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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. v.42 n.2 La Plata abr./jun. 2008

 

BIOQUÍMICA CLÍNICA

Diagnóstico in vitro de la deficiencia primaria de carnitina

In vitro diagnosis of primary carnitine deficiency

José Henry Osorio1*, Antonia Ribes1*, Montse Lluch2**

1. PhD.
2. MD

* Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Laboratorio de Patología Molecular. Universidad de Caldas. Manizales. Colombia.
** Instituto de Bioquímica Clínica. Corporación Sanitaria Clínic. Barcelona. España.

Resumen

El transportador de carnitina (OCTN2) es fundamental para el metabolismo mitocondrial de los ácidos grasos de cadena larga. Su carencia produce la deficiencia primaria de carnitina. El presente estudio tuvo como objetivo el análisis de los ácidos grasos producidos por fibroblastos incubados en presencia de sustratos deuterados, mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC - MS) como herramienta diagnóstica de la deficiencia primaria de carnitina. Se encontró un perfil característico en esta deficiencia, lo que permite su diagnóstico in vitro.

Palabras clave: Transportador de carnitina; Deficiencia primaria de carnitina; Cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas

Summary

Carnitine transporter (OCTN2) is required for the mitochondrial metabolism of long-chain fatty acids. Primary carnitine deficiency is a consequence of its deficiency. The objective of the present study was to analyse the fatty acids produced by fibroblasts incubated with deuterated substrates, using gas chromatography-mass spectrometry as a diagnostic tool for the diagnosis of VLCAD deficiency. A characteristic profile for this deficiency was found using this technique which enables its in vitro diagnosis.

Keywords: Carnitine transporter; Primary carnitine deficiency; Gas-chromatography-mass spectrometry

INTRODUCCIÓN

La deficiencia primaria de carnitina, clasificada en el catálogo McKusick (base de datos sobre genes humanos y de diversos desórdenes genéticos) con el número 212140 se debe a un fallo en el transportador de carnitina (OCTN2). El gen que lo codifica está localizado en el brazo largo del cromosoma 5 y recientemente se han descrito los primeros análisis moleculares para mutaciones y polimorfismos (1).
úsculo, riñón, corazón, leucocitos y fibroblastos, pero no en hígado, donde la carnitina penetra por difusión pasiva. A nivel cardíaco y muscular, debido al déficit de penetración celular de carnitina, la oxidación de ácidos grasos es deficitaria. El proceso se agrava por la falta de reabsorción de carnitina en riñón, lo que induce unos niveles séricos muy bajos, disminuyendo la difusión pasiva hepática y alterándose la cetogénesis (2).
Los sustratos acil-CoA acumulados pueden ser utilizados para la síntesis de triglicéridos o entrar en la beta oxidación de los peroxisomas, que producen ácidos grasos de cadena media y ácidos dicarboxílicos, los cuales no requieren carnitina para entrar en la mitocondria, pudiendo ser completamente oxidados a este nivel, lo que explica los bajos o nulos niveles de ácidos dicarboxílicos en este error innato del metabolismo (3).
ños de edad (forma tardía). La sintomatología puede ser variada e incluir hipoglicemia hipocetócica, muerte súbita, incluso neonatal, debilidad muscular, cardiomiopatía o anemia que no responde al tratamiento con hierro. Puede presentarse hiperamoniemia y elevación de transaminasas, niveles séricos muy bajos de carnitina (<10 µM), en contraste con aumento de la excreción urinaria de carnitina. Estos pacientes no presentan acumulación significativa de acilcarnitinas en plasma ni acilglicinas en orina. El diagnóstico se confirmará a través del cultivo de fibroblastos o leucocitos donde se demuestra el defecto en la membrana plasmática del transportador de carnitina (4).
La respuesta clínica y bioquímica al tratamiento con carnitina es espectacular, restaurándose los niveles séricos de carnitina a valores casi normales con formación de la cetogénesis hepática y mejorando los signos clínicos de la miopatía y cardiomiopatía, a pesar de no restablecerse los niveles de carnitina a nivel muscular ni cardíaco. Los pacientes que no reciben tratamiento con carnitina suelen fallecer entre los dos y cuatro años de edad por progreso de la insuficiencia cardíaca (5).
Esta investigación busca proveer una herramienta diagnóstica in vitro para la deficiencia de OCTN2.

MATERIALES Y MÉTODOS

El presente estudio es de tipo experimental. El material biológico empleado han sido fibroblastos de 2 pacientes con deficiencia de OCTN2. Esta deficiencia fue confirmada por estudios enzimáticos, moleculares, o ambos. Como controles se utilizaron 5 cultivos diferentes de fibroblastos normales.
Como sustrato fue empleado el ácido 2 H3-metil-palmítico (Cambridge Isotope Laboratories). Fueron utilizados los siguientes compuestos deuterados para la preparación de la curva de calibración [8,8,8-d3]octanoil-L-carnitina.HCl, [10,10,10-d3]decanoil-L-carnitina.HCl, [12,12,12-d3]dodecanoil-L-carnitina.HCl, [14,14,14-d3] tetradecanoil-L-carnitina.HCl, [16,16,16-d3] hexadecanoil-L-carnitina.HCl. (Ten Brinx- Free University Amsterdam).
Como estándar interno fue adicionado ácido undecanodioico (Fluka), durante el proceso de extracción de las muestras.
Fibroblastos de pacientes y controles (4-20 pasajes) fueron cultivados en medio de cultivo similar al medio basal Eagle's con bicarbonato y HEPES (4-(2-hidroxietil)-1-ácido piperazinaetano sulfúrico), (MEM: medio mínimo esencial), suplementado con suero de bovino recién nacido 10% (v/v) y gentamicina 1% (v/v) a 37 °C, en estufa con 5%CO2/95% de aire. Después de alcanzar el punto de confluencia (80-100%), las células fueron lavadas dos veces con PBS (buffer fosfato salino), la solución se tripsinizó (1 mL de tripsina-EDTA a 37 °C), y posteriormente se neutralizó mediante la adición de 3-5 mL de MEM. Las células fueron transferidas y centrifugadas a 337 X g (5 min, 20 °C) en tubos cónicos de 10 mL (0.8-1,2 mg proteína), quedando listas para ser incubadas en presencia de sustratos deuterados.
óel método de Lowrry et al, (6) para la determinación de proteínas.
Para la oxidación de 2H3-palmítato en fibroblastos fue utilizada la técnica diseñada por Osorio et al (7); se preparó una solución de medio de cultivo con una concentración final de 0.15 mM de ácido 16-2H3 palmítico, 1 mM BSA, y L-carnitina 0.2 mM.
La incubación por los fibroblastos se llevó a cabo de la siguiente manera: después de la tripsinización, las células fueron resuspendidas en MEM enriquecido en frascos falcom de 2,5 mL (2 frascos por caso). Después de 72 h de incubación, el medio de cultivo fue recogido mediante centrifugación y almacenado a -20 °C hasta su análisis. Las células se resuspendieron en 1 mL de PBS1 para proceder a la determinación de proteínas.
El análisis cuantitativo se basó en el método del estándar interno. Se prepararon curvas de calibración para los ácidos grasos C8, C10, C12, y C14, en un rango de 0 a 150 nM, y C16 en un rango de 0-1000 nM, utilizando acilcarnitinas deuteradas en el último carbono, diluidas en MEM (p<0,00001 para cada curva de calibración).
El análisis de los ácidos grasos de los medios enriquecidos (curvas de calibración y productos de la incubación) fue realizado después de la hidrólisis con KOH.
Las curvas de calibración se obtuvieron mediante el análisis de regresión lineal, representando la relación de concentraciones de cada ácido respecto al estándar interno frente a la relación de áreas.
Las condiciones de la cromatografía gas-líquido fueron las siguientes: flujo de gas portador (He): 1 mL/ min; división de flujo: 1:30; tiempo de inyección: 1 min 5 segundos; temperatura del inyector: 250 °C; temperatura del horno y programación de temperaturas: T1 70 °C a 6 °C/min, T2 250 °C a 20 °C/min hasta T3 300 °C; volumen de inyección: 1 mL; tiempo total: 38.5 min.
Las condiciones de la espectrometría de masas fueron las siguientes: el análisis cualitativo se realizó por cromatografía de gases-espectrometría de masas, con impacto electrónico y monitorización selectiva de iones. Para cada ácido se monitorizó el ión M+-15, ya que es el ión selectivo y uno de los más abundantes; la ionización se realizó por impacto electrónico a 70 eV y la fuente de iones se mantuvo a una temperatura de 200 °C. La temperatura del analizador fue de 100 °C; para la adquisición de datos, el instrumento utilizó un scanning repetitivo en un rango de 40 a 600 unidades de masa atómica. Fue utilizado un cromatógrafo de gases 5890 Series II Plus - Espectrómetro de masas Hewlett Packard serie 5972, Palo Alto, CA.

RESULTADOS

En todas las curvas de calibración se obtuvo un coeficiente de correlación superior a 0,99. La Tabla I muestra la comparación de los valores obtenidos para los controles y los pacientes que presentan la deficiencia. La Figura 1 muestra los espectros de masas del ácido 2H3-palmítico (A) y del estándar interno (IS) ácido undecanodioico (B). La Figura 2 muestra el cromatograma de la mezcla de ácidos grasos deuterados de la curva de calibración, producto de la hidrólisis de las acilcarnitinas deuteradas. Se obtuvo un perfil característico en los cromatogramas de la deficiencia de OCTN2 y en los controles (Figura 3).

Tabla I. Producción de ácidos grasos deuterados en fibroblastos control y de pacientes con deficiencia primaria de carnitina (OCTN2), posterior a la incubación con ácido 2H3-palmítico.


Figura 1. Espectros de masas del ácido 2H3-palmítico (A) y del estándar interno (IS) ácido undecanodioico (B). Sobre la ordenada puede observarse la abundancia del ión y sobre la abcisa la relación masa/carga.


Figura 2. GC-MS-SIM de la mezcla de ácidos grasos deuterados de la curva de calibración. Están indicados según el número de átomos de carbono en la cadena así: C8, octanoico; C10, decanoico; C12, dodecanoico; C14, tetradecanoico; C16, hexadecanoico, así como el estándar interno (IS). Sobre la ordenada puede observarse la abundancia del ión y sobre la abcisa el tiempo de retención.


Figura 3. GC-MS-SIM de la incubación del ácido 2H3-palmítico en fibroblastos control y de pacientes con deficiencia primaria de carnitina. Están indicados los ácidos grasos deuterados según el número de átomos de carbono: C8, octanoico; C10, decanoico; C12:1, dodecenoico; C12, dodecanoico; C14:1, tetradecanoico; C14, tetradecanoico; C16, hexadecanoico. IS identifica el estándar interno. A, cromatograma de fibroblastos control; B, cromatograma de fibroblastos de pacientes con deficiencia de OCTN"; C. cromatograma de fibroblastos de pacientes que sufren la deficiencia, luego de añadir carnitina al medio de cultivo. Sobre la ordenada puede observarse la abundancia del ión y sobre la abcisa el tiempo de retención.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Los tioésteres Acil-CoA formados durante el proceso de b-oxidación mitocondrial, están confinados en la mitocondria debido a su incapacidad para atravesar la membrana mitocondrial, mientras que las acilcarnitinas pueden salir de la mitocondria y acumularse en el medio de incubación (8).
et al(9)idearon un método para el diagnóstico de las deficiencias de la b-oxidación, que consiste en la incubación de fibroblastos utilizando ácido [17,17,18,18-2H4]-9,12-octadecadienoico; es decir, ácido linoléico deuterado, en presencia de L-carnitina; al final de la incubación se valoran, con la ayuda de un espectrómetro de masas en tandem, las acilcarnitinas deuteradas en el medio de cultivo. Los resultados obtenidos son muy buenos, ya que se consigue establecer el diagnóstico de varias deficiencias de la beta oxidación mitocondrial, pero a pesar de ser una técnica altamente sensible y precisa, tiene el inconveniente de la accesibilidad para numerosos laboratorios en el mundo, dado los costos que implica, por lo que se han diseñado otras técnicas que determinan acilcarnitinas en medios de cultivo de fibroblastos por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas con monitoreo selectivo de un ion (GC-CI-MS y GC-MS) (10).
La incubación en presencia de sustrato deuterado en fibroblastos de pacientes con deficiencia primaria de carnitina (OCTN2), mostró una depresión severa de la oxidación de ácidos grasos, en su cromatograma (Figura 3, panel B). Se observó apenas que hay formación de ácidos deuterados. Sin embargo, al añadir carnitina al medio de incubación (Figura 3, panel C), el perfil de ácidos deuterados fue igual al de los individuos control. Este comportamiento se correlaciona perfectamente con el comportamiento in vivo, donde la administración de dosis farmacológicas de carnitina consigue en muchos casos una remisión clínica total; sin embargo, científicamente no se ha dilucidado si existe deficiencia de transportador, al agregar carnitina a los medios de cultivo o si al suministrarla a pacientes que sufren la deficiencia, la ruta metabólica se normaliza. Por lo tanto, esta técnica, al igual que la de la valoración de las acilcarnitinas, distingue perfectamente una deficiencia primaria de carnitina o deficiencia de OCTN2, del resto de las demás deficiencias de la b-oxidación.
Como conclusión se puede señalar que la deficiencia de OCTN2 presenta un patrón característico de ácidos grasos deuterados detectables mediante GC-MS después de incubar fibroblastos con ácido 3H2-palmítico, siendo un importante aporte diagnóstico. Al igual que en las pruebas in vivo, en la deficiencia de OCTN2, las células recuperan su capacidad de oxidación al suministrar L-carnitina.

Correspondencia

JOSÉ HENRY OSORIO
Universidad de Caldas
Departamento de Ciencias Básicas de la Salud -Calle 65 N0. 26-10
Manizales. Colombia
E-mail: jose.Osorio_O@ucaldas.edu.co

Referencias bibliográficas

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Aceptado para su publicación el 13 de junio de 2008