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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. v.42 n.4 La Plata oct./dic. 2008

 

MICOLOGÍA

Susceptibilidad de levaduras vaginales a los antifúngicos más utilizados en Maringá, Paraná, Brasil

Susceptibility to vaginal yeast in most used antifungal in Maringá, Paraná, Brazil

Kelen Fátima Dalben Dota1, Cristiane Suemi Shinobu2, Eliana Valéria Patussi3, Marcia Edilaine Lopes Consolaro4, Terezinha Inez Estivalet Svidzinski5

1. Especialista en Ciências da Saúde. Universidade Estadual de Maringá, Paraná, Brasil.
2. Farmacêutica-Bioquímica. Universidade Estadual de Maringá, Paraná, Brasil.
3. Dr. en Biología Celular. Pesquisidor de la Micologia Médica. Departamento de Análises Clínicas de la Universidade Estadual de Maringá, Paraná, Brasil.
4. Dr. en Biología Celular. Profesor de Citologia Clínica. Departamento de Análises Clínicas de la Universidade Estadual de Maringá, Paraná, Brasil.
5. Dr. en Micologia Médica. Profesor de Micologia Médica. Departamento de Análises Clínicas de la Universidade Estadual de Maringá, Paraná, Brasil.

Resumen

Se determinó la susceptibilidad antifúngica in vitro de 78 cepas de levaduras aisladas de mujeres de la ciudad de Maringá/Paraná, Brasil, con candidiasis vulvovaginal (CVV), atendidas en el Laboratorio de Enseñanza e Investigación en Análisis Clínicos (LEPAC) de la Universidad Estatal de Maringá, desde el 1 de enero 2005 al 31 de diciembre 2006. Su sensibilidad in vitro fue investigada por el método de microdilución frente a ketoconazol (KETO), fluconazol (FLU), itraconazol (ITRA), nistatina (NIS) y anfotericina B (AMB). Para KETO, 41,5% de las cepas de C. albicans y 96% de Candida no-albicans presentaron resistencia (100% de C. glabrata) y para FLU solamente el 3,8% de los aislamientos de C. albicans y el 8,0% de C. glabrata fueron resistentes. Sólo 1,9% de las cepas de C. albicans y 20% de las de C. no-albicans fueron resistentes a ITRA y el 5,7% de las C. albicans y el 8% de las C. no-albicans (sólo C. glabrata) fueron resistentes a AMB. No hubo aislamientos resistentes a NIST, pero sí una elevada frecuencia de sensibilidad dosis dependiente "in vitro". Estos datos avalan la creciente necesidad de la realización de pruebas de identificación y susceptibilidad in vitro a los antifúngicos para establecer el correcto tratamiento de la CVV.

Palabras clave: Candidiasis vulvovaginal; Tratamiento; Antifúngicos; Resistencia in vitro

Summary

In vitro antifungal susceptibility was determined in the 78 yeasts isolated from patients with vulvovaginal candidiasis (VVC) from the city of Maringá/Parana/Brazil, assisted in the Laboratory of Teaching and Research in Clinical Analysis of the State University of Maringá, from 01 January 2005 to December 31, 2006. Its sensibility in vitro was tested according to microdilution method in front of ketoconazol (KETO), fluconazole (FLU), itraconazole (ITRA), nistatin (NIS) and amphotericin B (AMB). For KET, 41.5% of the C. albicans and 96.0% of the C. non-albicans showed resistance (100.0% of C. glabrata) and for FLU, only 3.8% of the isolates of C. albicans and 8.0% of C. glabrata showed resistance. Only 1.9% of the C. albicans and 20% of the C. no-albicans were resistant. For AMB, 5.7% of the C. albicans and 8% of the C. no-albicans (only C. glabrata), were resistant. There were no isolations resistant from NIST, however, there was a high frequency of dose-dependent sensibility (SDD) in vitro. These data makes it possible to confirm the growing necessity of the performance of identification tests and in vitro antifungal susceptibility to antifungals to establish the correct treatment of CVV.

Key words: Vulvovaginal candidiasis; Treatment; Antifungal; In vitro resistance

Introducción

El arsenal terapéutico disponible para el tratamiento de las infecciones fúngicas es restringido. La anfotericina B (AMB) es un excelente recurso terapéutico, con elevada eficacia contra levaduras y hongos filamentosos, pero su empleo se limita a cuadros graves, debido a su elevada toxicidad.
El fluconazol (FLU), entre los azoles, es el más usado en casos de candidiasis, no obstante, el desarrollo de resistencia por cepas de C. albicans y no-albicans, debido a la selección ocurrida cuando las especies resistentes al antifúngico administrado se sobreponen a las demás, al no ser afectadas (1).
Por ello, queda claro el interés en la identificación certera de cada levadura aislada, en vista de los diferentes patrones de susceptibilidad de las especies en relación con los antifúngicos.
Los clínicos requieren la identificación certera de las especies causantes de candidiasis vulvovaginal (CVV), para definir la terapéutica a emplear (2), debido a que su frecuencia ha aumentado en los últimos años, tornando este diagnóstico cada vez más común en ginecología (3) (4).
Sin embargo, entre 5-25% de las pacientes presentan recurrencias (CVVR), definidas como la presencia de cuatro o más episodios sintomáticos en un año (4) (5).
La CVV es causada por levaduras que habitan normalmente las mucosas y afecta a millones de mujeres cada año, comprometiendo principalmente vulva y vagina. Actualmente, es la vaginitis más frecuente en Estados Unidos y Brasil (3) después de la vaginosis bacteriana, representando 20-25% de las secreciones vaginales infecciosas, mientras que en Europa es la primera causa de vulvovaginitis (4) (6).
Se estima que cerca de 75% de las mujeres adultas presentan por lo menos un episodio de CVV en su vida; de ellas, 40-50% manifestarán nuevas irrupciones, y en 5% se desarrollarán CVVR (1).
Para Sobel (1), la CVV es causada predominantemente por levaduras del género Candida (4); 80-90% por C. albicans y 10-20% por otras especies (C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. pseudotropicalis, C. lusitaniae). Otros géneros involucrados son Saccaharomyces, Rhodutorula y Trichosporon (7-9).
Estudios recientes demostraron en algunas poblaciones el aumento de la frecuencia del aislamiento de C. no-albicans (9) (10), siendo C. glabrata la segunda especie en frecuencia en las CVV (3) (11-13). La causa de este incremento no ha sido bien definida, aunque algunos autores lo atribuyen al aumento del uso de antifúngicos en dosis inadecuadas o en forma incompleta (1) (14) (15). Esto ocasionaría la eliminación de las cepas de C. albicans más sensibles, seleccionando las de C. no-albicans más resistentes (9) (10). Además, estas últimas parecen ser intrínsecamente menos sensibles a los azólicos, antifúngicos de elección para el tratamiento de esta patología (16).
Las hipótesis mencionadas podrán ser comprobadas o no, estableciendo el perfil de susceptibilidad de las levaduras del género Candida en diferentes poblaciones de pacientes con CVV, en vista de que existen características regionales en relación con el tratamiento.
La propuesta de este trabajo fue determinar la susceptibilidad in vitro de diferentes levaduras aisladas de pacientes con CVV de Maringá/Paraná, Brasil frente a los antifúngicos más empleados en la práctica clínica.

Materiales y Métodos

LEVADURAS

Fueron incluidas en el estudio las levaduras aisladas por cultivo del flujo vaginal de mujeres portadoras de CVV, según criterios definidos por Consolaro et al. (10). Las mismas fueron atendidas en el Laboratorio de Enseñanza e Investigación en Análisis Clínicos (LEPAC) de la Universidad Estatal de Maringá-Paraná, Brasil, desde el 1 de enero de 2005 al 31 de diciembre de 2006.

OBTENCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS

Las muestras, obtenidas del fondo de saco vaginal con hisopo estéril, previa colocación de espéculo vaginal descartable (Vagispec), fueron inmediatamente sembradas en placas con agar glucosado de Sabouraud (SDA) (Difco, Detroit, EE.UU.) adicionado de 100 mg/mL de cloranfenicol, e incubadas a 25 °C hasta cinco días (10).
Un conjunto de las colonias crecidas en cada placa fue subcultivado en CHROMagar Candida® (Probac, França) y a partir del cultivo puro, las levaduras fueron identificadas fenotípicamente por la metodología clásica (10) y fueron confirmadas genotípicamente por la amplificación de secuencias especie-específicas del ADN ribosómico según Sugita et al. (17).

PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIFÚNGICOS

Las levaduras fueron probadas con el método de microdilución en caldo, según fue descrito por el Clinical and Laboratory Estándar Institute (CLSI, ex NCCLS) (18), y todo el ensayo siguió las orientaciones de este documento.

ANTIFÚNGICOS PROBADOS

Los antifúngicos evaluados fueron FLU (Pfizer Inc, New York, NY, USA), ITRA, KETO (Janssen Pharmaceutical, Titusville, NJ, USA), AMB (Squibb Pharmaceutical, Princeton, NJ, USA) y NIS (Sigma Pharma-St Louis, MO, USA).

CRITERIOS DE LECTURA PARA LA CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA (CIM)

Según preconiza el CLSI (18), la CIM para los azólicos se define como el primer pocillo que presenta una reducción o una inhibición de 50% en el crecimiento fúngico, cuando se la compara con el desarrollo del control positivo, sin la presencia de ningún tipo de droga.
La AMB y la NIS se definieron como la menor concentración capaz de inhibir algún crecimiento visual, mientras que la CIM50 y CIM90 fueron definidas como la CIM de 50% y 90% de los aislamientos, respectivamente.

CRITERIOS DE LECTURA PARA LA CIM

Fueron considerados sensibles los aislamientos con valores de CIM de ≤8 μg/mL para FLU, ≤4 μg/mL para NIS, ≤0,125 μg/mL para ITRA y KETO, y ≤1 μg/mL para AMB. Los aislamientos con CIM entre 16 y 32 μg/mL para FLU, 8 a 32 μg/mL para nistatina NIS y 0,25 a 0,5 μg/mL para itraconazol ITRA y ketoconazol KETO fueron considerados sensibles dosis-dependientes (SDD). Valores de CIM de ≥64 μg/mL para FLU y NIS, ≥1 μg/mL para ITRA y KETO, y ≥2 μg/mL para AMB, fueron considerados resistentes a los agentes antifúngicos.

Resultados

De los 78 aislamientos obtenidos, 53 pertenecían a C. albicans, 11 a C. glabrata, 6 a C. guillermondii, 3 a C. parapsilosis, 1 a C. lusitaniae, 2 a Saccharomyces cerevisiae, 1 a Trichosporon asahii y 1 a Rhodotorula sp.
Como se observa en la Tabla I, las cepas de C. albicans mostraron gran variación de la CIM para KETO, FLU, ITRA y AMB, mientras que en las de C. no-albicans la variación no fue tan grande, con excepción de C. glabrata, para FLU y AMB.

Tabla I. Variación de las CIMs de 78 levaduras aisladas de pacientes con candidiasis vulvovaginal frente a cinco drogas antifúngicas, según método de microdilución en caldo (CLSI).

En cuanto a los valores de CIM50 y CIM90 (Tabla II) para las cepas de C. albicans, la mayor variación ocurrió para FLU, y luego para KET, AMB e ITRA. Entre las cepas de C. no-albicans, sólo C. glabrata presentó gran variación para FLU, ITRA y AMB. Para todos los demás aislamientos, la variación entre CIM50 y CIM90 fue pequeña.

Tabla II. CIM50 y CIM90 de 78 levaduras aisladas de pacientes con candidiasis vulvovaginal frente a cinco drogas antifúngicas, según método de microdilución en caldo (CLSI).

De las 53 cepas de C. albicans estudiadas, no hubo aislamientos SDD para FLU y AMB, que sí fueron observados para KETO, ITRA y NIS en 19 (35,8%), 4 (7,5%) y 42 (79,3%) aislamientos, respectivamente. Veintidós cepas (41,5%) fueron resistentes a KETO, 2 (3,8%) a FLU, 1 (1,9%) a ITRA, 3 (5,7%) a AMB, y no hubo cepas resistentes a NIS (Fig. 1).


Figura 1. Número de aislamientos de C. albicans considerados sensibles (S), intermediarios (SDD*) y resistentes (R) frente a los cinco antifúngicos evaluados in vitro, según CLSI** (2002).
Referencias: *Sensible dosis-dependiente; ** Clinical Laboratory Standards Institute (ex-NCCLS).

No hubo aislamientos de C. no-albicans sensibles al KETO. Una cepa (4,0%) fue SDD para KETO, 3 (12,0%) para FLU, 9 (36,0%) para ITRA y 14 (56,0%) para NIS. Veinticuatro aislamientos (96,0%) fueron resistentes al KETO, 2 (8,0%) al FLU, 5 (20,0%) al ITRA, 3 (5,7%) a la AMB y no hubo resistencia a la NIS (Fig. 2).


Figura 2. Número de aislamientos de C. no-albicans considerados sensibles (S), intermediarios (SDD*) y resistentes (R) frente a los cinco antifúngicos testados in vitro, según CLSI** (2002).
Referencias: *Sensible dosis-dependiente; ** Clinical Laboratory Standards Institute (ex-NCCLS).

C. glabrata fue la segunda levadura en frecuencia y la C. no-albicans que presentó mayor resistencia in vitro a los antifúngicos probados. Todas las capas de C. glabrata fueron resistentes a KETO, 2 (18,1%) a FLU, 5 (45,5%) a ITRA, 2 (18,1%) a AMB y ninguna a la NIS. Dos cepas (18,1%) fueron SDD a FLU, 4 (36,4%) a ITRA, ninguno a AMB y 3 a NIS (27,3%) (Fig. 3).


Figura 3. Número de aislamientos de C. glabrata considerados sensibles (S), intermediarios (SDD*) y resistentes (R) frente a los cinco antifúngicos testados in vitro, según CLSI** (2002).
Referencias: *Sensible dosis-dependiente; ** Clinical Laboratory Standards Institute (ex-NCCLS).

Discusión y Conclusiones

C. albicans (68%) fue la especie predominante entre las 78 cepas estudiadas, aunque el aislamiento de especies de C. no-albicans e inclusive de otros géneros, no fue despreciable, ratificando la importancia de la correcta identificación de las levaduras en esta patología.
Como se observa en las Figuras 1, 2 y 3, KETO podrá ser ineficiente para el tratamiento de la CVV, principalmente aquellas causadas por especies de C. no-albicans, que en la población estudiada mostraron elevada frecuencia de resistencia in vitro para este antifúngico.

Richter et al. (19) obtuvieron resultados muy diferentes a los aquí descritos, en los cuales el 98,5% de los aislamientos de C. albicans y C. no-albicans fueron sensibles al KETO. Consolaro et al. (7) observaron SDD en el 40% de las cepas de C. albicans, pero no resistencia, lo que puede indicar que el uso indiscriminado de este antifúngico pueda estar seleccionando poblaciones de levaduras y cambiando su perfil de susceptibilidad.
Sólo el 3,8% de los aislamientos de C. albicans y el 8% de los de C. glabrata fueron resistentes a FLU, siendo estas últimas las que mostraron mayor variación de la CIM y gran diferencia entre CIM50 y CIM90 (Tablas I, II, Fig. 3). Así, este antifúngico mostró un buen perfil de sensibilidad in vitro para la CVV, principalmente cuando es causada por C. albicans.
En los casos de falla terapéutica, debe realizarse la prueba de susceptibilidad in vitro para determinar si el aislamiento puede ser SDD o resistente.
Los resultados observados en la literatura también demostraron perfiles de susceptibilidad in vitro a FLU semejantes a los aquí expresados, siendo para Galle et al. (20), el 11,7% de las cepas de C. albicans resistentes, para Consolaro et al. (7) C. albicans fue siempre sensible, para Ozcan et al. (21) sólo una cepa de C. albicans y otra de C. glabrata fueron resistentes y para Richter et al. (19), el 3,7% tuvieron resistencia entre C. albicans y C. no-albicans.
No obstante, Ventolini et al. (22) obtuvieron evidencias clínicas de que alrededor de 50% de las CVV causadas por C. no-albicans retornaron después del tratamiento con FLU, dato este que debe ser considerado al adoptarlo para la terapia para este grupo de levaduras.
ITRA se demostró un antifúngico más apropiado para el tratamiento de CVV causada por C. albicans, ya que 90,6% de las mismas se presentaron sensibles in vitro y sólo 1,9% resistentes (Fig. 1). Sin embargo, entre las C. no-albicans, sólo 44% fueron sensibles y 20% resistentes, todas ellas cepas de C. glabrata (Fig. 3), las que presentaron gran variación de CIM (Tabla I). Así, este antifúngico presentó un buen perfil de sensibilidad in vitro para las cepas de C. albicans aisladas de CVV. De manera semejante a estos resultados, Galle et al. (20) demostraron un 2% de resistencia de C. albicans y 23,5% de C. no- albicans, mientras que Ozcan et al. (21) no observaron levaduras resistentes a este antifúngico, al igual que en los estudios de Consolaro et al. (7) en relación a C. albicans. Sin embargo, Richter et al. (19) también observaron elevada resistencia entre las cepas de C. no-albicans, que se observó en el 74,1% de las cepas de C. glabrata.
Para AMB, 5,7% de las cepas de C. albicans y 8% de C. no-albicans (sólo C. glabrata), se presentaron resistentes (Figs. 1, 2 y 3), con gran variación en los valores de CIM y también entre CIM50 y CIM90 (Tablas I y II).
A pesar del buen perfil de sensibilidad, estos casos de resistencia in vitro son muy preocupantes, ya que AMB ha sido considerada como uno de los principales recursos terapéuticos en las infecciones fúngicas graves de otros sitios anatómicos. Galle et al. (20) observaron que todas las C. albicans fueron sensibles a AMB y un aislamiento de C. glabrata resistente, muy próximo a estos resultados. De la misma forma que para ITRA, Ozcan et al. (21) y Consolaro et al. (7) no observaron cepas resistentes a este antifúngico.
No hubo aislamientos resistentes a NIS, sin embargo se observó una elevada frecuencia de SDD in vitro (79,3% de las C. albicans y 56% de las C. no- albicans) (Figs. 1, 2 y 3). Por ello, el tratamiento de la CVV con este antifúngico preocupa, una vez que la dosis preconizada puede ser insuficiente, ocasionando el fracaso terapéutico. Ferrazza et al. (9) obtuvieron resultados muy semejantes a los aquí detallados en cuanto a la sensibilidad, resistencia y principalmente a la SDD a la NIS, tanto para C. albicans como para C. no-albicans. Consolaro et al. (7) observaron 45% de SDD en las C. albicans reforzando así esta tendencia ya descrita en la literatura para este antifúngico.
Sobel (1) enseñó que la mayoría de los casos de CVV (90-95%) fueron causados por cepas sensibles de C. albicans, indicando que el perfil de susceptibilidad in vitro a esta levadura parecer estar cambiando, al menos en algunas poblaciones, según evidencian los resultados aquí expuestos.
Así, algunos aislamientos de C. albicans presentaron resistencia in vitro, principalmente a KETO y entre las
especies de C. no-albicans, C. glabrata tuvo un perfil de alta resistencia, mientras que las demás fueron resistentes solamente a KETO. Estos datos ratifican la creciente necesidad de la realización de las pruebas de laboratorio para la identificación y determinar la susceptibilidad in vitro a los antifúngicos para orientar el tratamiento de la CVV.
En cuanto al probable incremento del aislamiento de especies de C. no-albicans en CVV como consecuencia de la eliminación de cepas de C. albicans más sensibles, no parece ser compatible con la realidad de las levaduras aisladas durante el período que duró este estudio.

Este trabajo fue aprobado por el COPEP- Comité de Ética e Investigación Involucrando Seres Humanos/UEM (Registro n° 007/2002, aceptado N° 013/2002, CI N° 032/02).

CORRESPONDENCIA

DRA. MÁRCIA EDILAINE LOPES CONSOLARO
Departamento de Análises Clínicas
Universidade Estadual de Maringá - UEM
Av. Colombo, 5790 - Campus Universitário
CEP: 87020-900 - MARINGÁ-PR-BRASIL
Tel.: (44) 3261-4795
Fax: (44) 3261-4860
E-mail: melconsolaro@uem.br; melconsolaro@yahoo.com.br

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Aceptado para su publicación el 26 de agosto de 2008