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Acta bioquímica clínica latinoamericana

Print version ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.42 no.4 La Plata Oct./Dec. 2008

 

INMUNOLOGÍA

Establecimiento de intervalos de referencia en subpoblaciones linfocitarias por citometría de flujo

Reference values in lymphocyte subpopulations using flow cytometry

Javier Roberto Jaldín-Fincati1*,***, César Collino2*,***, Silvia Peralta1**, Hugo Roland3**, Gustavo Chiabrando4***

1. Bioquímico
2. Bioquímico - Especialista en Hematología
3. Médico Infectólogo
4. Doctor en Química

* Centro de Química Aplicada (CEQUIMAP)
** Hospital Rawson de la Provincia de Córdoba
*** Departamento de Bioquímica Clínica-CIBICI (CONICET), Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba

Premio Congreso CUBRA IX (2007)

Resumen

La determinación de Subpoblaciones Linfocitarias Humanas (SLH) por Citometría de Flujo, Linfocitos CD3+ (LT), LTCD4+, LTCD8+ y la relación LTCD4+/LTCD8+, permiten monitorear pacientes infectados con virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), los cuales son comparados con Valores de Referencia (VR). A su vez los VR informados por la bibliografía son variables debido a la falta de validación analítica y partición estadística de los datos de VR, entre otros. En este trabajo, utilizando un ensayo validado (ISO15189), se establecieron VR para SLH con criterios estadísticos de partición en individuos con serología negativa para VIH (397 mujeres (F) y 279 varones (M), edad: 17-83 años). Las SLH fueron medidas en un Citómetro de Flujo (Coulter Epics XL-MCL). Los datos fueron procesados empleando como criterio estadístico de partición el algoritmo de Martin Gellerstedt (AMG). Del análisis estadístico y del AMG se determinó la partición de los datos en 6 subpoblaciones definidas por edad (intervalo de años) y género (F y M): grupos I y IV: 17-35 (F y M); grupos II y V: 36-50 (F y M); y grupos III y VI: >50 años (F y M). Para los 6 grupos se definieron VR de linfocitos totales, LT, LTCD4+, LTCD8+ y LTCD4+/LTCD8+. Para cada límite inferior y superior de VR se estableció el intervalo de confianza al 90%. En conclusión, este estudio permitió establecer VR para SLH en un ensayo validado empleando un criterio estadístico de partición, lo cual permitiría incrementar la confiabilidad de los resultados y uniformar a nivel internacional los VR en SLH en diferentes poblaciones.

Palabras clave: Valores de referencia; Partición estadística; Citometría de flujo; Subpoblaciones linfocitarias; Linfocitos CD4; Virus de la inmunodeficiencia humana

Summary

The determination of Human Lymphocyte Subpopulations (HLS) including Lymphocytes CD3+ (LT), LTCD4+, LTCD8+ and LTCD4+/LTCD8+ ratio by flow cytometry, makes it possible to monitor patients infected who HIV, which are compared against reference values (RV). However, RV reported by the international bibliography are variable due to the absence of two main factors: analytical validation procedures and partitioning statistical criteria. This study, using a validated method (ISO15189), RV were established for HLS in individuals with negative serology for HIV (397 females (F) and 279 males (M), age: 17-83 years) applying partitioning statistical criteria. The values of HLS were obtained by flow cytometry (Coulter Epics XL-MCL). The data were processed using partitioning statistical criteria based on Martin Gellerstedt's algorithm (MGA). From the statistical analysis and MGA the partition of the data was determined in 6 subpopulations defined by age (interval of years) and gender (F and M): groups I and IV: 17-35 (F and M); groups II and V: 36-50 (F and M); and groups III and VI: >50 years (F and M). Hence, RV of total lymphocytes, LT, LTCD4+, LTCD8+ and LTCD4+/LTCD8+ ratio were defined. For each limit (lower and upper) of reference values, the 90% confidence interval was determined. In conclusion, this study allowed establishing RV for HLS in a validated method using a partitioning statistical criterion, which would allow increasing the assurance results and establishing an international criterion for reference values in HLS in different populations.

Key words: Reference values; Partitioning statistical criteria; Flow cytometry; Lymphocyte subpopulations CD4; Lymphocytes; Human immunodeficiency virus

Introducción

La patogénesis del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) está vinculada, entre otras causas, a la disminución de los niveles sanguíneos de linfocitos CD3+CD4+ (LTCD4+) en personas infectadas con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) (1)(2). El CDC (Centers for Disease Control and Prevention, U.S.), clasifica a las personas infectadas con el VIH según dos criterios, uno clínico y otro basado en el recuento absoluto de LTCD4+. Según la clasificación del paciente, el sistema de monitoreo y la estrategia terapéutica sufrirán modificaciones (3).
Además del conteo de LTCD4+, en los últimos años se ha demostrado la importancia de cuantificar también células CD3+ (LT) totales y células CD3+CD8+ (LTCD8+), con el propósito de obtener un marco general del sistema inmune celular del paciente durante el seguimiento de la enfermedad (4). Para ello, la Citometría de Flujo (CF), al tratarse de una tecnología versátil y accesible, desempeña un papel preponderante en la medición de estas subpoblaciones linfocitarias. En este sentido, la medición de LT, LTCD4+ y LTCD8+ así como la relación LTCD4+/ LTCD8+ por CF sigue acaparando atención desde la óptica del laboratorio clínico debido a la necesidad de obtener resultados confiables, en términos de exactitud y precisión analítica, que permitan el adecuado monitoreo clínico y terapéutico de pacientes infectados con el VIH (1).
Las principales dificultades asociadas con la variabilidad de resultados en la medición de subpoblaciones linfocitarias por CF están ligadas con la ausencia de Materiales de Referencia Certificados (MRC) y a la carencia de criterios de validación analítica consensuados para esta tecnología. A su vez, el estado inmunológico celular de pacientes con serotipos positivos para el VIH es comparado con niveles clínicos obtenidos a través de Valores de Referencia (VR) (1). Por ello, el correcto establecimiento de los VR así como los Puntos de Decisión Médica (PDM), se transforma en una etapa indispensable para la emisión de resultados confiables.
En diferentes países se han realizado estudios con el propósito de establecer VR y PDM. Sin embargo, los intervalos de los VR muestran una significativa variación (5-12). Parte de la justificación para estas diferencias se encuadran dentro de los diferentes principios metodológicos de medición, pero fundamentalmente se deben a los distintos criterios de partición utilizados en la obtención de los VR, los cuales están basados principalmente en la edad, género, raza y hábitos de vida de los individuos. Esta marcada disparidad denota la necesidad para cada población de establecer sus VR definiendo sus propios criterios de partición, los cuales a su vez deben ser evaluados a partir de determinados criterios estadísticos previamente establecidos. Por ello, un paso crítico en el establecimiento de VR es definir si la partición de los datos está debidamente justificada.
La mayoría de los trabajos publicados, referidos al establecimiento de VR para subpoblaciones linfocitarias, están basados en el principio de partición propuesto por Harris y Boyd (13). Este principio define un criterio estadístico para evaluar si una población de VR debe particionarse con el propósito de obtener intervalos de referencia separados en dos subpoblaciones. De esta manera, la partición se justifica si la pro
porción de VR fuera de los Límites de Referencia Combinados (LRC) es menor al 1% o mayor al 4% en cualquiera de las dos subpoblaciones consideradas (13). Recientemente, Martin Gellerstedt ha publicado un algoritmo que al ser resuelto permite fácilmente identificar el Intervalo de Referencia Combinado (IRC) cuando se integran dos o más subpoblaciones. Usando este algoritmo es posible identificar si la proporción fuera de los LRC para cualquiera de las diferentes subpoblaciones se desvía del valor nominal de 0,025, a partir del cual la partición es recomendada. El aporte relevante de este trabajo radica en que se pueden evaluar dos o más subpoblaciones Gaussianas, teniendo en cuenta sus prevalencias, de manera de determinar si la partición es posible (14).
Por lo tanto, el principal objetivo de este trabajo fue establecer VR para subpoblaciones linfocitarias medidas por CF, utilizando criterios estadísticos de partición que tienen en cuenta la prevalencia de las diferentes subpoblaciones divididas por género y edad. De este modo, este trabajo constituye el primer estudio de establecimiento de VR en Argentina para LT, LTCD4+, LTCD8+ y la relación LTCD4+/LTCD8+ en población adulta mediante la aplicación de criterios estadísticos que evalúan simultáneamente dos o más subpoblaciones Gaussianas de datos.

Materiales y Métodos

La determinación absoluta y relativa de subpoblaciones linfocitarias: linfocitos TCD3+ (LT), LTCD4+, LTCD8+ y la relación LTCD4+/LTCD8+, así como el recuento linfocitario fueron llevados a cabo sobre 676 adultos clínicamente sanos (397 mujeres y 279 varones) con edades comprendidas entre 17 y 83 años (media=39,2 años y mediana=34 años), en el Hospital Rawson de la Provincia de Córdoba, Argentina. Los pacientes firmaron el consentimiento escrito de participación en el trabajo de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Ética de la Investigación en Salud (CIEIS Polo Hospitalario de la Provincia de Córdoba). Las determinaciones se realizaron mediante CF de doble plataforma a través de un Citómetro de Flujo Coulter Epics XL - MCL (Coulter Corporation, Miami, Florida 33196, EE.UU.) y un autoanalizador hematológico Cell Dyn 1400 (Abbott Park, IL 60064, EE.UU.).
La normalidad de los datos se evaluó a través del test estadístico de Kolmogorov Smirnov (KS). Para aplicar estadísticos paramétricos, todas las poblaciones de datos se transformaron a logarítmicas. Una vez transformadas, las poblaciones de datos se sometieron al algoritmo de Horn (15), para detectar valores anómalos, los que fueron removidos finalizado el análisis. Posteriormente, se evaluó el nivel de asociación lineal de los valores de los parámetros medidos en función de la edad empleando análisis de regresión lineal y coeficiente de correlación de Pearson. Las poblaciones de datos transformadas y sin valores anómalos fueron sometidas al algoritmo propuesto por Martin Gellerstedt (14). Como resultado del algoritmo, se obtuvieron las proporciones de VR de cada subgrupo que caían por fuera de los LRC.
Una vez definidos los subgrupos de VR, se procedió a realizar un análisis estadístico descriptivo, para obtener valores de media, mediana, intervalo de datos, los percentilos 2,5 y 97,5 de la distribución, y el intervalo de confianza del 90% para cada uno de estos percentilos. A los valores obtenidos de estos análisis estadísticos se les aplicó el antilogaritmo, para obtener datos en la escala original.
El programa de computación empleado para los cálculos de estadística descriptiva fue el MedCalc 9.1.0.1, y para el algoritmo de Martin Gellerstedt el Partitionizer 0.1.1.15. Los datos se colectaron en el programa Excel para Windows.

Resultados

Con el propósito de determinar el tipo de distribución de los distintos parámetros medidos inicialmente en 714 individuos, se aplicó el test KS el cual arrojó que la medición absoluta y relativa de LT, LTCD4+, LTCD8+ y la relación LTCD4+/LTCD8+, así como el recuento de linfocitos absoluto no poseían distribución normal. Por este motivo, se procedió a normalizar la distribución mediante la aplicación de la transformación logarítmica, la cual fue posteriormente corroborada por el estadístico KS. Con el propósito de descartar resultados anómalos (outliers) se aplicó el algoritmo de Horn (15), detectándose 38 valores anómalos los cuales fueron descartados de la muestra inicial, quedando un número final de 676 individuos.
Dado que ha sido previamente informado que los valores de subpoblaciones linfocitarias se modifican en función de la edad (5-12), se realizaron análisis de regresión lineal con el objeto de determinar el nivel de asociación lineal a través del coeficiente de correlación, r. La Figura 1 presenta dicho análisis observándose que todos los valores de subpoblaciones linfocitarias, a excepción de LT relativo (%CD3+), mostraron un valor de r significativo (p<0,05), siendo en algunos casos la asociación lineal positiva (LTCD4+ relativo y la relación LTCD4+/LTCD8+) y en otros casos negativas (el recuento linfocitario, LTCD4+ absoluto, LTCD8+ relativo y absoluto y la medición absoluta de LT). Por lo tanto, este nivel de asociación lineal de los valores absolutos y relativos de subpoblaciones linfocitarias en función de la edad justificaría a priori la necesidad de realizar análisis de partición.

Figura 1. Análisis de correlación lineal de los datos de subpoblaciones linfocitarias en función de la edad de individuos con serotipo negativo para VIH. En cada gráfico se indica la línea de regresión, el valor del coeficiente de correlación (r) y el nivel de significancia asociado (pvalor). A: Recuento absoluto de linfocitos. B: LTCD4+ relativo. C: LTCD4+ absoluto. D: LTCD8+ relativo. E: LTCD8+ absoluto. F: LT relativo. G: LT absoluto. H: Relación LTCD4+/LTCDCD8+. Todos los valores son informados en logaritmo decimal. Símbolos: (Δ) Mujeres; (•) Varones. Un p-valor <0,05 es considerado significativo.

Para ello se aplicó el estadístico propuesto por Martin Gellerstedt (14) a través del programa estadístico Partitionizer 0.1.1.15. En las Tablas I-a y I-b se muestran los resultados de este análisis, donde se definen las proporciones de VR fuera de los LRC para cada uno de los parámetros medidos. Para decidir la partición en subpoblaciones de VR, se estableció que la suma de las prevalencias debe ser igual o mayor a 1/6 (0,17) cuando una o más de las subpoblaciones contengan en sus respectivos límites, inferior o superior, valores que excedan los correspondientes LRC en una proporción <0,01 o >0,04. En todos los casos evaluados, el recuento absoluto de linfocitos, LT, LTCD4+, LTCD8+ y la relación LTCD4+/LTCD8+ (en valores relativos y absolutos), la suma de las prevalencias de las subpoblaciones con proporciones de VR fuera de los LRC fue ≥0,17. En base a estos resultados se decidió la partición de los VR por edad (en intervalos de años) y por género, masculino (M) y femenino (F), originando seis grupos de subpoblaciones diferentes, grupo I y IV: de 17 a 35 años (F y M); grupo II y V: de 36 a 50 años (F y M); y grupo III y VI: >50 años (F y M). En las Tablas II-a y II-b se presentan los valores de medias, medianas, intervalos de datos, límites inferiores y límites superiores, así como sus intervalos de confianza del 90%, para todas las variables en estudio, en cada uno de los 6 grupos de subpoblaciones de VR definidos de I a VI.

Tabla I a). Resultados de la aplicación del algoritmo propuesto por Martin Gellerstedt.
Proporciones de Valores de Referencia fuera de los LRC, en linfocitos totales absolutos (#) y linfocitos CD3+ (LT) relativos (%) y absolutos (#).

Tabla I b). Resultados de la aplicación del algoritmo propuesto por Martin Gellerstedt.
Proporciones de Valores de Referencia fuera de los LRC en LTCD4+, LTCD8+ (% y #), y en la relación LTCD4+/LTCD8+.

Tabla II a). Valores de Referencia para subpoblaciones de linfocitos en sangre periférica (LT, LTCD4+ y LTCD8+) en 397 mujeres adultas, determinados por análisis de Citometría de Flujo.

Tabla II b). Valores de Referencia para subpoblaciones de linfocitos en sangre periférica (LT, LTCD4+ y LTCD8+) en 279 varones adultos, determinados por análisis de citometría de flujo.

Discusión y Conclusiones

En este trabajo se presenta el establecimiento de VR en subpoblaciones linfocitarias para el monitoreo y seguimiento clínico de pacientes infectados con VIH donde se aplica por primera vez el criterio estadístico de partición que justifica la creación de más de dos subpoblaciones de VR contemplando el nivel de prevalencia. Este sistema de establecimiento de VR constituye una sustancial ventaja al principio de Harris y Boyd, dado que este último es diseñado para justificar la partición de dos subpoblaciones y no considera la prevalencia de las subpoblaciones en comparación (13).
Aunque recientemente se ha informado la necesidad de considerar la prevalencia en subpoblaciones de VR con distribución normal (14)(17), es a partir del algoritmo de Martin Gellerstedt que se introduce este concepto aplicado a más de dos subpoblaciones de datos (14). En este trabajo, este análisis estadístico permitió justificar la necesidad de particionar por género y edad en referencia a los valores de recuento absoluto de linfocitos, LT, LTCD4+, LTCD8+ y la relación LTCD4+/LTCD8+.
Previamente han sido publicados un importante número de trabajos, realizados en países con diferentes condiciones socioeconómicas y étnicas, los cuales demuestran una gran variabilidad de resultados en los VR establecidos (5-12). En general, de estos trabajos se desprende que los criterios de partición fueron
basados en el género y la edad, así como en ciertos hábitos culturales y alimentarios, pero en ningún caso se aplicaron análisis estadísticos que permitan justificar el hecho de la partición efectuada. Si bien puede ser considerado que el género y la edad son criterios excluyentes de partición, para el caso en particular de la CF otros aspectos deben ser considerados. En primer lugar, se debe tener en cuenta el aspecto analítico de la CF; a diferencia de otros ensayos, esta tecnología carece de materiales de referencia que permitan comparar la medición del analito de una muestra con un patrón o estándar definido. Esta situación hace que la validación analítica de la CF, en términos de precisión, linealidad y exactitud, cobre principal atención en los laboratorios clínicos donde aplican esta tecnología. Una vez validada la tecnología, el establecimiento de los valores de referencia de los analitos a medir pasa a constituir, además de lo clínico, un punto de comparación analítico, dado que el laboratorio puede utilizar muestras de individuos sanos, a modo de muestras controles, con el propósito de establecer la trazabilidad analítica respecto de los VR establecidos. En este laboratorio, a partir de un ensayo de CF validado para medir subpoblaciones linfocitarias, y a través del establecimiento de los VR estadísticamente validados por edad y género, se logró comparar la veracidad (trueness) de las mediciones en muestras normales, estableciendo la ocurrencia de posibles bias que alteren la confiabilidad de los resultados. Por último, se consideró que la gran dispersión de resultados de VR para subpoblaciones linfocitarias por citometría de flujo informados por la bibliografía obedeció, entre otras causas, a la falta de criterios bien definidos sobre validación analítica y establecimiento de valores de referencia.
Finalmente, se consideró que la inclusión de la prevalencia de cada subpoblación en el análisis estadístico de la partición es un factor clave para evitar obviar el efecto de la cantidad de datos desiguales que conforman cada subpoblación en relación a las distancias críticas utilizadas como criterio de partición (14). Si bien existen diversos criterios acerca de la partición de VR, el utilizado en este trabajo permite evaluar las diferencias que existen entre los límites de cada subpoblación con los respectivos LRC, contemplando, además, el efecto de las prevalencias (13)(14)(16)(17). Por otro lado, y a diferencia de los modelos anteriores que sólo permiten analizar dos subpoblaciones a la vez, este modelo habilita a evaluar más de dos subpoblaciones al mismo tiempo, y a su vez comparar cada una con la población combinada total. Por último, la existencia de un programa de computación que facilita los cálculos, convierte a este sistema en una herramienta óptima para la realización de estos estudios aplicados a otros campos de la química clínica.

AGRADECIMIENTOS

A la Confederación Unificada de Bioquímica de la República Argentina (CUBRA) por la distinción otorgada como Premio al Mejor Trabajo de Investigación Aplicada en el Congreso Nacional Bioquímico CUBRA IX (2007). Este trabajo fue realizado con fondos provenientes de los subsidios FONCyT (PICT N° 05-13945); CONICET (PIP 05-06 N° 54214); y SECyT-UNC (Res. 114/07).

CORRESPONDENCIA

J.R. JALDÍN-FINCATI Y G. CHIABRANDO
Haya de La Torre y Medina Allende,
Ciudad Universitaria, 5000 CÓRDOBA, Argentina
Tel.: 0351 4334164 (Int 103)
Fax: 0351 4333048
E-mail: jfincati@mail.fcq.unc.edu.ar y gustavo@fcq.unc.edu.ar

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