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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. v.42 n.2 La Plata abr./jun. 2008

 

EDITORIAL

Proteómica y sus aplicaciones en medicina humana

Nuevas técnicas crean e incorporan avances en el diagnóstico, pronóstico, tratamiento y prevención de las enfermedades, permitiendo el advenimiento de nuevas estrategias terapéuticas.

2D Gel Electroforesis

• Separación para el eje x. La electroforesis bidimensional (2D Gel Electroforesis) se afianzó como consecuencia de la incorporación del fraccionamiento por isoelectroenfoque empleando anfolitos que generan, por el pasaje de la corriente eléctrica, un gradiente de pH (3 a 10) continuo y estable donde es posible separar proteínas con una diferencia de puntos isoeléctricos de 10-3 unidades de pH.
Este gradiente de pH, continuo e inalterable durante el paso de la corriente eléctrica, inmoviliza a las proteínas en su valor de carga nula, generando un espectro-isoeléctrico en el interior del gel de agarosa.
• Separación para el eje y. Esta separación primaria es trasladada a una lámina de gel de poliacrilamida entre dos placas de vidrio, constituida por un gradiente de poliacrilamida del 2 al 20% que al gelificar catalíticamente y generar un ámbito de poros filtrantes permite la separación de las proteínas de acuerdo con su diámetro y masa molecular, generando un mapa de proteínas separadas por su punto isoeléctrico y su masa molecular bidimensional.
• Separación para el eje z. Consiste en realizar coloraciones específicas con colorantes afines a sus grupos cromóforos, como también con los que emplean la selectividad hacia metales, incluídos en su trama molecular y también anticuerpos específicos marcados que permiten el desarrollo de mapas bi y tridimensionales de las proteínas en estudio.

Estos mapas pueden ser obtenidos de materiales biológicos de distinta naturaleza, suero, orina, secreciones lacrimales (lágrimas, LCR, líquidos de punción, exudados y todos los tipos celulares que pueden ser obtenidos por punción o intervención laparoscópica o cirugía convencional.
Las proteínas separadas por 2D Gel electroforesis pueden ser sometidas, luego de su separación del mapa, a un tratamiento de partición empleando MALDI-TOF, procedimiento que consiste en someter las proteínas a la ionización con rayos láser y transfiriendo los iones a un analizador TOF y usando un espectrógrafo de masa (MS) es posible obtener los espectros MS-MS que se identifican con la base de datos.
En el excelente libro Biomedical Application of Proteomics se ha realizado un exhaustivo estudio que pretendemos resumir muy esquemáticamente en dos áreas, la aplicada a la clínica y la aplicada a las enfermedades infecciosas más agresivas y difundidas.
En el capítulo referido a las Investigaciones Biomédicas se ponen en evidencia la tecnología de las proteínas y los avances en la práctica médica, los problemas ético- legales que están involucrados, sobre todo los relacionados con la conformidad de los estudios acordados con el paciente y todos aquellos que involucran la posible toma de decisiones en los ámbitos laborales o familiares, por sus implicancias sociales y económicas.
Los capítulos en los que se han desarrollado las distintas aplicaciones de la proteómica se detallan a continuación, citando al final las breves conclusiones que revelan el extraordinario esfuerzo realizado para poner en evidencia el calificado avance y la calidad analítica de estas depuradas técnicas que ofrecen a la Medicina el conocimiento extraordinario de la relación entre el laboratorio bioquímico, la tecnología de la imagen con la interrelación del médico al paciente y las alteraciones genéticas que presentan los humanos y condicionan la salud y la enfermedad.
A continuación se detallan los títulos de los capítulos:

- Recipiente sanguíneo - Contenido vascular.
- Enfermedad vascular y ateroesclerosis.
- Descubrimiento de nuevos marcadores diagnósticos en stroke.
- Cáncer.
- Proteína 27 en cáncer.
- Aproximación proteómica, descubrimiento de biomarcadores en cáncer de colon.
- Cáncer de ovarios, proteómica clínica.
- Células madres - Stem cells. Análisis de los perfiles de expresión.
- Células de linfoma.
- Fármaco-toxicología - Quimio-resistencia de células cancerosas.
- Diabetes mellitus. Alteraciones moleculares.
- Enfermedades infecciosas.
- Estudio proteómico de linfocitos humanos.
- Modificaciones proteómicas en células portadoras del virus Herpes Simplex.
- Francisella turalensis.
- Sistema nervioso central.
- Líquido céfalo-raquídeo humano.
- Aplicaciones proteómicas en el estudio de la enfermedad de Alzheimer.
- Espectroscopia de masa y Bioinformática.
- Variaciones, proyección, recursos y herramientas en Bio-informática.
- Base de datos sobre el conocimiento de proteínas, Swiss-Prot.

A continuación se considerarán algunos grandes títulos y los últimos estudios a nuestro alcance.

Recipientes sanguíneos

Técnicas proteómicas para la identificación y cuantificación de proteínas de membrana y células endoteliales: Blancos vasculares, marcadores de angiogénesis, tecnologías para la identificación y valoración cuantitativa de proteínas de membranas de diferentes tipos, marcado vascular basado en anticuerpos específicos.
Técnicas proteómicas basadas en la identificación y cuantificación de proteínas en el área vascular y células endoteliales.
Este ámbito se ha desarrollado rápidamente para el diagnóstico precoz del cáncer, una variedad de enfermedades, los desórdenes oculares y ceguera, inflamaciones crónicas, ateroesclerosis y amiloidiosis, incluyendo métodos para el empleo de anticuerpos recombinantes y el uso de animales en la perfusión con anticuerpos biotinilados.
El empleo de productos biofarmacéuticos directamente contra marcadores de angiogénesis, el conocimiento del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGEF) y de los formadores de células tubulares.
En todo este avance la aplicación de la 2D Gel Electroforesis y la espectroscopia de masa (MS) han permitido el conocimiento de proteínas y péptidos en el rango fentomolar.

Enfermedades vasculares y ateroesclerosis
En la actualidad la ateroesclerosis está vinculada a la respuesta de la injuria o lesión vascular en el desarrollo de la enfermedad.
El primer paso está relacionado con la disfunción endotelial por modificación y acción de diversos factores (oxidación, glicación, agregación asociada con proteoglicanos incorporados a inmunocomplejos, lipoproteínas de baja densidad, LDL, radicales libres -producidos por el humo del cigarrillo e hidrocarburos que lo acompañan- hipertensión y diabetes- alteraciones genéticas, mutaciones que codifican las apolipoproteínas B, C II y E, lipoproteína lipasa y receptores LDL, niveles elevados de homocisteína plasmática e infecciones a Herpes virus y Chlamidia pneumoniae.
La injuria tisular produce el estado trombótico y antitrombótico y la producción de moléculas de citoquinas con actividad vascular y factores de crecimiento.
Monocitos, macrófagos y linfocitos migran desde la sangre y hasta la lesión, también se acumulan lípidos en las células espinosas. La activación de estas células produce enzimas hidrolíticas, citoquinas y quimoquinas que ocasionan daño local. Estas células mononucleares producen migración y proliferación de células musculares con formación de tejido fibroso, que, a veces, incorpora lípidos y tejido fibroso, reduciendo el lumen y alterando la circulación.
Empleando 2D Gel electroforesis en la vena safena media se separan aproximadamente 150 manchas de proteínas que fueron identificadas con Maldi - MS y nanospray MS.

Nuevos marcadores de diagnóstico en accidentes cerebrovasculares (ACV)
El accidente cerebro-vascular (ACV) ocurre por el bloqueo o ruptura del contenido del recipiente vascular sanguíneo del cerebro produciendo isquemia y hemorragia. Un 80% de los ACV son de tipo isquémico. Cuando el ACV está diagnosticado, el clínico necesita conocer la naturaleza del mismo a los efectos de la prescripción del tratamiento más adecuado. Por lo tanto, es muy importante tomar conocimiento de los biomarcadores. Muchos investigadores tienden a seguir un protocolo según las pautas de NIH (National Institute of Health), con un scanner CT e imagen de resonancia magnética nuclear. Luego, el examen excluye otras alteraciones como búsqueda de meningitis, cáncer, migraña, infecciones virales o desórdenes metabólicos.

Biomarcadores
Se han estudiado bien tres que se encuentran asociados con neurotoxicidad que pueden ser determinados y medidos en la sangre: glutamato, homocisteina y también el N-metil aspartato y el receptor del autoanticuerpo (a Ab). Estos marcadores pueden dar una idea del grado de toxicidad de la isquemia cerebral.
Empleando tecnología de MALDITOF fue posible encontrar en líquido céfalo raquídeo cinco picos pertenecientes a péptidos, en pacientes con Alzheimer.
A través de la proteómica se ha estudiado la expresión de diferentes proteínas asociadas a pacientes con accidentes cerebro-vasculares; 1) permite decidir estrategias de perfusión; 2) descubrir proteínas directa o indirectamente vinculadas con la enfermedad; 3) el conocimiento de las proteínas permite una clasificación precisa del ACV para una terapéutica más eficaz.

La Bioinformática - Herramienta vital
La gran difusión internacional de la 2D Gel electroforesis ha sido posible gracias al desarrollo de la bioinformática.
El mapa del genoma humano ha suministrado un gran volumen de datos que representa la concreción de muchos años de trabajo y que forma la base del futuro proyecto de identificación de los genes humanos permitiendo conocer y estudiar la diversidad genética para determinar el estado de salud y la enfermedad.
1. Algunas anormalidades están relacionadas con un simple origen genético.
2. Otras dependen de la interacción y combinación de varios factores genéticos con influencia del medio ambiente.
3. En enfermedades complejas es muy difícil conocer la influencia y contribución del fondo genético en la manifestación de la enfermedad.
El mayor desafío en la genética médica es conocer la relación entre la genética y la variación genotípica, siendo el mayor impacto el conocimiento e identificación de todas las variantes de los genes humanos.
La proteína ligante del retinol es un buen ejemplo de estos hechos, este gen (ABCA4 o ABCR) está mutado en los desórdenes retinianos, es ampliamente aceptado el rol de mutación de ABCR en la distrofia muscular.

Base de Datos
Existen muchas bases de datos que describen la secuencia de las variaciones y las mutaciones y polimorfismos y sus relaciones con la enfermedad en humanos y que pueden ser localizados en INTERNET.
Existen dos tipos de base de datos de las mutaciones:
- Base Control de datos
Contiene información de variaciones a través del genoma interno.
- Base de datos especializados.
Concentrado en las variaciones entre un simple gen o genes asociados con un fenotipo simple.
La calidad de la base de datos y la validación de los datos difiere entre las distintas centrales y están muy relacionadas con el criterio empleado para su formación y estructura; algunas de ellas hacen el foro en el fenotipo y enfermedad y su relevancia clínica y otras en las variaciones bioquímicas y su influencia en la enfermedad.
OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) es la base de datos conocida de Genes humanos y de desórdenes genéticos. Puede ser usada con el nombre OMIM número de variantes alélicas, texto, referencia, sinopsis clínica, desórdenes del mapa génico y contribuciones.
HGMD Base de datos mutación de Genes Humanos (http:// archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmdo.hm). Todas las entradas se realizan a través de un único número y a su vez provee la referencia que informa sobre la mutación y agrupa las entradas por mutaciones asociadas a la enfermedad con el nombre del gen símbolo y localización cromosómica.
HUGO (Human Genoma Variation): base de datos de mutaciones 1994; constituye la primera iniciativa para integrar sistemáticamente la documentación de mutaciones.

Proteínas: anotación médica
La expresión anotación médica de proteínas debería ser traducida como proteína con connotación médica. Este concepto implica la recolección de la información integrada asociando con la enfermedad, con los genes y las proteínas involucradas.
Lo expuesto es una prueba de las necesidades de la comunidad científica de adoptar el criterio de que la información sea correcta, exacta, clara y no engañosa.
Generalmente dos datos son relevantes: una correcta nomenclatura y una correcta descripción de las variaciones de la secuencia.
Existen reglas oficiales para las recomendaciones y están disponibles On line en la Web http://www.genomic.unimelb. edu.ar/mdi/mutnomen.
Resulta, por consiguiente, muy importante el control de calidad de la base de datos y la correcta denominación de los datos tipográficos, existiendo reglas básicas de nomenclatura:
1) Las variantes pueden estar localizadas en el nivel del ADN usando las referencias genómicas o del cADN, como acceso a la secuencia primaria de la base de datos.
2) La descripción debe estar precedida por una letra indicativa de la referencia de la secuencia empleada.
- g para genómica
- c para cADN
- m para mitocondria
3) El número de nucleótido designado de ATG como nucleótido iniciador de metionina +1.
4) También debe indicarse claramente en qué nivel de variación de secuencia ha sido analizado r si se refiere a RNA y p si ha sido analizada la secuencia de la proteína.
Una forma de controlar entre los cambios descriptos en los nucleótidos y los correspondientes aminoácidos, puede estar disponibles en http://www.ebi.ac.ik/cgi.bin/mutations/check.cgi
La mayor dificultad en los procesos de anotación es donde se describe el efecto de variación de la secuencia, estableciendo la asociación con la enfermedad, especialmente cuando existen variaciones. Puede no ser una tarea fácil unos pocos criterios pueden ayudar a determinar las variables y la relación con las causas de la enfermedad.
Un profundo análisis del ADN del gen puede aportar para descartar la ausencia de la actual mutación relevante.
Segregación del fenotipo de la enfermedad con la mutación entre pedigree es una buena indicación de la patogenicidad.
El tipo de cambio/sustitución de un residuo por un amino ácido o diferentes caracteres físicos es más probable de influir sobre la estructura de una proteína; particularmente si se afectan los residuos conservados a través de la especie.
Cuando la frecuencia de una variante es menor del 1% en la población es raro que produzca una enfermedad.
El análisis funcional de la variante es, en definitiva, la prueba confirmatoria del efecto fenotípico.
SNP Bases de datos (http://nebi.nlm.nih.gov/snp/). Es un repositorio sustituible de mucleótidos, delecciones cortas y repetición de microsatélites. La DbSNP contiene 3 millones de SNPS humanos y 0,5 millones de otros organismos.
Base de datos HGV (http://hgbase.cgb.ki.sel) Ha sido construida para proveer una colección no muy abundante de variantes de DNA silentes (sin expresión).
La información de los SNP puede ser localizada en el consorcio Website (http://pga.mbt.washington.edu/) o Alfred
.

Ventajas y desventajas

Ventajas: es una base de datos que permite obtener buena y consistente información actualizada de variantes a través del genoma y, por otra parte, permite incursionar en el conocimiento de nuevas enfermedades y en el aporte de la acción de nuevos fármacos así como en el extenso e inexplorado campo de la Farmacogenómica.

Dr. Juan M. Castagnino

Director
Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana

Bibliografía sugerida

1. Devlin TM. Biochemistry with clinical correlations. New York: John Wiley and Sons Inc. Publications; 2002.        [ Links ]

2. Liebler CD. Introduction to proteomics tools for the new biology. New Jersey: Human Press; 2002.        [ Links ]

3. Cooper GM, Cooper S. La célula. Madrid: Marban SL; 2000.        [ Links ]

4. Mersich S, Gadaleta P. Nuevas estrategias terapéuticas basadas en apoptosis y virus. Acta Bioquím. Clín Latinoam 2003; 37 (1): 13-9.        [ Links ]

5. Pierce B. Genética. Un enfoque conceptual. Madrid: Ed. Panamericana; 2006.        [ Links ]

6. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CH, Krieger M, Scott M, et al. Biología celular y Molecular. Madrid: Ed. Panamericana; 2005.        [ Links ]

7. Sanchez JC, Corthals GL, Hochstrasser DF. Biomedical Applications of Proteomics. Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA; 2004.        [ Links ]