realizan a partir de espectros generados de derivados trimetilsililados (TMS).

Cromatografía de gases -Espectrometría de masas

GUIA 41: Derivatización de los TMS.
Los derivados TMS de la extracción de ácidos orgánicos urinarios deben prepararse para el análisis de GC-MS.

Calibración del instrumental. Es crucial para la asignación de masas asegurarse de que el instrumental sea calibrado regularmente. La mayoría de los sistemas comerciales de GC-MS tienen capacidad de auto calibración.

GUIA 42: Calibración del instrumental GC-MS.
Se deberá realizar un auto-calibrado de la instrumentación diariamente.
Se deberá continuar con el análisis solamente si la calibración se corresponde con las especificaciones dadas por el fabricante del instrumental.

Elección de la columna. Se utiliza una variedad de columnas capilares de GC para separar los ácidos orgánicos con una eficacia equivalente de separación. Las columnas tienen generalmente 25-30 metros de largo, 0,2-0,5 mm de diámetro interno y están recubiertas con una capa de 0,1-1,0 µm de una capa líquida comparable de OV1, OV5 u OV17. Cada fabricante tiene su marca comercial registrada. Si se sobrecarga una columna se puede dificultar la identificación del pico.

Condiciones corrientes. Es importante tener una rampa de temperatura para eluir los ácidos orgánicos de volatilidad baja. Las siguientes son las temperaturas típicas y recomendadas para GC: puerto de inyección 240-250 °C, temperatura inicial del horno 70-100 °C; rampa de temperatura 3-8 °C por minuto; temperatura final del horno 270-295 °C.

GUIA 44: Temperatura de la columna.
La temperatura de la interface del espectrómetro de masas deberá ser igual o mayor que la temperatura más alta de la columna.
La temperatura inicial del horno, la tasa de la rampa de temperatura y la temperatura más alta determinarán el tiempo total de corrida, que generalmente es de 30-60 minutos.

Obtención de datos. La obtención de datos en el espectrómetro de masas no deberá empezar a hacerse hasta que el frente de solvente vuelva a la línea de base. Entonces los datos deberán ser obtenidos en el modo scan con una medición a escala completa cada 0,5 segundos.

GUIA 45: Obtención de datos.
Dependiendo del rango de masas del espectrómetro de masas, el rango de los iones escaneados deberá ser de m/z 50 a m/z 500-650. Estos datos deberán presentarse como un cromatograma de iones totales.

Identificación del pico. Los picos deberán identificarse tanto por el tiempo de retención como por la coincidencia espectral en una biblioteca apropiada de espectros derivativos de TMS. La correspondencia espectral deberá ser mayor que 80% en presencia de un pico co-cromatrografiante conocido para poder proporcionar una identificación positiva. Se encuentran disponibles varias bibliotecas comerciales a la venta pero se recomienda que los centros que miden los ácidos orgánicos urinarios compongan sus propias bibliotecas sobre la base de la experiencia y la disponibilidad de muestras de pacientes con acidurias orgánicas.

Calibración. El sistema analítico deberá ser calibrado utilizando una solución de ácidos orgánicos múltiples de concentración conocida que se eluyan en distintos puntos durante la corrida cromatográfica.

GUIA 46: Calibración.
Se recomienda que se utilicen de 10 a 15 analitos en esta mezcla de calibrador y que sean compuestos significativos de interés diagnóstico.
Las curvas que abarcan el rango reportable para un analito deberán generarse a intervalos frecuentes.

Interpretación de datos. En relación al análisis de datos cuantitativos frente al análisis de datos cualitativos: algunos laboratorios ofrecen informes extensivos cuantitativos, mientras que otros generan una interpretación cualitativa. No existe consenso en relación a qué formato es el más favorable.
Para la realización de los informes cuantitativos, la mayoría de los analitos se cuantifican como una relación de iones única para ese compuesto contra un ión específico para el estándar interno.

GUIA 47: Para concentraciones de ácidos orgánicos menores que 100 mmol/mol creatinina:
La cuantificación deberá ser por espectrometría de masas de proporción isotópica utilizando estándares internos estables con etiquetas de isótopos.

La obtención de datos con este propósito deberá hacerse en el modo del ión seleccionado, utilizando al menos dos iones tanto para el estándar interno como para el compuesto nativo. Es esencial tener experiencia en la interpretación de informes cuantitativos y cualitativos. La rareza de varias acidurias orgánicas implica que muy pocos laboratorios tienen una experiencia importante.

GUIA 48: Desafíos de la especialización
Los laboratorios que miden ácidos orgánicos en orina deberían participar de actividades de especialización como por ejemplo CAP, y además también deberían intercambiarse sus muestras anormales con otros laboratorios para ganar en experiencia.

Identificación de componentes patológicos menores. Se reconoce que existen algunos componentes del ácido orgánico en la orina que tienen un valor diagnóstico crítico, pero que sólo se encuentran presentes en cantidades pequeñas, a menudo encubiertos por otros analitos. Estos componentes pueden identificarse en un cromatograma de iones totales si se investigan los iones seleccionados. Los compuestos que deberían buscarse en todos los cromatogramas de ácidos orgánicos serían los siguientes, entre otros:
1. n-hexanoilglicina, un marcador importante de deficiencia acil CoA deshidrogenada de cadena media.
2. Etilmalonato, un marcador para alteraciones múltiples, frecuentemente en co-cromatografías con fosfato, que es desde el punto de vista cuantitativo, un compuesto más significativo.
3. Acido orótico, un marcador para un número de alteraciones del ciclo de la úrea, con co-cromatografías frecuentes con aconitato.
4. 4-hidroxibutirato (gama hidroxibutirato), un marcador para deficiencia de succínico semialdehido deshidrogenasa.
5. 3-hidroxiglutarato, un marcador para acidemia glutárica tipo 1.

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