HEMOSTASIA Y TROMBOSIS

Glicosaminoglicanos en hemostasia: Acción del dermatán sulfato sobre el sistema fibrinolítico*

Glycosaminoglycans on hemostasis: Dermatan sulfate action on the fibrinolytic system

María Mercedes Castañon¹

1. Doctora de la Universidad de Buenos Aires, área Ciencias Químicas

Lugar de Trabajo:

Laboratorio de Hemostasia y Trombosis, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires.

* Trabajo presentado para optar al Premio Bienal FABA 2008
Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires
Premio Bienal FABA 2008

Resumen

El dermatán sulfato (DS) es un glicosaminoglicano endógeno, ampliamente conocido por su acción anticoagulante mediante su interacción con el cofactor II de la heparina para potenciar la inhibición de trombina. En los últimos años se ha sugerido que además el DS aumentaría la actividad fibrinolítica, aunque el mecanismo aún no ha sido completamente dilucidado. En este trabajo se presenta una revisión detallada de los resultados propios y una discusión de la bibliografía disponible respecto de la evaluación del efecto del DS sobre el sistema fibrinolítico. En estudios de activación fibrinolítica, por métodos amidolíticos y coagulométricos, el DS mostró tener efecto pro-fibrinolítico mediante potenciación de la activación de plasminógeno por t-PA y uPA, efecto independiente de su conocida acción anticoagulante. En estudios de caracterización de fibrina, las redes obtenidas en presencia de DS presentaron fibras más largas y delgadas que las redes control, mayor grado de compactación y de lisabilidad; efecto pro-fibrinolítico asociado a su acción anticoagulante. Los resultados presentados contribuyen al esclarecimiento del mecanismo de acción del DS sobre el sistema plasminógeno-plasmina y permiten plantear hipótesis sobre el rol fisiológico de este glicosaminoglicano.

Palabras clave: Dermatán sulfato; Activación de plasminógen; Activador del plasminógeno del tipo tisular; Activador del plasminógeno del tipo urinario; Red de fibrina; Estructura; Lisabilidad

Summary

Dermatan sulfate (DS) is well-known for its anticoagulant activity by binding to heparin cofactor II in order to enhance the antithrombin action. It has also been suggested that DS has a profibrinolytic effect, although the exact molecular mechanism is unknown. This review exposes the results obtained and discusses on the available literature on DS effect on the fibrynolytic system. DS exhibited a stimulating effect on the activation of plasminogen by plasminogen activators (t-PA and u-PA), by in vitro amidolytic and coagulometric methods, showing a pro-fibrinolytic effect independent of its known anticoagulant action. Studies of fibrin networks obtained in the presence of DS showed longer and thinner fibers than controls, increased degree of compaction and lisability. Thus, DS displayed a pro-fibrinolytic effect associated to its anticoagulant action. These results contribute to clarify the mechanism of DS action on the plasminogen-plasmin system and to the understanding of the physiologic role of this glycosaminoglycan.

Key words: Dermatan sulfate; Plasminogen activation; Tissue plasminogen activator; Urine plasminogen activator; Fibrin network; Structure; Lisability

Introducción

SISTEMA HEMOSTÁTICO

El sistema hemostático engloba al conjunto de factores y mecanismos que permiten que en condiciones fisiológicas la sangre circule fluidamente a través de los vasos sanguíneos, pero que ante una injuria vascular son los responsables de evitar la pérdida de sangre obturando el sitio de la lesión y de reconstituir el endotelio recuperando la luz del vaso. Para llevar a cabo esta función tan compleja intervienen diversos componentes interrelacionados tales como: el endotelio vascular, las plaquetas, los sistemas de coagulación y fibrinolítico con sus reguladores, otros sistemas enzimáticos plasmáticos (tales como el sistema complemento, calicreínas-quininas y renina-angiotensina), factores reológicos (como velocidad y viscosidad sanguínea) y células sanguíneas (leucocitos y eritrocitos).
El endotelio vascular sano participa en la función de mantener la fluidez de la sangre a través de diversos mecanismos: produciendo inhibidores de la coagulación, produciendo inhibidores de la agregación plaquetaria, modulando la fibrinolisis y regulando el tono y la permeabilidad vascular. Cuando el endotelio vascular se daña, se promueven diversos procesos fisiológicos, entre ellos la agregación plaquetaria y la activación del sistema de coagulación, provocando la formación del tapón hemostático (1). La participación de las plaquetas involucra reacciones de adhesión a la superficie subendotelial expuesta post-injuria, secreción de componentes intraplaquetarios y formación de agregados (2). Además, la membrana plaquetaria participa en la adsorción y concentración de factores de coagulación, promoviendo y acelerando la activación del sistema de coagulación. El sistema de coagulación involucra una serie de reacciones secuenciales en las cuales proenzimas plasmáticas o zimógenos de serinoproteasas son transformados en enzimas activas, y procofactores son transformados en cofactores (Fig. 1) (3). La naturaleza secuencial de estas reacciones amplifica el proceso global denominado cascada de coagulación, generando trombina. La trombina es la enzima responsable de la conversión del fibrinógeno en fibrina, un polímero insoluble que junto con las plaquetas y las otras células plasmáticas circulantes forman el coágulo que refuerza la acción del tapón plaquetario (4).

Figura 1. Esquema del sistema de coagulación.
Se indican los principales componentes del sistema de coagulación, vías de activación (líneas negras) e inhibición (líneas rojas).
Sistema de coagulación: factores de coagulación XII, XI, IX, X, VII, VIII, V y II (protrombina), factores de coagulación activados XIIa, XIa, IXa, Xa, VIIa, VIIIa, Va y IIa (trombina), factor tisular (FT), pre-calicreína (PK), calicreína (K), quininógenos de alto peso molecular (HMWK), iones calcio (Ca⁺⁺), célula endotelial (en rosa), membrana fosfolipídica (en verde).
Inhibidores fisiológicos: antitrombina (AT), cofactor II de la heparina (CH II), C1 inhibidor (C1-inh), inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) y sistema de la proteína C (trombomodulina (TM), proteína C (PC), proteína S (PS), proteína C activada (PCa), receptor de proteína C en célula endotelial (EPCR)).

Durante la formación del tapón hemostático, se inician simultáneamente mecanismos bioquímicos regulatorios destinados a limitar la extensión del proceso de coagulación y reestablecer el flujo sanguíneo normal. Este fenómeno involucra la acción de los inhibidores fisiológicos de la coagulación y la activación localizada del sistema fibrinolítico. La regulación del proceso de coagulación y fibrinolisis es dinámica, involucrando el equilibrio entre sustancias pro y anticoagulantes y pro y antifibrinolíticas.
La función del sistema fibrinolítico, también llamado sistema plasminógeno-plasmina, es degradar el coágulo formado para restablecer el flujo sanguíneo (Fig. 2). Este mecanismo está altamente regulado para permitir la reparación de la pared vascular sin comprometer la estabilidad del coágulo de manera temprana y para limitar la actividad fibrinolítica al área de la injuria (5-7).

Figura 2. Esquema del sistema fibrinolítico
Se indican los principales componentes del sistema fibrinolítico, vías de activación (líneas llenas) e inhibición (líneas punteadas).
t-PA = activador tisular del plasminógeno, sct-PA: de simple cadena, tct-PA: de doble cadena. u-PA = activador de plasminógeno de tipo urinario, scu-PA: de simple cadena o pro-uroquinasa (pro-UK), tcu-PA: de doble cadena, HMW-UK: de alto peso molecular, LMW-UK: de bajo peso molecular. PAI = inhibidor del activador del plasminógeno. C1-Inh = C1-inhibidor.

La plasmina es la enzima activa responsable de la degradación de fibrina y consecuentemente, de la lisis del coágulo. Esta serinoproteasa se genera por activación del zimógeno plasminógeno (Plg), por acción de los activadores de plasminógeno (PAs). Los activadores de plasminógeno más importantes en circulación son el activador de plasminógeno de tipo tisular o t-PA (8-9) y el de tipo urinario o u-PA (10), ambos pertenecientes a la familia de las serinoproteasas. Existe además otra vía fisiológica de activación de plasminógeno en la que participan los factores de la fase de contacto del sistema de coagulación (11) y activadores exógenos de plasminógeno que son utilizados en la terapia trombolítica (12).
La expresión de la actividad fibrinolítica es regulada por inhibidores fisiológicos que actúan a nivel de la activación de Plg (PAI-1 (13)(14), PAI-2 (15)(16) y C1- inhibidor) o directamente sobre la Plm (a2-antiplasmina (17-19) y a2-macroglobulina (20)). Además, mediante el inhibidor de fibrinolisis activable por trombina (TAFI) que participa en el balance entre la formación de fibrina y su degradación (21-23).
Si bien estos son los constituyentes principales involucrados en la lisis del coágulo, el sistema fibrinolítico es complejo y participan en su funcionamiento global otros zimógenos, proteasas, inhibidores, cofactores, moduladores y receptores que, a través de un delicado equilibrio, permiten limitar la activación de plasminógeno al sitio de la injuria.

GLICOSAMINOGLICANOS

Los glicosaminoglicanos (GAGs) son polisacáridos aniónicos, no ramificados, formados a partir de unidades repetidas de disacáridos, constituidos por unidades alternadas de un ácido urónico (ácido D-glucurónico (GluA) o ácido L-idurónico (IdoA)) y un amino-azúcar (D-galactosamina (GalN) o D-glucosamina (GluN)) (24).
Se diferencian seis tipos de GAGs: ácido hialurónico (AH), condroitín sulfato (CS), dermatán sulfato (DS), heparán sulfato (HS), heparina (Hep) y queratán sulfato (KS). Sin embargo, el AH no sería un GAG típico, ya que se presenta como una cadena muy larga de hidrato de carbono (miles de residuos de azúcar), formada por una secuencia regular y repetida de disacáridos (GluA (b 1→3) GluNAc (b 1→4)), mientras que el resto de los GAGs están formados por cadenas heterogéneas y más cortas (hasta 300 residuos de azúcar). Además el AH es el único GAG que no presenta ningún residuo de azúcar sulfatado y no interacciona covalentemente con proteínas, mientras que el resto de los GAGs presentan residuos sulfato y se unen a residuos serina de una proteína central a través de un trisacárido específico (xilosa-galactosa-galactosa) para formar proteoglicanos. Por otro lado, el KS se diferencia de los otros GAGs debido a que la unidad disacárido presenta una molécula de galactosa en lugar de un ácido urónico, por lo tanto no contiene grupos carboxilo en su estructura.
La estructura química de los GAGs se describe generalmente en función de la secuencia del disacárido que se repite con mayor prevalencia, el tipo de uniones entre las sub-unidades y los puntos típicos de sulfatación (Fig. 3). Sin embargo, cabe destacar que la composición real de los GAGs es compleja, por ejemplo el DS puede presentar en forma simultánea ambas formas de ácidos urónicos a lo largo de la cadena polisacárida (IdoA en forma mayoritaria y GluA en menor proporción) y puede tener uno o dos grupos sulfato por unidad de disacárido. Además, puede presentar zonas relativamente largas en las que prevalece el GluA seguidas de zonas en las que el ácido urónico más prevalente es el IdoA, que se conocen como bloques copoliméricos, así como número variable de unidades de disacáridos (25). Por otro lado, el CS, HS y Hep también pueden presentar en forma simultánea ambas formas de ácidos urónicos, siendo mayoritario el GluA en CS y HS y el IdoA en Hep. El HS y la Hep pueden presentar residuos de N-acetilglucosamina, glucosamina N-sulfato o N-acetilglucosamina-O-sulfato como amino-azúcares.

Figura 3. Estructura química de los glicosaminoglicanos
Se indica la secuencia del disacárido que se repite con mayor prevalencia y el peso molecular (PM) promedio de cada glicosaminoglicano.
Ácidos urónicos = ácido D-glucurónico (GluA) y ácido L-idurónico (IdoA). Galactosamina = Gal. Amino-azúcar = N-acetil galactosamina (GalNAc), N-acetil gluctosamina (GluNAc), glucosamina N-sulfatada (GluNS). 2S, 4S, 6S = O-sulfato en posición 2-, 4- ó 6-. R = H ó SO3- . R´ = CH3CO ó SO3-.

Debido a la presencia de numerosos grupos carboxilo y sulfato a lo largo de la cadena polisacárida, los GAGs presentan una carga electrostática negativa global y por lo tanto, son hidrofílicos y debido a repulsiones electrostáticas intramoleculares adoptan configuraciones extendidas que se podrían esquematizar como un esqueleto lineal de hidrato de carbono recubierto por radicales aniónicos (26). Además, debido a la flexibilidad de los enlaces glucosídicos, las cadenas de GAGs no tienen configuraciones rígidas, incluso debido a que el IdoA presenta dos conformaciones equienergéticas, se considera que aquellos GAGs que contienen ese ácido urónico son aún más flexibles que aquellos que contienen residuos más rígidos de GluA (27). Por lo tanto, los GAGs tienden a formar configuraciones lineales y flexibles, a diferencia de la mayoría de las cadenas polipeptídicas que presentan estructuras tridimensionales fijas y globulares o helicoidales.
Los GAGs se sintetizan en el aparato de Golgi por adición de mono o disacáridos que posteriormente son modificados por reacciones secuenciales de epimerización y sulfatación, excepto el AH que es sintetizado en microsomas asociados a membrana celular. Fisiológicamente los GAGs se encuentran en formas solubles o unidas covalentemente a núcleos proteicos formando proteoglicanos (PG). Las cadenas proteicas de los PG son sintetizadas en el retículo endoplasmático rugoso de la mayoría de las células y luego en el aparato de Golgi se adicionan al núcleo proteico múltiples cadenas de polisacáridos (90-95% del peso total), en número y composición variable (28).
En los tejidos, los PG se localizan intracelularmente (en gránulos secretores), en las superficies celulares, en la matriz extracelular y en las membranas basales (29). Todos los GAGs, excepto Hep que se encuentra intracelularmente en mastocitos del tejido conectivo y otras células hematopoyéticas que participan en la respuesta inmune e inflamatoria, están presentes como PG en la matriz extracelular, donde participan principalmente en procesos de difusión de moléculas hidrosolubles, migración, proliferación y adhesión celular. En superficies celulares han sido descriptos PG derivados de HS en la mayoría de los tipos celulares, proteoglicanos derivados de HS, CS y DS principalmente en células epiteliales y fibroblastos y PG derivados de CS y HS en células nerviosas (30). Estos PG participan en interacciones célula-matriz extracelular, adhesión célula-célula y señalización celular. En sangre sólo se encuentran pequeñas cantidades de GAGs, en plasma y en células sanguíneas como plaquetas y leucocitos, presentes en su mayoría como PG de CS, HS y KS y en menor proporción de Hep, probablemente productos del catabolismo de PG tisulares (31).

GLICOSAMINOGLICANOS EN HEMOSTASIA

La mayoría de las actividades biológicas de los GAGs están mediadas por interacciones con proteínas tisulares o plasmáticas, como proteínas de captación de lipoproteínas, factores de crecimiento polipeptídicos, proteínas de la matriz extracelular, moléculas de adhesión y proteasas y anti-proteasas plasmáticas.
En hemostasia, los GAGs son conocidos por sus propiedades anticoagulantes. El HS y la Hep actúan como catalizadores en la inhibición de factor Xa y de trombina por la antitrombina III, actualmente denominada antitrombina (AT). El DS actúa como potenciador en la reacción de inhibición de trombina por el cofactor II de la heparina (CH II). Por otro lado, el CS forma parte estructural de la trombomodulina (TM) y presenta propiedades anticoagulantes mediante: a) aumento de la afinidad de TM por trombina, potenciando la inhibición de los cofactores Va y VIIIa mediada por el sistema de la proteína C, b) estimulación de la inhibición de trombina por AT, c) estimulación de la inhibición de proteína C por el inhibidor de la proteína C y d) modulación de la dependencia de iones calcio para la activación de la proteína C (32). Además, en presencia de Hep el inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-1) unido a vitronectina adquiere capacidad de inhibir trombina (33).
Si bien el mecanismo de acción de los GAGs incluiría interacciones iónicas inespecíficas entre los grupos aniónicos de los GAGs y grupos catiónicos de las proteínas, se ha demostrado que algunas de las actividades biológicas más relevantes de los GAGs dependen de una secuencia específica de disacáridos y un típico patrón de grupos sulfato y carboxilo (34). En particular los mecanismos de acción más ampliamente estudiados son la interacción de Hep y DS con AT y CH II, respectivamente.

Trombina - Antitrombina - Heparán sulfato y Heparina: In vivo, la AT es el principal inhibidor plasmático de trombina y además, tiene la capacidad de inhibir otras serinoproteasas de la cascada de coagulación, factores Xa, IXa, XIa, XIIa, calicreína y el complejo VIIa-FT, regulando tanto la acción de trombina como su generación.
El mecanismo de inhibición de las serpinas se conoce con el nombre de "sustrato suicida" ya que presentan un sitio reactivo (reactive center loop, RCL) que es reconocido por el sitio catalítico de las serinoproteasas como sustrato. La formación del complejo de inhibición comienza cuando la enzima cliva el enlace sensible (P1-P1') presente en el RCL de la serpina generándose un enlace covalente entre el residuo P1 y el aminoácido serina del sitio catalítico de la serinoproteasa. Este complejo inicial, luego sufre un cambio conformacional en el que la serinoproteasa es translocada desde el polo reactivo de la serpina hacia el polo opuesto, lo que produce la distorsión de su sitio reactivo y la pérdida de actividad. En particular, la AT es un inhibidor poco eficiente en comparación con la mayoría de las serpinas, ya que el RCL se encuentra parcialmente escondido en su estructura lo que dificulta el acceso de las serinoproteasas al enlace P1-P1' (Fig. 4 A). Sin embargo, en presencia de Hep o HS que actúan como cofactores, la AT expone completamente su sitio reactivo aumentando su capacidad de inhibición de serinoproteasas (35). Este efecto depende de la presencia de una secuencia pentasacárida específica, presente en el 30% de las moléculas de Hep farmacéuticamente activas y fisiológicamente en proteoglicanos derivados de HS presentes en la pared vascular o en la matriz extravascular (36). Si bien en presencia del pentasacárido especifico, la inhibición de factor Xa y IXa aumenta aproximadamente 300 veces, la inhibición de trombina aumenta sólo 2 veces; mientras que en presencia de una cadena de GAGs de más de 18 disacáridos que contenga el pentasacárido, la velocidad de inhibición de trombina, factor Xa y IXa aumenta 1000 veces debido a un efecto adicional tipo templado o puente (Fig. 4 B). En el modelo de templado, la molécula de AT se une al pentasacárido específico de la cadena de GAGs y se produce el cambio conformacional que expone el sitio reactivo, por otro lado la misma cadena de GAGs une trombina a través del exositio II, y como consecuencia se acercan ambos sitios reactivos y se favorece la reacción de inhibición. Fisológicamente, AT-Hep o AT-HS inhiben más eficientemente factor Xa y trombina libres que unidos a superficies celulares o a fibrina; neutralizando principalmente la generación y las acciones de trombina fuera del sitio de la injuria (37).

Figura 4. Mecanismo de activación de antitrombina por heparina
A: Cambio conformacional de la antitrombina (AT) en presencia del pentasacárido de heparina, exposición del centro reactivo RCL (reactive center loop).
B: Esquema del mecanismo de interacción entre heparina-AT-factor Xa y heparina-AT-trombina (IIa). J Thromb Haemost 2003; 1: 1535-49.

Trombina - Cofactor II de la heparina - Dermatán sulfato: El CH II también pertenece a la familia de las serpinas, pero a diferencia de AT, no es un inhibidor de proteasas de amplio espectro, sino actúa principalmente como inhibidor de trombina y meizotrombina (38)(39).
La inhibición de trombina por el CH II aumenta aproximadamente 1000 veces en presencia de Hep, HS y DS. En particular, mientras la cantidad de Hep necesaria para potenciar CH II es 20 veces mayor que la necesaria para potenciar AT, el DS es un potente activador de CH II y sólo tiene mínimo efecto sobre AT (40).
La molécula de CH II presenta en su estructura un dominio acídico N-terminal de reconocimiento de trombina, unido intra-molecularmente a un dominio electropositivo denominado sitio de unión a GAGs. En presencia de DS se produce un desplazamiento del extremo N-terminal del CH II (Fig. 5 A), quedando libre para interactuar con el exositio I de la trombina, lo que acerca ambos sitios reactivos y facilita la reacción de inhibición (41). El mecanismo alostérico de potenciación de la inhibición de trombina por CH II mediado por DS no requiere de la unión del GAG a trombina (Fig. 5 B), por lo tanto el complejo CH II-DS es mejor inhibidor de meizotrombina y trombina unida al coágulo que el complejo AT - Hep o HS (42). El mecanismo de potenciación mediado por Hep sería similar al mecanismo templado propuesto para AT, la Hep se uniría al dominio de unión a GAGs del CH II provocando el cambio conformacional responsable de la exposición del dominio acídico N-terminal y también se uniría a trombina a través del exositio II acercando ambas moléculas (Fig. 5 B).

Figura 5. Mecanismo de activación de cofactor II de la heparina por dermatán sulfato y heparina
A: Cambio conformacional del cofactor II de la heparina (CH II) en presencia de dermatán sulfato, exposición del centro reactivo RCL (reactive center loop) y desplazamiento del extremo N-terminal.
B: Esquema del mecanismo de interacción entre CH II-trombina (IIa)-glicosaminoglicanos (GAGs), heparina (Hep) y dermatán sulfato (DS). J Thromb Haemost 2003; 1: 1535-49.

Se ha descripto una secuencia hexasacárida específica de DS (tres repeticiones del disacárido IdoA 2S (a 1→3) GalNAc-4S (b 1→4)) que presenta alta afinidad por el CH II, aunque se encontraría en baja proporción en DS de mamíferos y tendría menor actividad cofactor que el DS intacto. Por otro lado, se ha descripto que el CH II se uniría de manera no específica a oligosacáridos de Hep de al menos cuatro unidades de longitud, indicando que los sitios de unión Hep-CH II y DS-CH II no serían idénticos (43).
Fisiológicamente el CH II es responsable de la inhibición extravascular de trombina, donde es potenciado por PG derivados de DS sintetizados por fibroblastos y células de músculo liso de la matriz subendotelial. Además, se han propuesto otras funciones para el CH II como participar en la regulación de trombina durante el embarazo, en la regulación de procesos inflamatorios, regeneración de tejidos y reparación tisular (37)(44)(45).

DERMATÁN SULFATO COMO DROGA ANTITROMBÓTICA

Normalmente el DS no se encuentra en circulación, siendo casi nulos los niveles plasmáticos detectados en individuos sanos, sin embargo se han reportado niveles elevados de DS en mujeres embarazadas a término y en sus fetos (46), en pacientes en hemodiálisis crónica (47), pacientes quemados (48) y pacientes sépticos (49).
Como droga antitrombótica, el DS ha demostrado ser clínicamente efectivo y seguro en tratamiento y profilaxis del tromboembolismo venoso en cirugía general (50), ortopédica (51)(52) y oncológica (53)(54) y en tratamiento de trombosis venosa profunda (55)(56), con igual o menor incidencia de complicaciones por sangrado que la Hep. También, ha sido administrado exitosamente como anticoagulante en pacientes con trombocitopenia inducida por Hep (57)(58), en pacientes hemodializados (59)(60) y en tratamiento de coagulación intravascular diseminada en pacientes con leucemia aguda (61).
Comercialmente se encuentran disponibles preparaciones de DS de alto (DSA) y bajo peso molecular (DSB), 20 a 40 kDa y 3 a 6 kDa respectivamente, siendo el DSA la isoforma nativa. Si bien, ambas formas presentan similar efecto antitrombótico cuando son administradas por vía endovenosa, se ha reportado que la biodisponibilidad de las preparaciones de alto peso molecular sería menor cuando se administran por vía intramuscular o subcutánea (62)(63).
Estudios en diferentes modelos experimentales animales, han evidenciado que el DS previene la trombosis venosa con un menor efecto hemorrágico que la Hep. Por ejemplo, en un modelo de trombosis en conejos se observó que el máximo efecto antitrombótico se obtenía con 70 μg y 500 μg/kg de Hep y DS respectivamente, y que mientras un aumento de 20 veces en la dosis de Hep causaba un incremento del sangrado, un aumento de hasta 40 veces en la dosis de DS no incrementaba el sangrado (64). Además, en un modelo de trombosis en ratas se observó que DS causaba un 70% de inhibición del trombo sin prolongar el tiempo de sangría, mientras que Hep y HS a dosis equipotentes presentaban una prolongación significativa del tiempo de sangría (65).
En particular, dependiendo del estímulo de iniciación del trombo, el DS mostró ser más efectivo en inhibir la formación de fibrina por agregado de trombina que cuando se utiliza factor Xa o tromboplastina; mientras que la Hep es más efectiva cuando el estímulo inicial es factor Xa y menos efectiva cuando se utiliza tromboplastina o trombina (66). Estas diferencias se deberían principalmente al mecanismo de acción de ambos GAGs, ya que el complejo DS-CH II es un inhibidor directo de trombina y no tiene acción sobre factor Xa.
Además se ha reportado que el DS inhibe el crecimiento del trombo preexistente, alcanzando un efecto máximo de entre 70 y 90 % de inhibición de la extensión de la trombosis venosa establecida (67)(68), y que es más efectivo que la Hep, trabajando a actividades antitrombínicas equivalentes (69). Este efecto se debería a que el complejo DS-CH II es más efectivo que Hep-AT en la función de inhibir trombina unida al coágulo o formando el complejo protrombinasa.

DERMATÁN SULFATO COMO DROGA PRO-FIBRINOLÍTICA

La acción pro-fibrinolítica del DS fue reportada por primera vez en el año 1987, cuando Abbadini et al. (70) mostró que el DS inducía la liberación de t-PA de célula endotelial in vivo en un modelo de perfusión en ratas, y que la Hep en el mismo modelo no tenía efecto significativo. Posteriormente, el DS fue asociado, además de a la inhibición de la formación y el crecimiento del trombo, a la reducción del peso del trombo formado en función del tiempo y la dosis (71-73).
Si bien la capacidad de reducir el tamaño del trombo podría deberse a su capacidad de inhibir el crecimiento, lo que permitiría que el sistema fibrinolítico actué sin oposición, se observó que la hirudina, inhibidor específico de trombina, siendo igualmente efectiva en prevenir el crecimiento del trombo no produjo reducción de peso del mismo (71). Además, en un modelo de trombosis en ratas afibrinogenémicas por tratamiento con ancrod, el DS retuvo su efecto antitrombótico (74). El ancrod es un veneno de víbora Agkistrodon rhodostoma que produce la liberación de fibrinopéptidos A del fibrinógeno, induciendo la formación de fibrina soluble no entrecruzada que es rápidamente depurada de la circulación por el sistema fagocítico-mononuclear, provocando la depleción de fibrinógeno y previniendo de manera total el crecimiento del trombo (75).
En función de estos resultados, se ha propuesto que la estimulación de la disolución del trombo mediada por DS sería por una vía alternativa, independiente del mecanismo anticoagulante. Evidencia extra a favor de un mecanismo independiente del anticoagulante surgió a partir de estudios en los que la administración de inhibidores de la fibrinolisis como ácido 6-aminohexanoico (EACA), que inhibe la activación de plasminógeno, o lipopolisacáridos, que inducen la elevación de niveles de PAI-1, inhibió la reducción del peso del trombo esperada en presencia de DS (71-73). A partir de estos resultados se propuso que la prevención de la formación del trombo mediada por DS se debería a su efecto inhibitorio de la coagulación, mientras que la reducción del peso del trombo se debería principalmente a un mecanismo independiente del anticoagulante, probablemente relacionado con el sistema fibrinolítico endógeno. Sin embargo, no pudo demostrase que por administración endovenosa de DS aumentara la actividad fibrinolítica sanguínea, ni se modificaran los niveles plasmáticos de los activadores o inhibidores de plasminógeno, tanto en modelos animales (71-73) como en voluntarios humanos sanos (76-78). Por lo tanto, el efecto pro-fibrinolítico propuesto fue asociado a un fenómeno localizado, probablemente relacionado con un aumento local del sistema fibrinolítico endógeno; aunque el mecanismo molecular que conduciría a la potenciación de la disolución del trombo in vivo, aún no había sido dilucidado.

Acción del dermatán sulfato sobre el sistema fibrinolítico

El proceso fibrinolítico involucra principlamente la activación de plasminógeno a plasmina mediada por los activadores de plasminógeno y la acción de la plasmina sobre la fibrina para producir la lisis del coágulo. Aunque existe una gran cantidad de proteínas moduladoras de cada una de las etapas de este proceso, se podría decir que los principales componentes involucrados en este sistema son: plasminógeno, plasmina, los activadores de plasminógeno de tipo tisular (t-PA) y urinario (u-PA) y fibrina.
Existen diferentes maneras de abordar el estudio del sistema fibrinolítico. Los métodos amidolíticos, que se caracterizan por el uso de sustratos cromogénicos específicos, presentan la ventaja de que permiten evaluar independientemente la actividad biológica de cada uno de los componentes involucrados en el sistema. Sin embargo, como se trata de sustratos sintéticos puede existir diferencia respecto de la actividad biológica frente al sustrato natural. Por otro lado, los métodos coagulométricos en general estudian la actividad fibrinolítica global, evaluando el balance entre la acción de los activadores y los inhibidores fibrinolíticos en la función global de lisar un coágulo formado a partir de componentes plasmáticos. En estos casos, como la fibrina formada es el sustrato de la reacción lítica, las características de su arquitectura y las dimensiones de sus fibras tienen decisiva importancia respecto de la velocidad del proceso de fibrinolisis.
Teniendo en cuenta que el DS tiene acción anticoagulante potenciando al CH II como inhibidor de trombina, el trabajo con sistemas purificados utilizando sustratos cromogénicos sintéticos permite estudiar los posibles efectos del DS sobre el sistema fibrinolítico de manera independiente de su conocido efecto anticoagulante, y además analizar diferentes etapas de la activación de la fibrinolisis pudiendo de este modo proponer un mecanismo de acción. Sin embargo, aunque el uso de los métodos coagulométricos presenta una mayor dificultad para reconocer de manera clara un efecto puramente fibrinolítico respecto de una consecuencia experimental del efecto anticoagulante, también es importante considerar el estudio del efecto del DS sobre el sistema fibrinolítico por esta metodología.
Para el desarrollo de los ensayos in vitro se utilizó DS de origen bovino, provisto por el Laboratorio Syntex S.A., Buenos Aires, Argentina. Se utilizó una presentación de alto peso molecular (DSA) y otra de bajo peso molecular (DSB), cuyas características químicas fueron: peso molecular 20 a 30 kDa y 3 a 5 kDa, rotación específica -61° y -52°, contenido de azufre 6,2% y 5,9%, hexosaminas 30,5% y 35,9% y ácidos urónicos 36% y 33,8% respectivamente. Ambas formas de DS presentaron un perfil electroforético tipo monobanda que no fue afectado por tratamiento con ácido nitroso, indicando ausencia de contaminación con Hep.

EFECTO DEL DS SOBRE LA ACTIVIDAD DE COMPONENTES DEL SISTEMA FIBRINOLÍTICO

Se estudió el efecto del DSA y DSB sobre la actividad de los principales componentes del sistema fibrinolítico, trabajando con sistemas purificados y sustratos cromogénicos sintéticos (79)(80).

Efecto del DS sobre la activación de plasminógeno por t-PA y u-PA

Se observó un aumento de la reacción de activación de plasminógeno por t-PA y u-PA en función del aumento de la concentración de DS. Este efecto fue corroborado a diferentes concentraciones de los activadores (81-83).
En particular, el uso de productos de degradación de fibrina y fibrinógeno (PDF) como control positivo de estimulación en la reacción de activación por t-PA (84), permite señalar que el efecto máximo observado en presencia de DSA sobre la reacción de activación de plasminógeno por t-PA y u-PA resultó de similar magnitud al efecto obtenido en presencia de fibrina sobre la reacción de activación por t-PA, mientras que el efecto del DSB, a la misma concentración estudiada, fue de menor magnitud. Además, la combinación de PDF y DS no resultó en un efecto adicional sobre la estimulación de plasminógeno por t-PA (81-83).
Por otro lado, se estudió la conversión de plasminógeno a plasmina por electroforesis (SDS-PAGE con urea) comprobando la aparición más temprana de la banda correspondiente a plasmina acompañada de la desaparición de la banda de plasminógeno en presencia de DSA y DSB (81). Cabe destacar que el efecto observado fue mayor con DSA, en concordancia con los resultados de los estudios amidolíticos.
Estos resultados coinciden con el efecto potenciador del DS observado en estudios in vitro de activación de plasminógeno por t-PA realizados por Kyogashima et al. (85). Sin embargo, no se puede comparar de manera directa la magnitud de los factores de potenciación obtenidos debido a que el modo de análisis de los resultados es diferente y además, debido a que no informan resultados de estudios realizados en las mismas condiciones experimentales en presencia de fibrina. Por otro lado, el DS de origen bovino utilizado en el trabajo citado presenta un peso molecular de 16 kDa y resulta un producto intermedio entre el DSA (20-30 kDa) y DSB (3-5 kDa) utilizado en nuestros trabajos de investigación. Al respecto, cabe recordar que si bien la mayoría de las preparaciones de DS disponibles son de origen bovino y porcino, presentan gran heterogeneidad química y diferentes propiedades farmacológicas principalmente dependiendo del peso molecular (25) y la vía de administración (62)(63).

Efecto del DS sobre la actividad de plasmina y de los activadores de plasminógeno

En el ensayo cromogénico de activación de plasminógeno se registra la actividad amidolítica de la plasmina formada y el aumento de la hidrólisis del sustrato S-2251 puede deberse en parte a un aumento de la actividad de la plasmina generada y/o de los activadores de plasminógeno. Para asignar con certeza el efecto pro-fibrinolítico observado al proceso de activación de plasminógeno se evaluó el efecto del DS sobre la actividad de plasmina preformada (S-2251) y sobre u-PA (S-2444).
Se observó que el DS no tuvo efecto apreciable sobre la actividad amidolítica de plasmina (86) ni de u-PA (81). Además, la conversión de u-PA de simple cadena (scu-PA o pro-uroquinasa) a doble cadena (tcu-PA o uroquinasa activa), por acción de plasmina, tampoco fue influenciada por DS.
Si bien no se evaluó el efecto de DS sobre la actividad amidolítica de t-PA, teniendo en cuenta que la magnitud del efecto del DS en los ensayos de activación de plasminógeno por u-PA y t-PA fue similar, podría concluirse que el efecto pro-fibrinolítico observado no sería atribuible a un aumento de la actividad de los activadores de plasminógeno en general.
Por lo tanto, debido a que fue descartado que el efecto observado sea atribuido a un aumento de la actividad amidolítica de plasmina o a un aumento de la actividad de los activadores de plasminógeno, se puede concluir que el DS potenciaría de manera directa el proceso de activación de plasminógeno.
Resultados similares fueron obtenidos con otros GAGs. Se ha reportado que la Hep, el HS y el CS aumentan la activación de plasminógeno mediada por t-PA y u-PA (87-94). Estos GAGs no tienen efecto sobre la hidrólisis de S-2251 por plasmina (90)(92)(94), ni sobre la actividad amidolítica de u-PA o t-PA frente a sus respectivos sustratos cromogénicos sintéticos (87-90). Además, se ha reportado que los efectos combinados de Hep y PDF sobre la reacción de activación de plasminógeno por t-PA no son aditivos (87)(91).

Efecto del DS sobre la activación de Lys-plasminógeno por t-PA y u-PA

Profundizando en el mecanismo asociado al efecto pro-fibrinolítico observado, debe recordarse que en condiciones fisiológicas el plasminógeno nativo (Plg o Glu-Plg) presenta una configuración cerrada debido a la interacción no covalente entre la porción N-terminal y los sitios LBS (lisine binding sites) presentes en los dominios kringles, y que por interacción a través de sus sitios LBS con la fibrina cambia a una conformación abierta y flexible que resulta más fácilmente activada por los activadores de plasminógeno (95). Por lo tanto, teniendo en cuenta que el DS estimuló con magnitud similar la activación de plasminógeno tanto por t-PA como por u-PA, sería posible que el aumento observado se deba a un cambio conformacional que facilite el acceso de los activadores de plasminógeno al sitio de activación.
Para evaluar esta hipótesis se estudió el efecto del DS sobre la activación de Lys-Plg por los diferentes activadores utilizados (96)(97). Los efectos observados sobre la reacción de activación de Lys-Plg fueron de similar magnitud a los observados previamente con Glu-Plg. En particular, el efecto potenciador observado en presencia de DSA sobre la reacción de activación de Lys-Plg por t-PA y u-PA resultó de similar magnitud al efecto obtenido en presencia de PDF utilizados como control positivo de estimulación en la reacción de activación por t-PA, mientras que el efecto del DSB fue de menor magnitud (81)(98).
Por lo tanto, debido a que el Lys-Plg representa la configuración abierta del Glu-Plg, si no se hubiera observado efecto sobre la reacción de activación de Lys-Plg se podría haber concluido que el efecto del DS estaría relacionado con el cambio de configuración del Glu-Plg de su forma cerrada a la forma abierta. Sin embargo, debido a que también se observó un efecto potenciador del DS sobre la activación de Lys-Plg se debería pensar en algún otro tipo de cambio conformacional o en una interacción directa entre el DS y los activadores del plasminógeno.
Otros GAGs, Hep y HS, han mostrado comportamientos similares respecto de la reacción de activación de Lys-Plg por t-PA y u-PA, demostrando que la transición de la forma cerrada a la forma abierta del plasminógeno no sería la explicación del aumento observado sobre la reacción de activación (88)(92).

Efecto del DS sobre la activación de plasminógeno por estreptoquinasa (SK)

Para ahondar en el entendimiento del mecanismo de acción del DS en la etapa de activación de plasminógeno se estudió su efecto sobre la reacción de activación de plasminógeno (Glu-Plg y Lys-Plg) mediada por el activador exógeno estreptoquinasa (SK) (99). Se observó que el DSB potenció la reacción de activación de Glu-Plg por SK y que el DSA inhibió la reacción, ambos efectos de manera concentración dependiente (100).
Es sabido que durante la reacción de activación de plasminógeno por SK todos los dominios de la molécula de SK participan en la formación del complejo con plasminógeno (101)(102). Por lo tanto, teniendo en cuenta la diferencia entre el efecto observado en presencia de DSA y DSB, podría descartarse la interacción directa entre SK y DS, ya que en ese caso ambas formas de DS deberían haber tenido el mismo efecto. Además, como el efecto de DSB fue de similar magnitud a las diferentes concentraciones del activador utilizadas (100), podría plantearse que la interacción sería con la molécula de plasminógeno.
Por otro lado, los efectos observados sobre la reacción de activación de Lys-Plg por SK fueron de similar magnitud a los observados previamente con Glu-Plg. Estos resultados coinciden con los obtenidos previamente en los ensayos de activación de plasminógeno por u-PA y t-PA reforzando el concepto de que la transición de la forma cerrada a la forma abierta del plasminógeno no sería la explicación del aumento observado sobre la reacción de activación de plasminógeno en presencia DS.

Un mecanismo probable para el efecto pro-fibrinolítico del DS

Considerando que la combinación de PDF y DS no resultó en un efecto adicional sobre la estimulación de Glu o Lys-Plg por t-PA, podría inferirse que ambas sustancias compartirían los sitios de unión sobre la molécula de t-PA y/o plasminógeno y que ese sitio de interacción no estaría relacionado con la porción N-terminal del plasminógeno. Incluso, teniendo en cuenta los sitios de unión a fibrina en las moléculas de plasminógeno y t-PA, se podría especular que los sitios involucrados en la interacción con DS podrían ser los dominios kringle 5 y 1 del plasminógeno y los dominios kringle 2 y finger del t-PA.
Por otro lado, a partir de los resultados obtenidos en los ensayos de activación de plasminógeno con SK, se habia propuesto una interacción directa entre DS y plasminógeno. En particular esta interacción no sería sobre el sitio de unión a SK en la molécula de plasminógeno (kringle 5), ya que en ese caso ambas formas de DS hubieran afectado la formación del complejo de activación. Incluso, sería probable que el DS interaccione con la molécula de plasminógeno en un sitio distinto pero cercano al sitio de unión a SK, de modo que el DSA por su longitud interferiría en la formación del complejo de activación mientras que el DSB al tener menor longitud no afectaría esta etapa de la reacción.
Por lo tanto, integrando estos resultados podría especularse que el DS se uniría al plasminógeno a través del dominio kringle 1.
En síntesis, los resultados disponibles por métodos amidolíticos apoyan la hipótesis de que el DS tiene efecto pro-fibrinolítico. Un mecanismo probable sería mediante potenciación de la activación de plasminógeno por u-PA y t-PA. En particular, de modo análogo al rol propuesto para la fibrina en el sistema fibrinolítico, el DS podría actuar como una superficie que permitiera la formación de un complejo trimolecular, plasminógeno-DS-activador, facilitando y acelerando la conversión a plasmina.
En relación con esta hipótesis, si bien no se dispone de estudios adicionales con DS, se ha reportado que la Hep se uniría a varios componentes del sistema fibrinolítico, en particular se uniría con alta afinidad al t-PA, u-PA y Lys-Plg y con menor afinidad al Glu-Plg (92). Se ha descripto que los sitios de unión a Hep en la molécula de t-PA coincidirían con los sitios de unión a fibrina, dominios finger y kringle 2, aunque el t-PA se uniría a fibrina principalmente a través del dominio kringle 2 y a Hep principalmente a través del dominio finger (103). Se ha reportado un sitio de unión a Hep en el dominio kringle del u-PA (104) y respecto del plasminógeno en el fragmento Val442-Plg (kringle 5 + dominio catalítico) (105). Incluso, se ha planteado la hipótesis de que la Hep podría actuar como una superficie que uniera plasminógeno y t-PA, facilitando y acelerando la conversión a plasmina (87)(92). Aunque, Liang et al. (106) mostró que la estimulación de la activación de plasminógeno por t-PA no respondía a un modelo templado y propuso que la Hep se uniría directamente al t-PA, provocando un cambio conformacional que favorecería la interacción con plasminógeno.
Retomando la discusión de nuestros resultados, sobre la base de un mecanismo templado podrían explicarse las diferencias de efecto observadas entre el DSA y DSB. En presencia de un molde o templado corto que no pudiera unir simultáneamente ambas moléculas (plasminógeno y activador), el efecto global de potenciación no podría tener lugar, sin embargo podría detectarse un efecto parcial debido a la interacción entre el templado y la enzima o el sustrato. Mientras que, en presencia de un templado suficientemente largo como para unir la enzima y el sustrato, la reacción de potenciación tendría lugar de manera eficiente. En particular, esta hipótesis está basada en el hecho de que en presencia de DSB el efecto observado fue de similar magnitud a distintas concentraciones de los activadores, mientras que en presencia de DSA el efecto potenciador aumentó su magnitud con el aumento de la concentración de los activadores. El DSB se uniría solamente a la molécula de plasminógeno, mientras que el DSA se uniría simultáneamente al plasminógeno y al activador (tanto u-PA como t-PA).
Respecto de esta hipótesis, otros autores han reportado que el efecto de la Hep sería dependiente de su capacidad de unir simultáneamente t-PA y plasminógeno, y por lo tanto, dependería de la longitud del oligosacárido (107). Los oligosacáridos de Hep más cortos interaccionarían con t-PA, mientras que los oligosacáridos de cadena larga podrían interactuar con t-PA y plasminógeno potenciando la conversión a plasmina (108).

EFECTO DEL DS SOBRE LA FORMACIÓN, ESTRUCTURA Y LISABILIDAD DE REDES DE FIBRINA

Teniendo en cuenta que la velocidad del proceso de lisis no sólo depende de la actividad de los componentes del sistema fibrinolítico, sino de las características de las fibras y la estructura de la red de fibrina a lisar, se estudió el efecto del DS sobre la formación y estructura de la fibrina para poder evaluar como las características de las redes obtenidas en presencia de DS influyen en su lisabilidad. Debe recordarse que para estudiar el efecto del DS sobre el sistema fibrinolítico por métodos coagulométricos, es necesario poder discriminar su efecto anticoagulante de un efecto profibrinolítico neto en los ensayos de lisis.

Efecto del DS sobre la formación de redes de fibrina

La formación y estabilización de la red de fibrina es el proceso por el cual el fibrinógeno soluble es convertido en un gel de fibrina insoluble por acción de trombina y FXIIIa (4). Este proceso ocurre en tres etapas: clivaje de los fibrinopéptidos A y B del fibrinógeno por acción de trombina, polimerización de los monómeros de fibrina y estabilización covalente de la red por acción del FXIIIa.
Se realizaron estudios cinéticos de fibrinoformación, donde se evaluó por espectrofotometría las etapas de liberación de fibrinopéptidos y polimerización de los monómeros para formar el gel de fibrina. En todas las concentraciones ensayadas el DS presentó acción anticoagulante, siendo mayor el efecto observado en presencia de DSA que en presencia de DSB para la misma concentración estudiada (109)(110). El efecto del DS sobre la formación de fibrina plasmática se caracterizó por aumento de la fase de latencia (asociada al tiempo de inicio de la coagulación), disminución de la velocidad de fibrinoformación, prolongación del tiempo de fibrinoformación (asociado a la formación completa del coágulo) y disminución de la densidad óptica máxima.
Los parámetros fase de latencia, velocidad y tiempo de fibrinoformación caracterizan la cinética de formación de fibrina producto de la acción de trombina sobre el fibrinógeno; por lo tanto, el efecto observado representa la inhibición de la actividad de trombina debido a la interacción DS-CH II-trombina y la expresión del conocido efecto anticoagulante del DS. Por otro lado, como la densidad óptica máxima está relacionada con la estructura tridimensional de la red formada, el efecto observado estaría indicando la formación de una red de fibrina más abierta y transparente.
Si bien no se dispone de otros reportes vinculados con la influencia del DS sobre la cinética de fibrinoformación, resultados similares a los obtenidos con DS han sido reportados con Hep de bajo peso molecular (111).

Efecto del DS sobre la estructura de redes de fibrina

Las características de la red de fibrina dependen de varios factores: temperatura, pH, fuerza iónica del medio (112), iones calcio (113), concentración de fibrinógeno y trombina (114) y presencia de otras proteínas plasmáticas (115), en particular de los inhibidores de trombina (116).
Se evaluó el efecto del DS sobre la rigidez de la red de fibrina (ensayos de compactación) y su estructura tridimensional (microscopía electrónica).

Ensayos de compactación: Los geles de fibrina formados en presencia de DS resultaron más fácilmente compactables (110), siendo mayor el efecto observado en presencia de DSA que en presencia de DSB para la misma concentración estudiada. En el caso de geles de fibrina la compactación depende de la resistencia a la ruptura de la estructura de la red y del tamaño del compartimiento líquido limitado por esa estructura (117)(118). En particular, la fibrina que muestra mayor grado de compactación se considera formada por fibras más frágiles o separadas por grandes poros (119).

Microscopía electrónica de redes de fibrina: Las redes formadas en presencia de DSA presentaron igual densidad de fibras, más largas y delgadas que las fibras control, resultando una arquitectura más abierta (109)(110). Estos resultados coinciden con los obtenidos en los estudios de fibrinoformación en los que, la disminución de la densidad óptica final de la red de fibrina formada en presencia de DS sugería una estructura más abierta y transparente.
Es sabido que al aumentar la concentración de trombina (entre 0,05 y 0,5 U/mL) la red de fibrina aumenta su ramificación y densidad de fibras (120). Teniendo en cuenta que el DS potencia la inhibición de trombina mediada por el CH II, durante la formación de fibrina en presencia de DS hay menor actividad de trombina que en el ensayo control, pudiéndose explicar por este mecanismo la generación de una red de fibrina más abierta.
Jones y Gabriel han estudiado el efecto del DS, como componente de la membrana basal subendotelial, sobre la estructura de la red de fibrina. Si bien las metodologías utilizadas fueron diferentes a las empleadas en nuestros trabajos, los resultados obtenidos fueron coincidentes. Informaron la formación de fibras más delgadas en presencia de DS, mediante la determinación por estudios turbidimétricos de la disminución de la relación masa/longitud (μ) en comparación con redes controles (121). Cabe señalar que, si bien estudiaron un rango amplio de concentraciones (100 a 6000 μg/mL) de DSA (20 kDa), éstas fueron siempre muy superiores a las utilizadas en nuestros estudios (4 μg/mL).
Entre sus conclusiones, los autores anteriormente citados plantean que la influencia de los componentes de la membrana basal sobre la estructura de la fibrina, se vincularía con la modificación de las propiedades mecánicas y la permeabilidad de los geles de fibrina obtenidos. Al respecto, nuestros resultados indican que la fibrina obtenida en presencia de DS resultaba más fácilmente compactable que la fibrina control, verificando la relación entre la estructura y las propiedades mecánicas de la red.
No se dispone de otros reportes vinculados con la influencia del DS sobre la estructura de la fibrina, aunque resultados semejantes se han reportado con otros GAGs. Se ha publicado que las redes obtenidas en presencia de Hep de bajo peso molecular evaluadas por microscopía confocal, resultaron más porosas y formadas por fibras más delgadas que las control (122). Resultados similares también fueron obtenidos con Hep no fraccionada, las redes fueron más porosas aunque formadas por fibras más gruesas (122)(123). Además, a partir de ensayos turbidimétricos, se ha reportado que en presencia de Hep de bajo peso molecular y HS (111) la fibrina formada fue más abierta, constituda por fibras más delgadas.

Efecto del DS sobre la lisabilidad de redes de fibrina formadas a partir de sangre

Es conocido que la velocidad de fibrinolisis está relacionada con el tamaño de las fibras y la arquitectura de la red de fibrina (124). Teniendo en cuenta que la plasmina corta transversalmente fibras individuales, dentro de un mismo gel, las fibras delgadas se lisan más rápidamente que las gruesas (125). Por otro lado, las redes de estructura abierta se lisan antes que las de estructura densa a causa de la reducida cantidad de fibras por unidad de volumen y la movilidad facilitada de los componentes fibrinolíticos (6). Por lo tanto, teniendo en cuenta las características observadas en las redes formadas en presencia de DS, podría plantearse que estas redes serían más susceptibles a la lisis.

Lisabilidad de redes de fibrina plasmática: Se estudió la lisabilidad, por agregado de un activador del plasminógeno, de redes de fibrina plasmática formadas en presencia de DSA. Teniendo en cuenta que la eficiencia de la fibrina como cofactor de la activación de plasminógeno también depende de la arquitectura de la red (8), se decidió utilizar u-PA como activador de plasminógeno debido a que no presenta afinidad por fibrina. Se observó que las redes plasmáticas formadas en presencia de DSA se lisaban más rápidamente que las redes control (109)(110).
Respecto de la relación estructura-lisabilidad de la fibrina, se ha informado que en presencia de decorín (proteoglicano de DS) se obtuvieron redes con fibras más delgadas, cuya lisis inducida por t-PA resultó acelerada (126). Por otro lado, coágulos formados en presencia de Hep de bajo peso molecular, resultaron menos ramificados y con poros más grandes que los controles (127). Los autores concluyen que el incremento observado en la velocidad de lisis de esas redes se debe a que la elevada porosidad de la red condujo a una mejor disponibilidad de t-PA dentro de la fibrina.

Lisabilidad de redes de fibrina formadas a partir de sangre entera diluida: El tiempo de lisis del coágulo formado a partir de sangre entera diluida depende principalmente de los niveles de fibrinógeno, factor XIII, plasminógeno y del equilibrio entre los activadores e inhibidores del sistema fibrinolítico (128). Por lo tanto, si los niveles de fibrinógeno, factor XIII y plasminógeno son normales y constantes, el tiempo de lisis depende fundamentalmente del equilibrio entre t-PA y PAI-1, ya que al diluir la sangre se minimiza el efecto del principal inhibidor de la plasmina (a₂-antiplasmina).
Se observó una disminución del tiempo de lisis del coágulo de sangre entera diluida en función del aumento de la concentración de DS y el efecto fue mayor en presencia de DSA que DSB para la misma concentración estudiada (110). Si bien los resultados obtenidos pueden deberse a un efecto neto sobre la activación del sistema fibrinolítico, no puede descartarse que el efecto observado sea una consecuencia del efecto anticoagulante del DS, ya que en esta prueba están presentes todos los componentes plasmáticos y en función de los resultados anteriormente presentados, la interacción DS-CH II puede modificar la actividad de la trombina agregada y la estructura final del coágulo.
Teniendo en cuenta que en estos ensayos se realizaron agregados ex vivo, utilizando concentraciones bajas de DS (entre 0,2 y 10 μg/mL) dentro del orden de los niveles plasmáticos obtenidos por tratamientos farmacológicos (77), se podría relacionar estos hallazgos con los resultados obtenidos en modelos animales de trombosis donde el DS además de inhibir la formación y el crecimiento del trombo, ha mostrado reducir el peso del trombo formado en función del tiempo y la dosis (71-73).

Resumiendo, se corroboró la hipótesis planteada debido a que se observó que la lisis de redes de fibrina (plasmática o formada a partir de sangre entera diluida) obtenidas en presencia de DS resultó más rápida que la lisis de redes control; indicando que el DS tiene un efecto pro-fibrinolítico asociado a su conocido efecto anticoagulante.

Efecto del DS sobre la lisabilidad de redes de fibrina formadas a partir de la fracción plasmática de euglobulinas

En la prueba de lisis de euglobulinas (129), la dilución y acidificación del plasma produce la precipitación de la fracción proteica de euglobulinas (que contiene principalmente fibrinógeno, plasminógeno y los activadores del plasminógeno) y mediante este procedimiento se eliminan los inhibidores del sistema fibrinolítico (PAI-1 y a₂-antiplasmina). Por lo tanto, se evalúa fundamentalmente la activación de la fibrinolisis por método coagulométrico.

Lisis de euglobulinas estándar: Se evaluó el efecto del DSA y DSB sobre la lisabilidad de un coágulo formado a partir de una solución pool de euglobulinas. Se observó una disminución del tiempo de lisis en función del aumento de la concentración de DS y el efecto fue mayor en presencia de DSA que DSB para la misma concentración estudiada (110).
Debido a que se realizó una adaptación de la técnica original para evaluar la etapa de fibrinoformación por espectrofotometría, en este ensayo pudo descartarse el efecto anticoagulante del DS. Por lo tanto, el efecto profibrinolítico observado podría deberse a un efecto neto sobre la activación del sistema fibrinolítico.

Lisis de euglobulinas precipitadas en presencia de DS: Se precipitó la fracción de euglobulinas en presencia de diferentes concentraciones de DS y se evaluó el tiempo de lisis por espectrofotometría.
Para evaluar la influencia del efecto anticoagulante del DS en este ensayo, se analizó la etapa de fibrinoformación por espectrofotometría. Se observó aumento de la fase de latencia, de la velocidad y el tiempo de fibrinoformación y de la densidad óptica máxima, características que coinciden sólo parcialmente con el efecto anticoagulante del DS determinado previamente en ensayos de fibrinoformación. Se confirmó la presencia de mayores niveles de fibrinógeno en las fracciones de euglobulinas precipitadas en presencia de DS, lo que explicaría la observación de un aumento de la velocidad de fibrinoformación y de la densidad óptica final, y no se detectaron niveles de AT y CH II en ninguna de las fracciones de euglobulinas analizadas. En particular, los resultados obtenidos indicarían que las redes formadas a partir de las fracciones de euglobulinas-DS serían más densas y cerradas que las redes formadas a partir de la fracción de euglobulinas-control.
Por otro lado, se observó una disminución significativa del tiempo de lisis, en paralelo con un aumento de los niveles de PDF y dímero D a tiempo final. Además, se observó que en presencia de DS se encontraba favorecida la precipitación de euglobulinas sin modificarse el patrón de proteínas precipitadas (SDS-PAGE), comprobándose mayores niveles de plasminógeno en las fracciones de euglobulinas-DS en concordancia con el aumento de niveles de fibrinógeno indicados previamente.
Todos los resultados descriptos fueron de mayor magnitud en presencia de DSA respecto de DSB para la misma concentración estudiada.

Resultados relacionados con el efecto del DS en el tiempo de lisis de euglobulinas fueron presentados por otros autores. Coincidiendo con estos resultados, Onaya et al. presentaron estudios in vitro, en los que el agregado de DS a una solución de euglobulinas preparada por método convencional, producía un acortamiento significativo del tiempo de lisis (130). Por otro lado, Colucci et al. (73) en un modelo experimental de trombosis venosa en conejos, detectaron que la actividad fibrinolítica de la fracción de euglobulinas plasmática aumentaba rápidamente luego de la administración endovenosa de DS. Sin embargo, debido a que no pudieron detectar variaciones en la actividad de t-PA o PAI-1 en esos plasmas, concluyeron que los efectos observados se debían a un "artefacto" relacionado con la técnica de precipitación. Los autores también realizaron ensayos controles agregando DS antes y después de la precipitación de la fracción de euglobulinas a partir de un pool de plasma de conejo y solamente recuperaron el efecto pro-fibrinolítico cuando el agregado fue realizado previamente a la precipitación. Es interesante destacar, que a pesar de no presentar los resultados en el trabajo, señalaron que las fracciones de euglobulinas obtenidas a partir de plasma normal o suplementado con DS, no mostraron diferencias en el patrón o intensidad de bandas de lisis por zimografía en placa de fibrina. Estos resultados coinciden con nuestra observación de que el patrón de proteínas precipitadas no se encuentra modificado.
Con respecto al efecto de otros GAGs en la precipitación de euglobulinas, Bertolesi et al. (94) reportaron que el agregado de Hep inmediatamente antes o después de obtener la fracción de euglobulinas no mostró cambios en el patrón y actividad de bandas por zimografía en placa de fibrina.
Resumiendo, se observó una disminución del tiempo de lisis de euglobulinas en presencia de DS. Debido a que se descartó el efecto anticoagulante y teniendo en cuenta que el principal activador de plasminógeno vascular es t-PA, se podría relacionar el efecto pro-fibrinolítico observado a un aumento de la activación de plasminógeno por t-PA. Estos resultados coincidirían con los resultados obtenidos por método amidolítico presentados previamente, indicando que el DS tiene un efecto pro-fibrinolítico independiente de su efecto anticoagulante.

EFECTO DEL DS SOBRE LA CÉLULA ENDOTELIAL

Se estudió el efecto del DSA sobre los niveles intracelulares o la liberación de t-PA y PAI-1 en cultivo de células endoteliales 1G11. Se utilizó la línea celular 1G11, proveniente de células endoteliales de la microvasculatura aisladas de pulmón de ratón BALB/C, las cuales presentan morfología tipo "cobblestone" y expresan constitutivamente CD₃₁, CD₃₄, VE-caderina, ICAM-1, VCAM-1 y P-selectina (131).
En las condiciones experimentales utilizadas (4 μg/mL) no se observaron variaciones significativas de la síntesis o expresión de t-PA y PAI-1. Por lo tanto, si bien nuestros resultados no apoyan directamente la hipótesis de que el DS tendría un efecto localizado sobre el sistema fibrinolítico endógeno, teniendo en cuenta que se utilizaron concentraciones bajas de DS, estos resultados no representarían información suficiente para descartar la hipótesis planteada.
Al respecto, Abbadini et al. (70) mostró que el DS indujo la liberación de t-PA de la célula endotelial in vivo en un modelo de perfusión en ratas, especialmente en los primeros 2 minutos de infusión. En particular, el efecto fue dosis dependiente entre 0,1 y 0,4 mg/mL de DS. Además, se ha reportado que el DS (20 μg/mL) en cultivo de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC), aumentó la actividad de t-PA y redujo la expresión de PAI-1 (132). Otros autores, si bien no observaron diferencias en los niveles de t-PA, detectaron una reducción significativamente de la expresión de PAI-1 (133). Respecto de otros GAGs, en el mismo sistema experimental se observó que la Hep (90 μg/mL) aumentó los niveles de t-PA y redujo los niveles intracelulares de PAI-1, mientras que HS y CS no mostraron efectos significativos (133).
Por otro lado, resultados obtenidos en un modelo animal de trombosis inducida por laser, mostraron que la administración de DS inducía la lisis espontánea del coágulo y que la inyección simultánea de DS y t-PA presentaba un efecto mayor que el obtenido utilizando unicamente t-PA, observando incluso un aumento en la lisis del coágulo a dosis que individualmente no habían tenido efecto significativo (134). Los autores han propuesto que el efecto observado podría deberse a que el DS estimula la liberación de t-PA de la célula endotelial favoreciendo la lisis del coágulo y representaría un efecto localizado del DS sobre la pared vascular. Este efecto podría ser considerado como una contribución adicional a la actividad antitrombótica del DS y apoyaría la hipótesis anteriormente planteada.

Reflexiones sobre el rol fisiológico del dermatán sulfato

Normalmente el DS no se encuentra en circulación, siendo casi nulos los niveles plasmáticos detectados en individuos sanos, sin embargo se han reportado niveles circulantes de DS en mujeres embarazadas a término y en pacientes en hemodiálisis crónica, pacientes quemados y pacientes sépticos, siendo los valores plasmáticos detectados entre 0,2 y 4 μg/mL (135).
Cabe recordar que el DS nativo es de alto peso molecular y es sintetizado principalmente por fibroblastos de la matriz subendotelial, donde cumple funciones relacionadas con la difusión de moléculas hidrosolubles, migración, proliferación y adhesión celular. El aumento de DS en circulación en pacientes en hemodiálisis crónica, pacientes quemados y pacientes sépticos, se debería al daño endotelial producido en las patologías mencionadas. Mientras que, el aumento de DS en las mujeres embarazadas se debería a la producción placentaria (136)(137).
Para reflexionar respecto del rol fisiológico del DS, debe focalizarse el análisis en los resultados obtenidos con DSA presentados previamente. Debe recordarse que en concentraciones similares a los niveles detectados en circulación, el DSA afectó la estructura de la fibrina, dando lugar a la formación de redes más abiertas constituidas por fibras más largas y delgadas, más frágiles y sensibles a la ruptura por fuerzas externas, redes que fueron lisadas más rápidamente. Además, en ese rango de concentración, no se observaron variaciones significativas de la síntesis o expresión de t-PA y PAI-1 en cultivos de célula endotelial estimulados con DSA.
Por otro lado, si bien las concentraciones de DSA utilizadas en los ensayos amidolíticos no serían comparables a las concentraciones circulantes y esos resultados fueron obtenidos en sistemas puros, el DSA produjo potenciación de la reacción de activación de plasminógeno por t-PA y u-PA y se observó que la combinación de DSA y fibrina no presentó efecto adicional sobre la reacción de activación de plasminógeno por t-PA.
Por lo tanto, en función de estos resultados, podría especularse que el DS en circulación tendría efecto antitrombótico y pro-fibrinolítico principalmente mediado por su acción anticoagulante y no debido a potenciación directa del sistema fibrinolítico, ya que no se observó estimulación de la célula endotelial y en presencia de fibrina, el DS no tendría efecto adicional sobre la conversión de plasminógeno a plasmina mediada por t-PA, que es el principal activador vascular.
Particularmente, centralizando el análisis en la función fisiológica del DS en mujeres embarazadas, cabe destacar que durante la gestación normal existe un aumento de la actividad procoagulante debido al aumento de los factores de coagulación VII, X, VIII, fibrinógeno, factor vW y factor tisular y debido a la disminución de los inhibidores de coagulación, principalmente proteína S, C y AT (138). Se han reportado niveles elevados de DS y de CH II (46)(135), proponiéndose que el rol fisiológico del sistema CH II incluiría, además de la inhibición de trombina extravascular, la regulación de trombina durante el embarazo (37). Además, se han reportado niveles disminuidos de CH II (aproximadamente 50% del valor normal en embarazo) (139) y alteración del patrón de glicosaminoglicanos (140) en mujeres con preeclampsia sugiriendo una relación entre la alteración del sistema CH II- DS y la disfunción placentaria.
Los resultados obtenidos contribuirían al esclarecimiento del rol fisiológico del CH II y particularmente del DS en la etapa de gestación. El DS no sólo actuaría como regulador de la actividad de trombina, sino además como modulador de la estructura de la fibrina y su lisabilidad formando parte del mecanismo de balance del estado protrombótico característico del embarazo.
Además, durante el embarazo el sistema fibrinolítico también se encuentra desbalanceado, especialmente debido al aumento de los niveles del inhibidor del activador de plasminógeno placentario o PAI-2 (de 0 a 260 ng/mL) (15), y además debido al aumento de los niveles de PAI-1 (x 3), u-PA (x 17) y t-PA (x 2) (141). Por otro lado, durante el embarazo se detectan niveles aumentados de dímero D (142), que no pueden ser explicados teniendo en cuenta los niveles circulantes de t-PA, u-PA, PAI-1 y PAI-2 que indicarían un arresto de la fibrinolisis sistémica.
Considerando estos resultados, una explicación de los aumentos progresivos de dímero D durante el embarazo, sería la activación del sistema plasminógeno-plasmina mediada por DS. El DS actuaría como modulador de la fibrinolisis durante el embarazo potenciando la activación de plasminógeno principalmente por u-PA.

CORRESPONDENCIA

DRA. MARÍA MERCEDES CASTAÑON
Laboratorio de Hemostasia y Trombosis. Departamento de Química Biológica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Int. Güiraldes 2160. Pabellón II. Piso 4. Ciudad Universitaria.
C1428EHA CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES, Argentina
Teléfono: 4576-3300 al 09 int 209
Fax: 4576-3342
E-mail: mamecas@qb.fcen.uba.ar

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