MICROBIOLOGÍA

Utilidad de la conservación en medio de Stuart en la determinación del balance del contenido vaginal*

Usefulness of the preservation in Stuart medium in the determination of the balance of vaginal content

Marcela Nastro¹, Ana Despouy¹, Beatriz Perazzi^2*, Carmen de Mier³, Ramón de Torres², Carlos Vay², Ángela Famiglietti²

1. Bioquímica, alumna de la Carrera de Especialización en Bacteriología Clínica, Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires.
2. Doctor de la Universidad de Buenos Aires.
3. Bioquímica, Especialista en Bacteriología Clínica.

* Laboratorio de Bacteriología Clínica, Departamento de Bioquímica Clínica, Hospital de Clínicas, Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. Córdoba 2351,1120 Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina.

Resumen

El objetivo de este trabajo fue comparar los resultados del valor numérico (VN) (índice de Nugent) y de la reacción inflamatoria vaginal (RIV) en muestras vaginales obtenidas de acuerdo con el Manual de Procedimientos del balance del contenido vaginal (BACOVA), respecto de las transportadas en medio de Stuart. Se estudiaron 58 mujeres embarazadas sintomáticas y asintomáticas que concurrieron al Hospital de Clínicas. A cada paciente se le efectuaron dos tomas del contenido vaginal con hisopo. A partir de un hisopo se efectuaron directamente dos extendidos, uno para coloración de Gram y otro para coloración de Giemsa (Método BACOVA) y el segundo hisopo se mantuvo en medio de Stuart por 4 horas antes de efectuarse los extendidos (Método Stuart). El VN se estableció por lectura del Gram (1.000X), el recuento de leucocitos por lectura del Gram (1.000X) y del Giemsa (400X). Los valores numéricos en las tres áreas críticas (0 a 3 normal, 4 a 6 microbiota intermedia y 7 a 10 vaginosis bacteriana) resultaron estadísticamente similares para ambos métodos, con un grado de acuerdo (coeficiente Kappa) de 1,0. El recuento de leucocitos por campo fue sensiblemente inferior por el método de Stuart. El coeficiente de correlación entre ambos métodos para RIV fue de 0,612 en el Gram. La muestra vaginal conservada en medio de Stuart resulta apta para la determinación del VN (índice de Nugent) pero requiere la realización del recuento de leucocitos por campo relativo a cada célula epitelial para determinar la RIV.

Palabras clave: Balance del contenido vaginal; Medio de Stuart; Valor numérico; Respuesta inflamatoria vaginal

Summary

The aim of this study was to compare the use of Stuart transport medium and the conventional procedure in the determination of the Nugent score and the vaginal inflammatory response (VIR) in vaginal swabs obtained following the guidelines regarding balance of vaginal content (BAVACO). Fifty-eight symptomatic and asymptomatic pregnant women were included in this study. Two samples of vaginal content were obtained from each patient. One sample was processed as indicated in the BAVACO guide and the second one was transported and kept in Stuart medium for four hours before processing the smears. Nugent score and leucocyte count were performed on Gram stained smears (1.000X). The leucocyte count was also performed on the Giemsa stained smears (400X). The Nugent score was statistically similar for each of the numeric values between the samples using the regular procedure and the ones using Stuart medium. Kappa coefficient was 1.00. The leucocyte count was sensitively lower in all 58 cases, when Stuart medium was used. When Gram stain was performed, the correlation coefficient was 0.612. Samples of vaginal content transported with Stuart medium resulted adequate for the determination of the Nugent score. However, the VIR in samples transported in Stuart medium need to be determined by means of the leucocyte count per epithelial cell per microscopic field.

Key words: Balance of the vaginal content; Stuart medium; Nugent score; Vaginal inflammatory response

INTRODUCCIÓN

La utilización del balance del contenido vaginal (BACOVA) en el estudio de la disfunción vaginal ha mostrado los valores predictivos más altos, positivo y negativo, para el diagnóstico de vaginosis bacteriana (VB) y vaginitis microbiana inespecífica ^(1-4).
Uno de los problemas de aplicación práctica para la actualización anual del manual de procedimientos BACOVA 2006/7 fue evaluar algunas variables que se presentan en la toma y transporte de la muestra destinada al estudio microscópico del contenido vaginal (5). Una de estas variables, que se presenta con frecuencia, es el transporte de la muestra de fondo de saco vaginal en medio de Stuart (6).
Salvo excepciones, BACOVA debe preceder a la solicitud de cultivos del contenido vaginal en la atención primaria de la mujer en edad fértil (2) (3) (7). En casos en que la evidencia clínico-epidemiológica requiera de un cultivo inmediato, la toma de muestra se realiza generalmente en el área de atención clínica y en prácticamente la totalidad de estos casos, se transporta en un tubo con medio de Stuart.
Universalmente se acepta la necesidad de establecer en forma prioritaria el estado del contenido vaginal por microscopía en mujeres sintomáticas (embarazadas o no) y agregarlo, junto con el cultivo, en el control de embarazadas asintomáticas a los efectos de detectar potenciales alteraciones del balance de la microbiota habitual y el estado de la reacción inflamatoria vaginal (RIV) ^{(1-5) (7-9)}.
BACOVA resuelve el diagnóstico de la disfunción vaginal con el más alto valor predictivo, sin requerir inicialmente estudios de aislamiento microbiano, estableciendo con precisión el valor numérico (VN) y la reacción inflamatoria vaginal (RIV) ^(2-4).
Sin embargo, es aún frecuente que en la primera visita se solicite el cultivo indiscriminado y estos casos incluyen el transporte de la muestra en medio de Stuart.
En otros casos, en condiciones clínico-epidemiológicas que requieren la necesidad puntual de un estudio para la investigación de una infección potencial por gonococos y/o trichomonas y la evaluación de la colonización por levaduras, también se utiliza el medio de Stuart.
La importancia de la determinación del VN y la RIV ha motivado el desarrollo de diferentes estudios con referencia a su validación, en condiciones variables de toma de muestra (10) (11).
No existe en la literatura información sobre la validez del estudio del VN y la RIV, en muestras transportadas en medio de Stuart.
El objetivo de este trabajo fue comparar los resultados del VN, de la RIV y de la celularidad, con muestras tomadas de acuerdo con el Manual de Procedimientos BACOVA 2006/7 y en forma paralela y simultánea, en la misma paciente, con hisopados transportados en medio de Stuart.

MATERIALES Y MÉTODOS

Población en estudio
Se estudiaron prospectivamente 58 mujeres embarazadas sintomáticas y asintomáticas que concurrieron al consultorio de Obstetricia del Hospital de Clínicas, entre octubre de 2005 y marzo de 2006.

Toma de muestras y procesamiento
Se utilizaron hisopos estériles de algodón hidrófilo con mango de madera. La preparación previa de las pacientes y la metodología de toma de muestra se realizó según el Manual de Procedimientos BACOVA 2006/7 (5). Paralelamente se utilizó otro hisopo del mismo tipo que los anteriores, pero que luego de la toma de fondo de saco, fue introducido en un tubo que contenía 3 mL de medio de transporte de Stuart (Difco, Detroit, EE.UU.) (6).

Composición del medio de Stuart utilizado
Glicerofosfato de sodio 10,0 g
Tioglicolato de sodio 0,5 g
Clorhidrato de cisteína 0,5 g
Cloruro de calcio 0,1 g
Azul de metileno 0,001 g
Agar 5,0 g
Autoclavado durante 20 min a 121 ºC.

A partir del material obtenido con hisopo estéril se efectuaron directamente dos extendidos, uno para coloración de Gram y otro para coloración de Giemsa, según el Manual de Procedimientos BACOVA 2006/7 (Método BACOVA) (5) (12).
Con otro hisopo mantenido en medio de Stuart por lo menos durante 4 h, luego de la toma de la muestra, se efectuaron dos extendidos que fueron coloreados en forma paralela a los anteriores (Método Stuart).
El VN se estableció en función de la lectura del Gram a 1.000 X y el recuento de leucocitos se evaluó por la lectura del Gram a 1.000 X y la del extendido coloreado con Giemsa a 400 X y en ambas coloraciones se expresó como número de leucocitos por campo (5) (12). La cifra final, respecto al número de leucocitos por campo, incluyó el promedio del recuento en 10 campos microscópicos no adyacentes, razón por la cual se incorporaron valores finales con fracción decimal en algunos casos.
La capacidad de detección de celularidad se evaluó por ambos métodos, utilizando como línea de corte >; 5 células por campo de 1.000 X, en la coloración de Gram.
En todos los casos se utilizó un solo microscopio óptico (Olympus CH 30 Japón) 1,25 oil 160 / - NCWHK 10X/18L a los efectos de validar el análisis comparativo (13).

Análisis estadístico
Los datos se procesaron utilizando el programa EPI info 6.
Se calcularon los niveles de significación por prueba de coeficiente de correlación para la RIV, entre las dos metodologías utilizadas (Método BACOVA y método de Stuart). Para la determinación del VN y para la detección de celularidad, se compararon ambos métodos, utilizando el ensayo de comparación para muestras relacionadas de McNemar Chi cuadrado (c²) y por cálculo del grado de acuerdo (Coeficiente Kappa) (14).

RESULTADOS

Se estudió una única muestra del contenido vaginal de 58 mujeres.

1) Valor Numérico (VN)
Los valores numéricos en las tres áreas críticas (0 a 3 normal, 4 a 6 microbiota intermedia y 7 a 10 vaginosis bacteriana) resultaron similares en forma estadísticamente significativa, tanto para el método BACOVA convencional como para las muestras conservadas por el método Stuart. Los valores obtenidos se muestran en la Tabla I.
El análisis del cálculo del grado de acuerdo brindó resultados similares, dando un valor de 1,000 para las tres áreas críticas del VN, francamente por encima del valor esperado por azar y un coeficiente Kappa también de 1,000, con un valor de p de 0,000.

Tabla I. Niveles de significación para la comparación de la muestra procesada por método BACOVA y la conservada en medio de Stuart, según el valor numérico.

2) Respuesta Inflamatoria Vaginal (RIV)
Con el material conservado en medio de Stuart, el recuento de leucocitos por campo en valor absoluto, tanto que se haya utilizado lectura en Gram (1.000X) o lectura en Giemsa (400X), fue sensiblemente inferior al que se obtuvo cuando la muestra fue procesada dentro de las indicaciones convencionales del Manual de Procedimientos BACOVA (Tabla II).
El coeficiente de correlación para la RIV fue de 0,612 cuando se determinó con un aumento de 1.000X en el Gram y de 0,532 en el caso de la utilización de 400X en Giemsa.

Tabla II. Reacción inflamatoria vaginal de la muestra procesada por método BACOVA y la conservada en medio de Stuart, de acuerdo con las coloraciones de Gram y Giemsa.

3) Celularidad
Con respecto a la capacidad de detección de >; 5 células por campo (línea de corte en este sistema) en la coloración de Gram (1.000X), se observó que resultó superior en forma estadísticamente significativa por el método BACOVA al compararla con el resultado utilizando el método Stuart (McNemar c² B/C: 32,6;
p < 0,001).

El cálculo del grado de acuerdo en los resultados, comparando la capacidad de detección de >;5 células obtenida con ambos métodos, resultó de 0,211, por debajo del esperado por azar de 0,474, el coeficiente Kappa fue de -0,501 y el valor de p de 1,000, lo que resultó coincidente con el coeficiente de correlación clásico.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Luego de la observación de los pares de extendidos coloreados por la tinción de Gram, tomados con hisopo directo del fondo de saco vaginal y mediante conservación del hisopo en medio de transporte de Stuart respectivamente, se pudo determinar que ambos métodos resultaron similares en cuanto al valor predictivo para el balance de la microbiota habitual, intermedia y el diagnóstico de vaginosis bacteriana. El valor numérico según el Manual de Procedimientos BACOVA fue prácticamente el mismo (5).
Esto es de singular importancia porque permite en muestras enviadas en medio de Stuart (destinadas a cultivo), determinar con un alto nivel de precisión el VN con el que se establece el diagnóstico de VB, con el más alto valor predictivo (positivo y negativo) y así poder establecer las bases del diagnóstico diferencial en la disfunción vaginal ^{(1-5) (7-9) (15) (16)}.
Esta es la primera documentación acerca de la validez de la muestra vaginal conservada en medio de Stuart, para determinar el VN, que permite establecer el balance de la microbiota del contenido vaginal, sobre todo en la mujer embarazada ^(17-19).
Sin embargo, la muestra vaginal conservada en medio de Stuart no resultó adecuada para la determinación de la RIV, ya que se observó una variación en los valores del recuento de leucocitos por campo. El número disminuyó en el caso de los extendidos realizados a partir del hisopo conservado en medio de transporte de Stuart, por lo cual los valores absolutos no tienen validez.
La calidad de los extendidos también presentó diferencias, es decir se observó mayor cantidad de material en el caso de los obtenidos directamente, mientras que los conservados en medio de Stuart mostraron menor cantidad de células.
Recientemente se ha revalorizado la propuesta del recuento de leucocitos por célula epitelial por campo, que ha sido incorporado en el Manual de Procedimientos BACOVA 2006/7 (5) (20). De esta forma se logran eliminar factores inherentes a la toma de muestra, ya sea convencional y/o transportada en medio de Stuart y variaciones en el extendido. En forma puntual se ha demostrado que este tipo de informe tiene una mayor predictibilidad en el estudio de riesgo obstétrico (19) (20).
Con los datos obtenidos de este trabajo, se puede concluir que la muestra vaginal conservada en medio de Stuart resulta apta para la determinación de todo el rango de VN. Sin embargo, dicha muestra no resulta adecuada para la RIV, si ésta se expresa como recuento de leucocitos por campo, dada la menor cantidad de material de los extendidos. Por tal motivo, la muestra vaginal conservada en medio de Stuart requiere el recuento de leucocitos por campo por célula epitelial, para determinar la RIV. De esta forma, se permitirá obtener un adecuado diagnóstico diferencial de vaginosis-vaginitis en muestras originalmente destinadas a cultivo, transportadas en medio de Stuart.

Agradecimientos

Al Dr. Vicente C. Castiglia y a la Lic. Alejandra Schwartz de la Sección Asesoría Científica, Área Docencia e Investigación del Hospital de Clínicas, por la valiosa colaboración prestada en el análisis estadístico de este manuscrito.
Este trabajo fue realizado con el aporte del proyecto UBACyT BO49.

Correspondencia

DRA. BEATRIZ PERAZZI
Lavalleja 2726
1824 Lanús. Prov. Buenos Aires. Argentina
E-mail: hugodandrea@ciudad.com.ar

Referencias bibliográficas

1. Forsum U, Jakobsson T, Larsson PG, Schmidt H, Beverly A, Bjornerem A, et al. An international study of the interobserver variation between interpretations of vaginal smears criteria of bacterial vaginosis. APMIS 2002; 110: 811-8.        [ Links ]

2. Di Bartolomeo S, Offner G, Ojeda M, Valle S, Leonino A, de Torres RA. Balance del Contenido Vaginal (BACOVA). Valor de la expresión numérica en el diagnóstico de Vaginosis Bacteriana (VB) OGLA 2002; 60: 175-83.        [ Links ]

3. Fosch S, Fogolin N, Azzaroni E, Pairetti N, Dana L, Minacori H, et al. Vulvovaginitis: correlation with predisposing factors, clinical manifestations and microbiological studies. Rev Argent Microbiol 2006; 38: 202-5.        [ Links ]

4. Di Bartolomeo S, Leonino AP, Rodríguez Fermepin M, de Torres RA. Balance del contendio vaginal (BACOVA) en el diagnóstico diferencial de vaginosis-vaginitis. Reacción inflamatoria vaginal (RIV) en embarazadas sintomáticas. Acta Bioquím Clín Latinoam 2007; 41: 247-58.        [ Links ]

5. Proyecto BACOVA, Programa PROECO, Fundación Bioquímica Argentina. Manual de Procedimientos BACOVA 2006. Disponible en: http://www.fba.org.ar/proeco [Fecha de acceso: 1 de setiembre de 2006].        [ Links ]

6. Stuart RD. Transport problems in public health bacteriol-ogy; the use of transport media and other devices to maintain the viability of bacteria in specimens. Can J Microbiol 1956; 47: 115-22.        [ Links ]

7. ACOG Committee on Practice Bulletins. American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG). Clinical Management Guidelines. Vaginitis nº 72, Obstet Gynecol 2006; 107: 1195-206.        [ Links ]

8. Workowski KA, Berman SM. Sexually Transmitted Diseases Guidelines 2006. CDC`s MMWR 2006; 55 (RR11): 1-94.        [ Links ]

9. Landers DV, Wiesenfeld HC, Heine RP, Krohn MA, Hillier SL. Predictive value of the clinical diagnosis of lower genital tract infection in women. Am J Obstet Gynecol 2004; 190: 1004-10.        [ Links ]

10. Audisio T, Penacino M, Cannistraci R, Bertolotto P. Detection of bacterial vaginosis, Trichomonas vaginalis infection, and vaginal Candida infection: a comparative study of methods of extractin exudates, with and without a speculum, during pregnancy. J Low Genit Tract Dis 2005; 9: 213-5.        [ Links ]

11. Morgan DJ, Aboud CJ, McCaffrey IM, Bhide SA, Lamont RF, Taylor-Robinson D. Comparison of Gram-stained smears prepared from blind vaginal swabs with those obtained at speculum examination for the assessment of vaginal flora. Br J Obstet Gynecol 1996; 103: 1105-8.        [ Links ]

12. Nugent R, Krohn MA, Hillier SL. Reliability of diagnosing Bacterial Vaginosis is improved by standardized method of Gram stain interpretation. J Clin Microbiol 1991; 29: 297-301.        [ Links ]

13. Larsson PG, Carlsson B, Fâhraeus L, Jakobsson T, Forsum U. Diagnosis of bacterial vaginosis: need for validation of microscopic image area used for scoring bacterial morphotypes. Sex Transm Infect 2004; 80:63-7.         [ Links ]

14. Castiglia VC. Principios de Investigación Biomédica. 2a. ed. Buenos Aires: Gráfica Sur Editora; 1998.        [ Links ]

15. Coppolillo E, Perazzi B, Vay C, Cora Eliseht M, Famiglietti A, Barata A. Diagnosis of bacterial vaginosis during pregnancy. J Low Genit Tract Dis 2003; 7: 117-21.         [ Links ]

16. Coppolillo E, Perazzi B, Vay C, Cora Eliseht M, Tauscher P, Barata A, et al. Metodología diagnóstica para las infecciones del tracto genital inferior durante el embarazo. Ginecol Reprod 2000; 7: 76-81.        [ Links ]

17. Perazzi B, Coppolillo E, Menghi C, Cora Eliseht M, Gatta C, Méndez, et al. Estudio microbiológico del contenido vaginal durante el embarazo. OGLA 2006; 64:129- 35.         [ Links ]

18. Perazzi B, Coppolillo E, Vay C, Cora Eliseht M, Ortiz E, Famiglietti A, et al. Análisis de prevalencia de los principales patógenos del tracto genital inferior según el trimestre de embarazo. Colposcopía 2005; 16: 65-9.        [ Links ]

19. Romero R, Chaiworapongsa T, Kuivaniemi H, Tromp G. Bacterial Vaginosis, the inflammatory response and the risk of preterm birth: a role for genetic epidemiology in the prevention of preterm birth. Am J Obstet Gynecol 2004; 190: 1509-19.        [ Links ]

20. Ramsey PS, Lyon MD, Goepfert AR, Cliver S, Schwebke J, Andrews WW, et al. Use of vaginal polymorphonuclear to epithelial cell ratios for the prediction of preterm birth. Obstet Gynecol 2005; 105: 139-44.        [ Links ]

Aceptado para su publicación el 18 de abril de 2008