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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. v.42 n.1 La Plata ene./mar. 2008

 

PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DE CALIDAD

Influencia de las variables preanalíticas en la determinación de proteína S

Influence of preanalytical variables in S protein determination

Cristina Duboscq1, Lucía Kordich2

1. Dra. en Ciencias Químicas. UBA. Servicio de Hematología y Hemoterapia, Hospital Británico de Buenos Aires. Coordinadora del Subprograma Hemostasia del Programa de Evaluación Externa de Calidad de la Fundación Bioquímica Argentina.
2. Dra. en Ciencias Químicas Profesora del Dpto. Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires. Coordinadora del Subprograma Hemostasia del Programa de Evaluación Externa de Calidad de la Fundación Bioquímica Argentina.

Resumen

La proteína S (PS) regula el sistema de coagulación mostrando actividad de cofactor de la Proteína C activada (PCa) con la cual forma un complejo equimolecular. En presencia de iones calcio este complejo inactiva por proteólisis los factores V y VIII activados por trombina. La proteína S plasmática circula 40% libre (fracción que presenta actividad de cofactor de la PCa) y 60% unida al C4-BP (proteína ligante de la fracción C4 del complemento). El objetivo fue comparar el dosaje de PS realizado por método coagulable e inmunoturbidimétrico e investigar cómo las variables preanalíticas afectan los niveles de PS determinados. Se obtuvieron los siguientes resultados: método coagulable: CV intra ensayo: (n=20): 4%, CV interensayo (n=20, 3 días): 3,4%. Método inmunoturbidimétrico: CV intraensayo (n=20): 3,7%.CV Inter. ensayo (n=20,3 días): 4,5%. Existe buena correlación (R2=0,94) entre ambos métodos, cuando la calibración por el método coagulable se realiza en la misma corrida analítica que las muestras. Cuando se realizó el estudio de Bland y Altman los dos métodos mostraron ser comparables en todos los niveles de PS estudiados. No se observaron diferencias significativas entre las muestras determinadas frescas y conservadas a -20 y -80 °C descongeladas solo una vez.

Palabras clave: Proteína S; Proteína S libre; Variables preanalíticas

Summary

Protein S has an essential anticoagulant function acting as activated Protein C cofactor and forming an equimolecular complex with it. In the presence of calcium this complex regulates the coagulation process inactivating thrombin activated factors V and VIII by proteolysis. In plasma there are two different forms: a) free Protein S which acts as the cofactor of activated protein C (representing about 40% of total Protein S) and b) C4-BP(C4 binding protein) bound protein S which exhibits no activity as cofactor of activated Protein C (representing about 60% of total PS). The objetive was to compare the PS dosage determination by two methods: immunoturbidimetric and clotting, and to investigate how pre-analytical variables affect the results. The following results were obtained: Clotting method: CV intra assay: (n=20): 4%, CV interassay (n=20, 3 days): 3.4%; immunoturbidimetric method CV intra assay (n=20): 3.7%: CV inter assay (n=20.3 days): 4.5%. There is a good correlation (R2 = 0.94) between both methods; when the clotting method is calibrated in batch with the samples. There is significant difference between fresh and frozen ( -20 °C and -80 °C) samples when the latter have been desfrozen only once.

Key words: Protein S; Free protein S; Prenalytical variables

INTRODUCCIÓN

La proteína S (PS) forma parte de uno de los mecanismos regulatorios del sistema de coagulación: el sistema de la proteína C (PC). Este sistema está integrado por la proteína C (PC), la proteína S, trombomodulina (TM) y el receptor endotelial de la PC (EPCR) (1-5). El sistema de la PC ejerce su efecto inhibitorio sobre el sistema de coagulación regulando la actividad del FVIIIa y el FVa, lo cual provee una regulación específica y altamente eficiente de la coagulación sanguínea (3). La importancia fisiológica del sistema de la PC está demostrada por la severa trombosis, denominada purpura fulminans, que afecta al neonato con deficiencia homocigota de PC. En los últimos años también se ha demostrado un efecto antiinflamatorio y antiapoptótico de la PC (3).
La proteína S aislada y purificada por Di Scipio en Seatle en 1977, es una glicoproteína de una sola cadena vitamina K-dependiente de 70 Kd; se sintetiza en hígado, células endoteliales, megacariocitos, osteoblastos y células musculares lisas de la vasculatura. Está codificada en el cromosoma 3 (región 3q11.2). La actividad de PS es especifica de especie. La función anticoagulante de la PS está dada por su capacidad de ser cofactor de la PCa en la inactivación del FVIIIa y FVa (3-4). Solo el 40% de la PS total tiene actividad funcional (PS libre) ya que el 60% restante de la PS total está formando un complejo no covalente de alta afinidad con el C4b-binding protein (C4BP) y no presenta actividad de cofactor de la PC activada.
La PC activada (PCa) y la PS libre forman un complejo equi molecular en las superficies cargadas negativamente; la formación de este complejo incrementaría la afinidad de la PCa por las membranas celulares y se piensa que es uno de los mecanismos por el cual la PS aumenta la actividad de PCa en el proceso de inactivación del FVa y FVIIIa. Se ha demostrado además que, in vitro, la PS inhibe el complejo tenasa y protrombinasa. Otros estudios demuestran que regularía la fibrinólisis en la etapa inicial de formación del coágulo (1-5). Recientemente se ha sugerido que la PS regularía el sistema complemento y presentaría efectos anti-inflamatorios. Si bien estas otras funciones propuestas para la PS han sido demostradas in vitro todavía no se les ha asignado un rol fisiológico (4).
La concentración normal de PS es 20-25 µg. Los niveles plasmáticos de PS total son 80-120% en hombres y 72-120% en mujeres. Los niveles plasmáticos en las mujeres son menores que en el hombre y aumentan con la edad. La PS disminuye con el embarazo y los niños alcanzan los niveles de adultos a los seis meses.
La deficiencia hereditaria de PS fue reportada por primera vez en 1984; aparece en el 5 al 10% de pacientes con trombosis venosa idiopática.
Dos tercios de los pacientes con déficit de PS presentan un evento trombótico antes de los 35 años y aproximadamente el 50% de los pacientes tienen tromboflebitis.
Se hereda en forma autosómica dominante y los homocigotas pueden desarrollar púrpura fulminans en el período neonatal. Existen hasta el momento 131 mutaciones reportadas y existen variantes fenotípicas del mismo desorden genético.
La deficiencia hereditaria de PS debe ser clasificada, según las recomendaciones del Subcomité de Estandarización de la Sociedad Internacional de Hemostasia y Trombosis (ISTH, Munich 1991) (6).
La deficiencia de PS adquirida se observa en enfermedad hepática, coagulación intravascular diseminada, shock séptico, diabetes, tratamiento de anticoagulación oral e ingesta de anticonceptivos y existen algunos reportes que asocian un déficit de PS con síndromes inflamatorios.
Los niveles plasmáticos de PS se pueden determinar por métodos funcionales (sólo coagulables porque la PS no tiene actividad estearásica) o inmunológicos (7-9). Los métodos funcionales miden la actividad coagulable de la PS (es decir, la PS libre) y los métodos inmunológicos pueden determinar PS libre o PS total de acuerdo con la metodología utilizada. A pesar de los esfuerzos realizados para estandarizar el dosaje de PS, los distintos programas de control de calidad internacionales reportan coeficientes de variabilidad interlaboratorios altos y gran influencia de las variables preanalíticas en su determinación (7-9).
Para realizar la determinación de la PS, ya sea por el métodos coagulable o inmunoturbidimétrico, se aconseja que el paciente: a) no debe estar en la etapa aguda de la trombosis (se debe estudiar al menos tres meses después del evento), b) no debe estar bajo tratamiento con dicumarínicos (si es necesario el dato de PS con intervención médica se debe suspender 10 días el tratamiento de anticoagulación oral y anticoagular con heparinas de bajo peso molecular), c) la mujer no debe estar embarazada y si se produjo una pérdida fetal deben haber pasado al menos tres meses.
Se debe tener en cuenta que los pacientes con Factor V Leiden pueden dar falsos positivos, y que los anticuerpos antifosfolipídicos podrían interferir en el caso de estar trabajando con el método coagulable. El objetivo de este trabajo es: a) comparar los niveles de PS libre determinados por el método coagulable y por método inmunoturbidimétrico y b) estudiar la incidencia de algunas de las variables preanalíticas en la determinación de PS.

MATERIALES Y MÉTODOS

Población
Se estudiaron plasmas citratados de 83 sujetos normales, de 30 pacientes estables bajo tratamiento de anticoagulación oral (RIN 2-3, mas de tres meses de tratamiento) y de15 pacientes con déficit de PS diagnosticados previamente con el método coagulable.
Las muestras fueron obtenidas por punción venosa y anticoaguladas con citrato de sodio 3,8%, se centrifugaron y el plasma fue alicuotado y congelado a -20 ºC y a -80 ºC. (10).

Métodos
Dosaje de la actividad de PS: se realizó por método coagulable por la vía del APTT en coagulómetro semiautomático por duplicado (Staclot PS, Diagnostica Stago Francia). Para la determinación, el plasma citratado debió diluirse 1:10 con buffer Owren-Koller.
Para calibrar se utilizó un estándar comercial calibrado (Unicalibrator Diagnostica Stago Francia) contra estándar de la WHO (11). Todas las muestras se determinaron por duplicado.

Dosaje de PS libre: se realizó por un método inmunoturbidimétrico (Liatest Free PS Diagnostica Stago, Francia) automatizado en un coagulómetro BCT ( Dade Behring, Alemania). La determinación se realizó sobre plasma tal cual y la calibración se realizó con un pool de 10 plasmas normales que tenía 100% de PS determinada por el método coagulable.
Las determinaciones se realizaron en el día, antes de 4 horas de extraída la muestra o antes del mes en las muestras congeladas.

RESULTADOS

Determinación de la actividad por método coagulable
La Fig. 1 muestra las diversas curvas de calibración realizadas con los distintos lotes de reactivos utilizados. Si bien en todos los lotes se obtiene un buen índice de correlación, se puede observar que la pendiente y la ordenada al origen de la curva varían lote a lote, por lo tanto, es muy importante realizar la curva de calibración cada vez que se realiza la determinación. También se observan diferencias significativas cuando se utiliza un mismo lote en días distintos.
Los coeficientes de variación fueron: CV intraensayo (n=20): 4%,CV interensayo (n=20, 3 días consecutivos): 3.4%.
Los valores de referencia obtenidos en sujetos normales para las muestras dosadas en el día fueron: mujeres (n=45): 86% (66-106), hombres (n=38): 108% (87-129). Los pacientes anticoagulados con dicumarínicos mostraron valores disminuidos de PS (25±12%, media y ± DE).


Fig. 1. Curvas de calibración del método coagulable con distintos lotes de reactivos.
Se observan diferencias significativas entre la pendiente y la ordenada al origen (Ver texto).

Determinación de la PS libre por método inmunoturbidimétrico
En este caso no se observaron diferencias significativas cuando se realizó la calibración utilizando un mismo lote días distintos pero sí hubo pequeñas diferencias entre lotes, por lo que se debería calibrar por lote de reactivo.
Los coeficientes de variación fueron: CV intraensayo (n=20): 3,7% :CV interensayo (n=20,3 días consecutivos): 4,5% y los valores de referencias, en sujetos normales: mujeres (n=45): 92% (65-112) y hombres (n=38): 108% (87-135). En el grupo de pacientes deficitarios de PS, el 26% de los pacientes (4/15) presentaron valores disminuidos de PS coagulable confirmados en dos muestras independientes y valores normales de PS libre.

Comparación entre métodos
Las Fig. 2 y 3 muestran que ambos métodos presentan buena correlación para la determinación de PS libre y actividad funcional (R2=0.94). El gráfico de Bland y Altman muestra que la mayoría de los datos no tienen diferencias significativas entre ambos métodos. Es importante señalar que en todos los casos la buena correlación se obtiene calibrando el método coagulable el mismo día que se realizan las determinaciones. El coeficiente de correlación disminuye cuando no se realiza en el método coagulable la curva de calibración en la misma corrida analítica que las muestras. (por ejemplo, R2= 0.75).
No se observaron diferencias significativas entre las muestras determinadas frescas y conservadas a -20 °C durante 20 días y a -80 °C durante 1 mes (descongeladas en baño a 37 °C). En cambio, se observa un descenso de actividad entre 12 a 18% en las muestras congeladas y descongeladas más de una vez.


Fig. 2. Comparación del método inmunoturbidimétrico y coagulable para la determinación de la PS. Existe una buena correlación en todo el rango de actividad de PS.


Fig. 3. Comparación del método coagulable e inmunoturbidimétrico por el método de Bland y Altman.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Los valores de referencia encontrados son similares a los descriptos en la literatura para la población caucásica, los niveles plasmáticos de PS son menores en mujeres que en hombres. Los pacientes bajo tratamiento de anticoagulación oral muestran valores de descendidos de PS debido a que es una proteína cuya síntesis depende de la presencia de vitamina K.
Los métodos de dosaje de PS funcional e inmunoturbidimétricos muestran resultados comparables cuando la curva del método coagulable se realiza en la misma corrida analítica que las muestras, lo cual muestra la necesidad de calibrar cada vez que se hace la determinación de PS por el método coagulable.
El coeficiente de variación intra e interensayo del método inmunoturbidimétrico es similar al del método coagulable.
El congelamiento y descongelamieno de las muestras más de una vez afecta la actividad de PS libre, por lo tanto, si se congelan las muestras para hacer el dosaje de PS las mismas deben descongelarse sólo una vez.
Lo ideal sería realizar un método de actividad y uno de PS libre cuando se hace el estudio en pacientes trombofílicos. Si se obtiene un patrón de deficiencia tipo II (PSact disminuida y PS libre normal ) deben buscarse causas que lleven a una deficiencia adquirida de la actividad de PS o la presencia de interferencias que lleven a falsos positivos. Si se elige sólo determinar la actividad funcional se deben considerar los falsos positivos de la prueba y si sólo se va a determinar PS libre se debe recordar que un número no establecido aún de deficiencias tipo II no serán detectadas. La frecuencia de los distintos tipos de déficit de PS es controvertida; de acuerdo con la base de datos de las mutaciones reportadas un 95% de los pacientes serían tipo I y III y un 5% serían tipo II. Sin embargo, hay autores que reportan hasta un 39% de déficit de PS tipo II (2)(3).
Si se detecta un déficit de PS se debe repetir el estudio en al menos una muestra independiente, estudiar los familiares del propósito e investigar la existencia de causas adquiridas de PS.

Correspondencia

Dra. Cristina Duboscq
Servicio de Hematología y Hemoterapia
Hospital Británico de Buenos Aires
Perdriel 74 - CIUDAD AUTÓNOMA DE BS. AS. - Argentina
E-mail cristinaduboscq@speedy.com.ar

Referencias bibliográficas

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Aceptado para su publicación el 26 de febrero de 2008