BIOLOGÍA MOLECULAR

Polimorfismo Pro12Ala del gen PPAR-g2 y síndrome metabólico. Estudio preliminar

Pro12Ala polymorphism of the PPAR-g2 gene and the metabolic syndrome. Preliminary study

Erika Fernández¹ *, Luz Marina Morales² *, Renata Vargas³ *, Laury Sandrea³ *, Emperatriz Molero-Conejo⁴ *, Virginia Fernández⁴ *, Mariana Zambrano¹ **, Lissett Connell³ *, Gilberto Campos⁵ *, Jose Aranguren-Mendez⁶ ***

1. Master en Genética.
2. Master en Bioquímica.
3. Lic. en Bioanálisis.
4. Doctorado en Ciencias Medicas
5. Master en Gerencia de proyectos de Investigación y Desarrollo.
6. Doctor en Genética

* Instituto de Investigaciones Clínicas Dr. Américo Negrette. Facultad de Medicina. Universidad del Zulia.
** Cátedra de Bioquímica Clínica. Escuela de Bioanálisis. Facultad de Medicina. Universidad del Zulia
*** Cátedra de Genética de la Facultad de Veterinaria. Universidad del Zulia, Venezuela

Resumen

El objetivo de este estudio fue determinar la prevalencia del polimorfismo Pro12Ala del gen PPARg2 en individuos no emparentados con síndrome metabólico de la ciudad de Maracaibo. Se seleccionaron 50 individuos (22 con síndrome metabólico y 28 sin síndrome metabólico) entre 22 y 58 años. A cada individuo se le realizó una evaluación clínica, nutricional y bioquímica. Para analizar la secuencia de la variante Pro12Ala del gen PPAR se empleó PCR y digestión enzimática de los fragmentos de restricción del polimorfismo (PCR-RFLP). En los individuos con síndrome metabólico el porcentaje de portadores del alelo Ala fue de 13,6%, mientras que en el grupo sin síndrome metabólico fue de 32,14%. La frecuencia para el alelo Ala del polimorfismo Pro12Ala fue de 0,12 y para el alelo Pro fue de 0,88. Los individuos con síndrome metabólico y portadores del alelo Ala presentaron niveles más bajos de triglicéridos y col-HDL más alto. Se concluye que la presencia del alelo Ala en individuos con síndrome metabólico mostró un efecto protector sobre el perfil lipídico.

Palabras clave: Síndrome metabólico; Gen del receptor activado de proliferación peroxisómica g2; Polimorfismo; Genética del síndrome metabólico

Summary

The aim of this paper was to determine the prevalence of the polymorphism pro12ala in non-related individuals with metabolic syndrome from Maracaibo-Venezuela. Fifty subjects (22 with metabolic syndrome and 28 without metabolic syndrome) between 22 to 58 years of age were selected. For each individual, biochemical, nutritious, and clinical evaluations were carried out. PCR and restriction-fragment length polymorphism enzyme digestion were used to analyze the Pro12Ala sequence variant of the PPAR gene. The distribution of the Ala allele was 13.6% in the individuals with metabolic syndro- and 32.14% in the group without metabolic syndrome. The frequency distributions of the PPAR gamma sequence variants were 0.12 for Ala variant and 0.88 for Pro. The subjects with the metabolic syndrome and carriers of the Ala 12 allele had lower concentration of triglycerides and higher HDL-C. It can be concluded that the Ala12 allele in individuals with metabolic syndrome had a protective effect on the lipid profile.

Key words: Metabolic syndrome; Human peroxisome proliferators-activated receptor-g2; Polymorphism; Metabolic syndrome genetics

Introducción

El polimorfismo Pro12Ala en el gen PPARg2 ha sido estudiado como una de las primeras variantes genéticas con amplio impacto en el riesgo de padecer diabetes tipo 2 (1), y se ha relacionado con diferentes componentes del síndrome metabólico (SM) (2). Los estudios sobre el gen PPAR han permitido aclarar más este síndrome, dada su participación en la regulación de la expresión de numerosos genes que afectan el control de la glicemia, el metabolismo de los lípidos, el tono vascular y la inflamación (3). La isoforma gamma del gen PPAR mejora la sensibilidad a la insulina, disminuye
la inflamación, los niveles de ácidos grasos libres y la presión sanguínea (4-8). Poulsen et al. (1) analizaron el polimorfismo Pro12Ala del gen PPARg2 en gemelos con tolerancia a la glucosa normal, encontrando una alta frecuencia del alelo Ala, evidenciándose así la asociación entre este alelo y una disminución del riesgo para diabetes mellitus tipo 2 y/o intolerancia a la glucosa. En Venezuela no existen estudios moleculares que permitan establecer el riesgo para el desarrollo de diabetes mellitus tipo 2. Considerando la relación que se ha descrito entre el polimorfismo Pro12Ala del PPARg2, SM y la diabetes tipo 2, este estudio preliminar tuvo como finalidad determinar la prevalencia del polimorfismo Pro12Ala del PPARg2 en individuos no consanguíneos con SM.

Materiales y Métodos

Se estudiaron 50 individuos no consanguíneos, (22 con síndrome metabólico y 28 sin síndrome metabólico), con edades comprendidas entre 22-58 años que fueron atendidos entre septiembre de 2006 y febrero de 2007, en la consulta de Enfermedades Metabólicas del Instituto de Investigaciones Clínicas "Dr. Américo Negrette" (Maracaibo, Venezuela). El criterio de inclusión fue: haber nacido en la ciudad de Maracaibo, con al menos un padre nacido en esta ciudad. Los individuos con hipertiroidismo, enfermedad hepática crónica, enfermedad renal crónica, infección aguda, enfermedad hematológica, historia familiar de diabetes, enfermedad cardiovascular y tratamiento farmacológico para hipertensión, hipercolesterolemia y diabetes mellitus tipo 2, fueron excluidos del estudio. Todos los participantes del mismo firmaron su consentimiento luego de que se les explicara la naturaleza del mismo. El protocolo de esta investigación fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Investigaciones Clínicas "Dr. Américo Negrette".
A cada sujeto se le realizó una historia clínica, donde constó la información sobre sus hábitos tabáquico y alcohólico. Se midieron los parámetros antropométricos tales como peso (Kg), talla (cm), y circunferencia de cintura (cm) a nivel umbilical. Se calculó el índice de masa corporal (IMC) empleando la fórmula de Quetelet (Kg/m²). La presión arterial (Korotkoff 5ta fase), se midió empleando un esfingomanómetro de mercurio estándar, en el brazo derecho, en posición sentada, realizando tres mediciones con un intervalo de un minuto, obteniendo un promedio de ellas.
Para el diagnóstico del síndrome metabólico se consideraron los criterios establecidos por el ATP III (9), que se indican a continuación:

Los sujetos con tres o más alteraciones se clasificaron como individuos con síndrome metabólico.
A cada individuo, después de 12 horas de ayuno, se le tomó una muestra de sangre venosa que se centrifugó a 3.000 rpm durante 15 min para obtener suero. Se determinaron los niveles de glicemia, triglicéridos, colesterol total, col-HDL, TGO (ASAT, aspartato aminotransferasa) y TGP (ALAT, alanin aminotransferasa) empleando métodos enzimáticos en un equipo analizador automático de química sanguínea (Autohumalyser 900 S plus, Wiesbaden, Alemania). Se calculó el col-LDL empleando la fórmula de Friedewald (10).
La muestra de ADN genómico se obtuvo aplicando la técnica combinada de extracción de ADN a partir de las técnicas Fenol/Sevag (11) e Inorgánica (12). Para tal fin se extrajeron de cada individuo en estudio, 5 mL de sangre periférica, con ácido etilendiamino tetracético (EDTA) 5 mM pH 7,4. La amplificación del ADN genómico se realizó por medio del análisis de PCR-RFLP, siguiendo la metodología realizada por Oh et al. (13). El producto amplificado se verificó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2%, empleando 5 μL de producto amplificado con 2 μL de la mezcla de los colorantes Azul de Bromofenol y Azul de Xilencianol 1:1 y 30% de glicerol. Se utilizó como marcador de peso molecular (MPM) el f174 digerido con Hae III, el cual se tiñó con bromuro de etidio. El fragmento de ADN una vez amplificado fue sometido a una reacción de digestión enzimática, empleando la enzima BstU-I (New England, BioLabs Inc.). La caracterización de los productos digeridos se llevó a cabo realizando una electroforesis en un gel de agarosa al 2,5%, con buffer TE1X a 100 V, utilizando como MPM el f174 con Hae III (Fig. 1).

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa del polimorfismo Pro12Ala: 1 MPM: Marcador de peso molecular f174 con Hae III. 2: Control sin digestión enzimática, 3: Individuo con el genotipo Pro/Ala 4: Individuo con el genotipo Pro/Pro.

MÉTODOS ESTADÍSTICOS

La diferencia estadística en la frecuencia alélica entre el grupo de individuos con SM y el grupo de individuos sin SM fue determinada empleando el paquete estadístico SAS versión 8.2. Para confirmar la diferencias entre los grupos de genotipos y para determinar el equilibrio de Hardy-Weinberg se empleó la prueba Chi-cuadrado (χ²). La influencia del genotipo en los parámetros clínicos fue estimada por el LSMEANS. El valor de p<0,05 fue considerado significativo.

Resultados

De acuerdo con los resultados mostrados en la Tabla I, el 44% (22/50) de los individuos estudiados se diagnosticaron con síndrome metabólico. Los niveles promedios de peso e IMC fueron significativamente diferentes entre los sujetos con y sin SM. Los niveles de triglicéridos, presión arterial sistólica y diastólica, aún cuando se encontraban dentro de los valores normales, fueron significativamente superiores (p<0,05) en los sujetos con SM comparados con los individuos sin SM. No se observaron diferencias significativas en cuanto a la edad promedio de los sujetos con y sin SM. Ambos grupos presentaron niveles de col-HDL bajos.

Tabla I. Características bioquímicas y antropométricas de la población estudiada.

Para evaluar la función hepática en los individuos con y sin síndrome metabólico se midieron las enzimas TGO y TGP. La media para la TGO en mujeres fue de 26,77±5,58 U/L y en hombres 20,50±7,14 U/L; en el caso de la TGP se encontraron medias de 23,33±5,24 U/L en mujeres y 16,00±4,08 U/L en hombres; todos los valores estuvieron dentro de los rangos de referencia.
Cuando se determinó la distribución genotípica del polimorfismo Pro12Ala del gen PPARg2 se encontró que el 76% (38/50) de los individuos estudiados presentaron el genotipo homocigoto Pro/Pro y el 24% (12/50) el genotipo heterocigoto Pro/Ala (Tabla II), no se encontraron individuos con el genotipo Ala/Ala. La frecuencia para el alelo Pro fue de 0,88 y para el Ala fue de 0,12. Cuando se clasificaron de acuerdo con la presencia o ausencia de SM, se observó que en los sujetos con SM la frecuencia del alelo Pro fue de 0,93 y para el Ala fue de 0,068; en los sujetos sin SM fue de 0,839 y 0,16 para el alelo Pro y Ala, respectivamente. Se encontró una asociación entre el polimorfismo y los elementos que definen el SM, observándose que los individuos con y sin SM con el alelo Ala, presentaron los niveles más bajos de triglicéridos y col-HDL más alto, cuando se los comparó con los sujetos con el alelo Pro, encontrándose que no hubo significancia estadística.

Tabla II. Distribución genotípica del polimorfismo Pro12Ala en los individuos en estudio.

La población estudiada se encontró en equilibrio genético de Hardy-Weinberg para este polimorfismo. La frecuencia para el genotipo Pro/Pro fue mayor en el grupo con SM, mientras que en los individuos sin SM el genotipo Pro/Ala fue mayor. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las proporciones de los diferentes genotipos del polimorfismo Pro12Ala y los grupos estudiados (Tabla II).
Con respecto a las características fenotípicas evaluadas en la población estudiada, se observaron niveles de triglicéridos y presión arterial diastólica significativamente más bajos en los heterocigotos Pro/Ala, en comparación con los individuos homocigotos Pro/Pro en el total de la muestra analizada. En las mediciones de la circunferencia de cintura, IMC, glicemia basal, niveles de col-HDL y presión arterial sistólica no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los individuos con genotipo Pro/Pro y Pro/Ala en la muestra estudiada (Tabla III).

Tabla III. Características bioquímicas, antropométricas y el polimorfismo Pro12Ala

En los individuos con SM con el genotipo Pro/Pro, al ajustar los valores por IMC se encontró asociación positiva significativa (p<0,05) entre la circunferencia de cintura y los niveles de col-HDL y entre los niveles de triglicéridos y la presión arterial sistólica. Cuando se ajustaron los valores por IMC se mantuvo la asociación entre triglicéridos y la presión arterial sistólica. Sólo tres individuos con el genotipo Pro/Ala presentaron SM en los que se encontraron niveles más bajos de triglicéridos y col-HDL más alto comparados con los sujetos con el alelo Pro, similar a lo observado en sujetos sin SM (datos no mostrados).
En el grupo de individuos sin síndrome metabólico y con el genotipo Pro/Pro, al ajustar los valores por IMC se encontró asociación positiva significativa (p<0,05) entre triglicéridos y col-HDL. En los sujetos con el genotipo Pro/Ala, al ajustar los valores por IMC, se encontró asociación positiva significativa (p<0,05) entre presión arterial diastólica y glicemia.

Discusión

En este estudio las características del SM encontradas con mayor frecuencia fueron la disminución del col-HDL en el 82% de la población estudiada, obesidad abdominal en el 70% de los sujetos en estudio, e hipertensión arterial en el 40%. Estos resultados fueron superiores a los reportados para el estado Zulia (2), lo cual podría relacionarse con el número de individuos estudiados y con los estrictos criterios de inclusión usados. La combinación de estos tres factores incrementa el riesgo de esta población para insulino resistencia, diabetes y enfermedad cardiovascular.
Al analizar la distribución genotípica del polimorfismo Pro12Ala del gen PPARg2, el genotipo Pro/Pro se encontró en el 76% y el Pro/Ala en el 24% de los individuos estudiados, similar a lo informado para la población caucásica (14-16). El genotipo Ala/Ala no fue encontrado, posiblemente a causa del reducido tamaño de la muestra analizada. Un estudio realizado en 2.245 sujetos no diabéticos daneses (17) informó que solamente 56 individuos (2,5%) fueron homocigotos para el alelo Ala, el cual es el menos frecuente. Se ha establecido que se requiere un tamaño de muestra grande para probar la asociación entre el Pro12Ala y diabetes tipo 2, debido al efecto modesto del alelo Pro. Aunque tiene poco efecto sobre el individuo, esta variante tiene un efecto sustancial sobre la población, ya que la frecuencia del alelo Pro es muy común. En la población estudiada la frecuencia alélica fue 0,12 mayor a la informada en la población blanca de Brasil por Tavares, et al. (18) y similar a la frecuencia encontrada en poblaciones caucásicas (6)(16-19). En la población de Maracaibo, el componente caucásico representa el 73,14% de la mezcla trirracial característica de la misma (20)(21). Los antecedentes genéticos de las poblaciones estudiadas podrían explicar las diferencias observadas en los resultados obtenidos.
Existen controversias del efecto protector del alelo Ala al asociarlo con el SM (17) y diabetes tipo 2 (7)(8)(15)(18)(22-26). En el presente estudio se encontró una asociación entre algunas de las características que definen el SM y la presencia del alelo Ala sólo en el grupo sin SM. Estos individuos presentaron menores niveles de triglicéridos y col-HDL más alto, con valores de presión diastólica inferiores a 85 mmHg, contribuyendo a la disminución del riesgo para desarrollar SM. El hecho que no se haya encontrado esta asociación en los individuos con SM, podría explicarse porque una vez que el cuadro clínico se encuentra avanzado en el individuo, el alelo Ala no ejerce su efecto protector tal como lo informaron por Stumvoll, et al. (4).
La circunferencia de cintura fue significativamente más baja en el grupo sin SM, tanto en los portadores del genotipo Pro/Pro como en los Pro/Ala, diferente a lo informado por Valve, et al. (27) y Meirhaeghe, et al. (28) quienes al estudiar estas características en mujeres obesas e individuos con diabetes tipo 2, encontraron un aumento de la circunferencia de cintura en los individuos con los genotipos Pro/Ala y Ala/Ala. En este estudio, los individuos con el genotipo Pro/Ala sin SM presentaron el IMC más bajo, no observándose esta característica en los sujetos con SM con el mismo genotipo. Deeb, et al. (6), encontraron que el alelo Ala estuvo asociado a IMC más bajo, niveles de insulina en ayunas menores, y mayor sensibilidad a la insulina, mientras que Ek, et al. (29) establecieron que la heterocigosidad de la variante del codón 12 no estuvo asociada con diferencias en el IMC o cambios en la regulación del peso durante el seguimiento en sujetos delgados u obesos. Sin embargo, en los obesos portadores del genotipo Ala/Ala, se observó un mayor IMC y mayor ganancia de peso en su seguimiento, al ser comparados con los obesos portadores del genotipo homocigoto Pro, mientras que el grupo de sujetos delgados portadores del genotipo homocigoto Ala tuvo menor IMC y menor incremento en el IMC a lo largo de su seguimiento, al ser comparado con los homocigotos Pro/Pro.
El presente estudio reveló que los niveles de triglicéridos de los individuos con el genotipo Pro/Ala estuvieron un 43% por debajo de los valores obtenidos en los sujetos que presentaron el genotipo Pro/Pro en el grupo general. Al estratificar el grupo completo en base a la presencia o no del SM, se encontraron resultados similares. Frederiksen, et al. (17), informaron aproximadamente 30% de reducción en los niveles de triglicéridos en individuos daneses con la variante genotípica Ala/Ala, sin síndrome de insulino resistencia. Del mismo modo, Douglas, et al. (8) encontraron niveles más bajos de triglicéridos en individuos con genotipo Pro/Ala y Ala/Ala. En este estudio, los individuos con el genotipo Pro/Ala, con y sin SM, presentaron niveles de col-HDL más elevados que los individuos con el genotipo Pro/Pro. Deeb, et al. (6) informaron niveles más altos de col-HDL en los individuos con el genotipo Ala/Ala al compararlos con los Pro/Pro y Pro/Ala. Existen diversos trabajos que han informado que no existe asociación entre la presencia del polimorfismo Pro12Ala y los niveles de colesterol total, col-HDL, col-LDL o triglicéridos en poblaciones de latinos y europeos (17)(23)(30).
Por otra parte, se encontró una disminución estadísticamente significativa en la presión arterial diastólica entre los individuos con genotipo Pro/Pro y Pro/Ala sin SM. Según estos resultados, la PAD no se encontró asociada al genotipo sino más bien al hecho de no presentar SM. Estudios previos (31) han informado una relación baja entre hipertensión y col-HDL, siendo ambos componentes del SM. Se ha establecido que el conjunto de estos componentes, más que su efecto individual, aumenta el riesgo cardiovascular (32). La asociación entre la variante Pro12Ala y la presión arterial no está clara. Frederiksen, et al. (17) observaron que los sujetos que presentaban el genotipo homocigoto Ala/Ala tuvieron menores niveles de presión arterial diastólica mientras que Douglas, et al. (8) informaron un aumento de la presión diastólica en los individuos con el genotipo Pro/Ala y Ala/Ala. Por otra parte, no se encontró asociación entre los niveles de glicemia basal y el polimorfismo Pro12Ala, similar a lo observado por Tavares, et al. (18).
En conclusión, la presencia del alelo Ala en individuos con SM mostró un efecto protector sobre el perfil lipídico de los sujetos estudiados y en los individuos sin SM tuvo un mejor efecto sobre las variables antropométricas y presión arterial, disminuyendo el riesgo para el desarrollo del mismo.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por CONDES-LUZ Nº 0589-04

CORRESPONDENCIA

MGSC. ERIKA FERNÁNDEZ
Instituto de Investigaciones Clínicas "Dr. Américo Negrette"
Facultad de Medicina. La Universidad del Zulia
Calle 65 con AV 18 A planta baja apartado postal 23
MARACAIBO, Venezuela
Tel.: (58) 04146031823 Fax: (58) 02617597247
E-mail: erikafernandez2002@yahoo.com; erfernandez@luz.edu.ve

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Aceptado para su publicación el 16 de diciembre de 2008