SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.42 número4Control analítico-clínico de la hemodiálisisBiomedical Applications of Proteomics índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Articulo

Indicadores

  • No hay articulos citadosCitado por SciELO

Links relacionados

  • En proceso de indezaciónCitado por Google
  • No hay articulos similaresSimilares en SciELO
  • En proceso de indezaciónSimilares en Google

Bookmark


Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. v.42 n.4 La Plata oct./dic. 2008

 

FEDERACIÓN INTERNACIONAL DE QUÍMICA CLÍNICA Y CIENCIA DE LABORATORIO CLÍNICO

Evaluación externa de la calidad de mediciones de hemoglobina A2: datos de un estudio piloto italiano con muestras de sangre fresca y sistemas comerciales de HPLC

Renata Paleari1, Antonino Giambona2, Monica Cannata2, Filippo Leto2, Aurelio Maggio2 y Andrea Mosca1,*, para el Grupo de Trabajo de la IFCC "Estandarización de la HbA2"

1. Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche, Università degli Studi, Milán, Italia
2. Unità Operativa Ematología II conTalassemia, Azienda Ospedaliera "V Cervello", Palermo, Italia.

Esta traducción fue autorizada por la IFCC. Sin embargo, la IFCC no acepta ninguna responsabilidad por la exactitud de la misma. El documento definitivo continúa siendo el original en inglés.

Resumen

Antecedentes: Se organizó un estudio piloto de evaluación externa de la calidad entre 48 laboratorios de Italia que de rutina miden HbA2, con el objetivo de evaluar el alcance de la variación interlaboratorio y la precisión de los ensayos de hemoglobina A2 (HbA2). Como parte del estudio, también se realizó una encuesta mediante un cuestionario referido a algunos aspectos analíticos importantes relacionados con la determinación de HbA2.
Métodos: Los especímenes de la prueba consistieron en tres muestras de sangre (A, B y C) con contenido de HbA2 normal, patológico y en el límite, respectivamente. Todos los laboratorios utilizaron analizadores de HPLC del mismo fabricante (Bio-Rad Laboratories).
Resultados: Todos los laboratorios diferenciaron claramente las muestras normales de las patológicas, mientras que los datos de la muestra con valor en el límite, se superpusieron parcialmente con aquellos de otras muestras. El coeficiente de variación interlaboratorio general fue de 8,0%, 6,0% y 7,9% para las muestras con niveles de HbA2 bajos, altos e intermedios, respectivamente. Para asignar a las muestras los valores target de HbA2 se usó la media del grupo de laboratorios. La precisión de los resultados de HbA2 se evaluó sobre la base del error total permitido. La proporción de laboratorios que informó resultados inaceptables fue del 31,9% (15 de 47) para la muestra A, de 17,0% (8 de 47) para la muestra B y de 31,9% (15 de 47) para la muestra C. Ninguno de los laboratorios registró anomalías en el patrón de separación cromatográfica.
Conclusiones: Se concluye que se debería mejorar la calidad en la medición de HbA2.

Palabras clave: Programa Externo de Evaluación de la Calidad (PEEC); Hemoglobina A2; Cromatografía líquida de alta resolución; Control de calidad; Talasemia

Introducción

Los síndromes de Talasemia se encuentran entre las alteraciones genéticas más comunes en todo el mundo, con un 1,7% de la población mundial que posee genes talasémicos (1). La talasemia prevalece en algunas partes del mundo -en las regiones del Mediterráneo, hasta un 8%; en los países del Medio Oriente, hasta un 10%; en India, entre 3% y 15%; en el Sudeste Asiático, hasta un 9%- en las que constituye un importante problema para la Salud Pública. Sin embargo, los países no-endémicos como los de Europa del Norte y América del Norte también se encuentran comprometidos en cuestiones relacionadas con la talasemia como resultado de los cambios demográficos que origina la migración de grupos étnicos minoritarios con una alta frecuencia de mutaciones talasémicas (2). Los datos que surgen de encuestas epidemiológicas recientes indican que en Europa hay aproximadamente 15.000 sujetos con talasemia mayor dependiente de transfusión, 6.000 de los cuales se encuentran sólo en Italia (3) (4). Es esencial llevar a cabo programas de prevención con el fin de detectar parejas portadoras para así poder controlar las talasemias severas al reducir la prevalencia de los individuos afectados al nacer.
Sobre este aspecto, la determinación de la hemoglobina A2 (HbA2) juega un papel fundamental en los programas de screening para b-talasemia, debido a que un aumento en esta fracción de hemoglobina constituye uno de los marcadores más típicos que permiten que sean reconocidos los heterocigotos de b-talasemia. No obstante, pueden surgir algunas dificultades diagnósticas en la identificación de portadores de b-talasemia atípicos que tengan valores de HbA2 levemente elevados. El hallazgo de esos sujetos dudosos con valores en el límite no es poco común debido a la gran heterogeneidad de los genotipos de b-talasemia o a la probable co-existencia de otras afecciones adquiridas o genéticas (por ejemplo, deficiencia de hierro, δ-talasemia) que pueden enmascarar el diagnóstico de b-talasemina heterocigota (5) (6). Por lo tanto, en función de la estrecha separación entre los valores normales de HbA2 y los patológicos, es esencial llevar a cabo mediciones de HbA2 con estricta calidad analítica para poder realizar un diagnóstico preciso, particularmente al brindar orientación genética cuando se tienen que identificar las parejas en riesgo. A pesar del valor clínico de la prueba de HbA2 y de las serias consecuencias de un diagnóstico incorrecto, falta información sobre las prácticas de laboratorio actuales en las mediciones de HbA2. Los únicos datos disponibles están relacionados con los esquemas de evaluación externa de la calidad (PEEC) realizados hace más de 15 años (7-10).
El objetivo de este estudio fue recabar información actualizada relacionada con la variación interlaboratorio y la precisión de las pruebas de HbA2. Para lograr este objetivo, fue organizado, en colaboración con la So.S.T.E. (Sociedad para el Estudio de Talasemia y Hemoglobinopatías, Italia), un estudio piloto de PEEC entre centros italianos que miden HbA2 de rutina. Como parte del estudio, también se realizó una encuesta cognitiva en la que se envió un cuestionario sobre algunos aspectos analíticos importantes relacionados con la determinación de HbA2 (como por ejemplo, el número de determinaciones por semana, el método utilizado, los límites de referencia, la interpretación de los valores en el límite).

Materiales y Métodos

El estudio interlaboratorio involucró 48 laboratorios, 18 de los cuales están asociados con la So.S.T.E. El estudio se basó en el uso de muestras de sangre en tres concentraciones de HbA2 diferentes: normal (muestra A), patológica (muestra B) y con valores en el límite (muestra C). Las muestras A y B se obtuvieron de un donante de sangre y de uno de los progenitores de un paciente con talasemia mayor, respectivamente, luego de obtener el consentimiento informado por escrito. La muestra C se preparó mezclando diferentes volúmenes de especímenes de sangre A y B para obtener un nivel de HbA2 intermedio. Las muestras de sangre se recogieron con EDTA en bolsas estándares para transfusión y posteriormente se las separó en alícuotas de 2,0 mL dentro de viales sellados. Las muestras se distribuyeron a los centros a 4 °C a través de un portador. A los participantes se los instruyó para que las analizaran dentro de los 5 días de recibidas, realizando un solo ensayo por medio del procedimiento analítico en uso y en condiciones de rutina. Con respecto a la estabilidad de la muestra, se controló que éstas fueran entregadas a los laboratorios dentro de los 3 días. También se fijó la fecha límite para el ensayo sobre la base de la bibliografía, que informa que existe estabilidad para la determinación de HbA2, de 3 semanas a 4 °C para las muestras de sangre recogidas en EDTA (11). Todos los laboratorios usaron un analizador HPLC de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Segrate, Italia), que incluía los siguientes sistemas: D10 (n=4), Variant (n=24), Variant II beta-thal (n=8) y Variant II dual-kit (n=12). Los resultados de los laboratorios se analizaron separadamente para cada nivel de HbA2 y para cada sistema analítico usado. Para la evaluación de la información, se derivaron los valores target de las muestras a partir de la media del grupo de laboratorios, ante la falta de un método de referencia que estableciera con precisión el contenido de HbA2 de las muestras. Se excluyó del cálculo un resultado para cada muestra debido a que estaba más allá de 3 DE de la media de consenso de los laboratorios.
Con respecto a la encuesta cognitiva, el cuestionario distribuido a los laboratorios se presenta en la Tabla I.

Tabla I: Cuestionario distribuido en la encuesta

Resultados

La Tabla II informa acerca de los resultados que devolvieron los participantes. No se notaron diferencias sustanciales en los resultados con relación al instrumento de HPLC utilizado. La variación interlaboratorio general fue levemente superior en concentraciones bajas de HbA2.

Tabla II. Resultados de HbA2 informados en el estudio y agrupados por método.

La Figura 1 ilustra la distribución de los resultados de HbA2. Se puede observar que se diferenciaron claramente las muestras normales y las patológicas, mientras que los valores obtenidos para la muestra "en el límite" se superpusieron parcialmente tanto con el límite superior de la muestra normal como con el límite inferior de la muestra patológica.


Figura 1. Distribuciones de frecuencia. Las muestras con un nivel de HbA590 bajo (A), alto (B) e intermedio (C), tal como las informaron los laboratorios.

Con respecto a la precisión, se evaluó el desempeño de cada laboratorio con referencia a las metas analíticas para HbA2. Las especificaciones de calidad para este analito se han definido recientemente sobre la base de la variación biológica, y se ha propuesto un error total deseado de 7,8% (12). Utilizando esta meta, los valores medidos de HbA2 tienen que ser incluidos en los rangos 2,4%, - 2,8%, 4,7% - 5,3% y 3,6% - 4,0% para las muestras A, B y C, respectivamente. De acuerdo con este enfoque, la proporción de los laboratorios que informaron resultados imprecisos fue de 31,9% (15 de 47) para la muestra A, 17,0% (8 de 47) para B, y 31,9% (15 de 47) para la muestra C (Figura 2). No resulta apropiado relacionar la proporción de resultados tan inaceptables con el rendimiento respectivo de los distintos instrumentos de HPLC, debido al número limitado de datos disponibles. Sin embargo, se han analizado los datos agrupando el porcentaje de resultados imprecisos que dio cada método. El porcentaje de resultados inaceptables (calculado como la media de las tres muestras A, B y C) fue de 16,7% para D10, 24,3% para Variant, 20,8% para Variant II beta-thal, y 40,0% para el Variant II dual kit. A partir de estos resultados preliminares se puede concluir que el método de Variant II dual kit parece mostrar un rendimiento levemente más pobre que los otros métodos en términos de precisión.


Figura 2. Valores de HbA2 medidos por los laboratorios para las muestras A, B y C (contenido bajo, alto e intermedio, respectivamente). Los resultados están ordenados por HbA2 creciente. Las líneas punteadas marcan el rango de precisión dentro del cual se incluyeron los resultados de HbA2 aceptables. Este rango se calculó sobre la base de un error total permitido de 7,8%.

Diecinueve laboratorios enviaron las respuestas a los cuestionarios, la mayoría de los cuales (79%) informaron que llevaban a cabo entre 20 y 100 pruebas de HbA2 por semana. La mayoría de las solicitudes de prueba de HbA2 respondían a consultas de asesoramiento genético, de ginecología y de pediatría. En relación con el método analítico, todos los laboratorios emplearon los sistemas HPLC, con excepción de uno que utilizó un método de cromatografía en microcolumna (Helena Laboratories, Beaumont, TX, USA). Todos los sistemas de HPLC eran del mismo fabricante (Bio-Rad); aproximadamente la mitad fueron Variant y otros fueron instrumentos Variant II.
A pesar de la homogeneidad analítica, se notaron algunas diferencias en los intervalos de referencia adoptados. El límite superior de referencia variaba entre 3,0% y 3,5%, mientras que el límite inferior para la identificación del rasgo para b-talasemia variaba entre 3,1% y 3,7%. Es interesante notar la zona de superposición entre los dos límites en el rango que iba desde 3,1% a 3,5% y que podría dar un diagnóstico clínico diferente para la misma muestra en diferentes laboratorios. La cuestión sobre cómo serían informados los resultados para un sujeto con HbA2 de 3,5%, e índices normales de glóbulos rojos dio lugar a la más amplia dispersión de respuestas (caso dudoso para ser investigado en más detalle; repetición de la prueba; portador de b-talasemia silencioso; o sin respuesta). Para excluir la presencia concomitante de anemia por deficiencia de hierro, el 68% de los laboratorios incluyeron la determinación de ferritina en suero entre las pruebas de screening para b-talasemia. El resto de los laboratorios midió zinc-protoporfirina (16%), capacidad de fijación total de hierro (11%) o concentración de hierro en suero (5%) para determinar la deficiencia de hierro.

Discusión

Se han informado los resultados de una evaluación interlaboratorio piloto relativa al ensayo de HbA2. Los resultados demuestran una dispersión interlaboratorio de los resultados de HbA2 para nada insignificante usando analizadores similares. Las posibles implicancias de tales resultados en la clasificación de los pacientes podría ser la siguiente. Suponiendo que la muestra A es representativa de un sujeto sano normal y que la muestra B está relacionada con un posible portador de b-talasemia, los datos demuestran que ningún laboratorio habría calificado erróneamente a estos dos casos. Por otro lado, suponiendo que la muestra C está relacionada con un sujeto con doble heterocigosidad para a- y b- talasemia, 9 de 47 laboratorios (es decir, aquellos que informaron HbA2 >4,0% para esta muestra) habrían clasificado a tal sujeto como un portador de b-talasemia, y 2 de 47 laboratorios (es decir, aquellos que midieron HbA2 ≤3,2% en esta muestra), habrían clasificado a tal sujeto como normal. Este último error en la clasificación es, por supuesto, peor que el anterior, y sirve para estimular la búsqueda de una mejora en la calidad analítica para la medición de HbA2 .
Los resultados obtenidos del cuestionario también demuestran que existe una fuerte necesidad de armonizar los procedimientos para el screening de talasemia a nivel de los laboratorios. El reciente establecimiento de un Grupo de Trabajo de la IFCC para la estandarización de HbA2, que tiene por objeto producir un método de referencia y materiales de referencia a ser utilizados para la estandarización de los métodos de laboratorio, tal vez pueda dar por resultado mejoras en la variabilidad interlaboratorio. Algunos datos preliminares sobre esta cuestión parecen promisorios (13).
Finalmente, un aspecto de este estudio que se quiere resaltar se refiere al uso de sangre como muestras interlaboratorio, en lugar del material que se usa más comúnmente, que está liofilizado o estabilizado de alguna otra manera. Este enfoque elimina la posibilidad de cualquier efecto de matriz y de manejo incorrecto que han sido documentados como causas frecuentes de resultados imprecisos en las evaluaciones multicéntricas (14) (15). Por otro lado, la limitación más importante que tiene el uso de sangre está relacionada con la posible desnaturalización de las muestras durante su transporte o almacenamiento. En este estudio, sin embargo, no parece haber ocurrido ninguna degradación considerable de la muestra, ya que ningún laboratorio informó acerca de anomalías en el patrón de separación cromatográfico. Es probable que el dispositivo para la toma de la muestra que se utilizó haya ayudado a mantener las muestras en buen estado.
Se espera que los resultados de esta prueba piloto puedan ser considerados con base valedera para futuros estudios más detallados que tengan por objeto monitorear y mejorar el rendimiento de la medición de HbA2.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Gianni Bertoli (Bio-Rad Laboratories srl, Segrate, Milán) por apoyar el studio y a Louise Benazzi (ITBA, CNR, Milán) por la revisión del manuscrito Las siguientes personas participaron en el estudio piloto: S. Arrigo, Milazzo; P. Bonini, Milán; P. Bonomo, Ragusa; M. Brini, Reggio Emilia; R. Caldarera, Mesina; M. Caldora, Nápoles; F. Canizzo, Vittoria; P.Cianciulli, Roma; A. Crifo, Mesina; M. D'Alessandro, Palermo; D. Dascola, Reggio Calabria; C. Di Girgenti, Palermo; F. Fazzi, Enna Bassa; F. Ferrara, Agrigento; M. Ferreri, Caltanisetta; M.G. Ferro, Catania; A. Finocchiaro, Paterno; R. Galanello, Cagliari; G. Girlando, Catania; S. Granata, Milán; T. Gristina, Palermo; G. Ivaldi, Génova; S. Leanza, San Gavino; A. Maggio, Palermo; C. Magnano, Catania; A. Maniscalco, Roma; S. Mascali, Caltagirone; P. Materia, Patti; G. Meli, Licata; M. Meo, Mesina; M. Morrone, Catania; R. Motta, Bologna; L. Pagano, Nápoles; A.Pietrapertosa, Bari; G. Qualtieri, Cosenza; G. Randazzo, Palmi; B. Ricerca, Roma; G. Roccamo, S. Agata di Militello; M.A. Romeo, Catania; G. Ruggeri Bagheria; A. Salvadori, Florencia; R. Spampinato, Lentini; T. Stampone, Palermo; G. Strazzeri, Canicattı`; P. Testasecca, Palermo; M.O. Vaccari, Rovigo; F. Vitale, Partinico; A. Zanella, Milán. Este trabajo fue parcialmente financiado por La beca de La EU Número 2004110 de la Junta Directiva C - Evaluación de la Salud Pública y de Riesgo, y Protección a la Salud y al Consumidor, Junta Directiva General (Andrea Mosca, receptor).

AUTOR PARA CORRESPONDENCIA

Prof. Andrea Mosca, Dipartimento di Science e Tecnologie Biomediche, Università degli Studi di Milano, Via F IIi Cervi 93, 20090 Segrate (MI), Italia Teléfono: +39-02-50330414, E-mail: andrea.mosca@unimi.it

Referencias bibliográficas

1. Rund D, Rachmilewitz E. b-Thalassemia. N Engl J Med 2005; 353: 1135-46.        [ Links ]

2. Weatherall DJ, Clegg JB. Inherited haemoglobin disorders: an increasing global health problem. Bull World Health Organ 2001; 79: 704-12.593        [ Links ]

3. Galanello R, Eleftheriou A, Traeger-Synodinos J, Old J,Petrou M, Angastiniotis M. Prevention of thalassaemias and other haemoglobin disorders. Nicosia: Thalassaemia International Federation, 2003.        [ Links ]

4. Angastiniotis M, Modell B. Global epidemiology of hemoglobin disorders. Ann NY Acad Sci 1998; 850: 251-69.        [ Links ]

5. Giambona A, Lo Gioco P, Marino M, Abate I, Di Marzo R, Renda M, et al. The great heterogeneity of thalassemia molecular defects in Sicily. Hum Genet 1995; 9: 526-30.        [ Links ]

6. Galanello R, Barella S, Ideo A, Gasperini D, Rosatelli C, Paderi L, et al. Genotype of subjects with borderline hemoglobin A2 levels: implication for b-thalassemia carrier screening. Am J Hematol 1994; 46: 79-81.        [ Links ]

7. White JM, Lewis SM. A report on the interlaboratory quantitation of haemoglobin A2 and haemoglobin F. J Clin Pathol 1973; 26: 864-7.        [ Links ]

8. Schmidt RM, Brosious EM. Quantitation of hemoglobin A2. An interlaboratory study. Am J Clin Pathol 1979; 71: 534-9.        [ Links ]

9. Franzini C. Liquid control materials for haemoglobin A2 and F: a one-year interlaboratory evaluation. Ann Clin Biochem 1985; 22: 257-60.        [ Links ]

10. Salvati AM, Maffi D, Caprari P, Marsili G. A pilot programme of external quality assessment for general haematology in Italy. Ann Ist Super Sanita 1995; 31: 131-9.        [ Links ]

11. Fairbanks VF, Klee GG. Biochemical aspects of haematology. In: Burtis CA, Ashwood ER, editors. Tietz textbook of clinical chemistry. Philadelphia: Saunders, 1994:1974-2072.        [ Links ]

12. Paleari R, Cannata M, Leto F, Maggio A, Demartis FR,92 Paleari et al.: External quality assessment of HbA2 in Italy Desogus MF, et al. Analytical evaluation of Tosoh HLC -723 G7 automated HPLC analyzer for hemoglobin A2 and F determination. Clin Biochem 2005; 38: 159-65.        [ Links ]

13. Mosca A, Paleari R, Bisse` E, Caruso D, Schaeffer C, Diemer H, et al. Development of a reference system for HbA2 [abstract]. In: European Association for Red Cell Research, EARC 15th meeting, 2005: 67.        [ Links ]

14. Weykamp CW, Penders TJ, Miedema K, Muskiet FA, Van der Silk W. Standardization of glycohemoglobin results and reference values in whole blood studied in 103 laboratories using 20 methods. Clin Chem 1995; 41: 82-6.        [ Links ]

15. Mosca A, Paleari R, Scime -Degani V, Leone L, Ivaldi G.Inter-method differences and commutability of control materials for HbA2 measurement. Clin Chem Lab Med 2000; 38: 997-1002.        [ Links ]