SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.43 número3Procalcitonina: ¿marcador de elección de infección bacteriana en 2007? índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Articulo

Indicadores

  • No hay articulos citadosCitado por SciELO

Links relacionados

  • En proceso de indezaciónCitado por Google
  • No hay articulos similaresSimilares en SciELO
  • En proceso de indezaciónSimilares en Google

Bookmark


Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. v.43 n.3 La Plata jul./sep. 2009

 

FEDERACIÓN INTERNACIONAL DE QUÍMICA CLÍNICA Y LABORATORIO CLÍNICO

Procedimientos primarios de referencia de la IFCC para la medición de concentraciones de actividad catalítica de enzimas a 37 °C

Federación Internacional de Química Clínica y Laboratorio Clínico (IFCC)(1)

División Científica, Comité sobre los Sistemas de Referencia para Enzimas (C-RSE)

Parte 8. Procedimiento de referencia para la medición de la concentración catalítica de a-amilasa
[a-Amilasa: 1,4-a-D-glucan 4-glucanohidrolasa (AMY), EC 3.2.1.1]

Gerhard Schumann1,*, Ryoji Aoki2, Carlo A. Ferrero3, Glenn Ehlers4, Georges Férard5, F.-Javier Gella6, Poul Jørgen Jørgensen7, Takahashi Kanno8, Art Kessner9, Rainer Klauke1, Hans-Joachim Kytzia10, Jean-Marc Lessinger5, W. Gregory Miller11, Rolf Nagel10, Jean Pauwels12, Heinz Schimmel12, Lothar Siekmann13, Gerhard Weidemann14, Kiyoshi Yoshida2 y Ferruccio Ceriotti3

Esta traducción fue autorizada por la IFCC. Sin embargo, la IFCC no acepta ninguna responsabilidad por la exactitud de la misma. El documento definitivo continúa siendo el original en inglés

1) El exclusivo © para todos los idiomas y países es de propiedad de la Federación Internacional de Química Clínica y el Laboratorio Clínico.

1 Klinische Chemie, Medizinische Hochschule Hannover, Hannover, Alemania
2 Research & Development, Asahi Chemical Industry Co., Tokyo, Japan
3 Laboratorio Standardizzazione, Diagnostica e Ricerca San Raffaele s.p.a., Milano, Italia
4 Ortho-Clinical Diagnostics, Rochester, NY, Estados Unidos
5 Laboratoire de Biochimie appliqueé, Faculté de Pharmacie, Université Louis Pasteur, Illkirch, Francia
6 BioSystems, S.A., Barcelona, España
7 Department of Clinical Chemistry, Odense University Hospital, Odense, Dinamarca
8 Department of Laboratory Medicine, Hamamatsu University, School of Medicine, Japón
9 Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, Estados Unidos
10 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania
11 Virginia Commonwealth University, Richmond, VA, Estados Unidos
12 European Commission, Joint Research Centre, Institute for Reference Materials and Measurements Geel, Bélgica
13 Institut für Klinische Biochemie, Universität Bonn, Bonn, Alemania
14 Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin, Klinikum der Stadt, Nürnberg, Alemania

La Federación Internacional de Química Clínica y Laboratorio Clínico (IFCC) ha autorizado a Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana a traducir al español los documentos aprobados por los distintos Comités de la División Científica de la entidad. Esto significa una distinción para nuestra publicación pero al mismo tiempo el compromiso de transformarla en una sección permanente.

Resumen

Este trabajo es el octavo de una serie dedicada a los procedimientos de referencia para la medición de las concentraciones de actividad catalítica de las enzimas a 37 °C y a la certificación de las preparaciones de referencia. Otras partes se refieren a: Parte 1. El concepto de los procedimientos de referencia para la medición de las concentraciones de la actividad catalítica de las enzimas; Parte 2. Procedimiento de referencia para la medición de la concentración catalítica de creatina quinasa; Parte 3: Procedimiento de referencia para la medición de la concentración catalítica de lactato deshidrogenasa; Parte 4. Procedimiento de referencia para la medición de la concentración catalítica de alanin aminotransferasa; Parte 5. Procedimiento de referencia para la medición de la concentración catalítica de aspartato aminotransferasa; Parte 6. Procedimiento de referencia para la medición de la concentración catalítica de g-glutamiltransferasa; Parte 7. Certificación de cuatro materiales de referencia para la determinación de la actividad enzimática de g-glutamiltransferasa, lactato deshidrogenasa, alanin aminotransferasa y creatina quinasa a 37 °C. El procedimiento que se describe aquí se deduce a partir del método de referencia de la IFCC a 30 °C descrito previamente. Las diferencias se tabulan y comentan en Clin Chem Lab Med 2006; 44: 1146-55.

Palabras clave: a-amylasa; Procedimiento de referencia de la IFCC; Límites de referencia preliminares altos y bajos.

Abreviaturas: AMY, a-amilasa; EPS, 4,6-etilideno (G1)-4-nitrofenil (G7)-a-(1→4)-D-maltoheptósido; G,a-(1→4)-D-glucopiranosil-; 4-NP, 4-nitrofenóxido; G7-4-NP, 4-nitrofenil-a-(1→4)-D-maltoheptósido; IRMM, Instituto para Materiales y Mediciones de Referencia.

Introducción

Este trabajo es el octavo de una serie dedicada a los procedimientos de referencia para la medición de las concentraciones de actividad catalítica de las enzimas a 37 °C y a la certificación de las preparaciones de referencia (1-7).

Principio de la reacción

Especímenes

Materiales de calibración, especímenes de control y suero humano.

Condiciones de medición

Las concentraciones en la mezcla de reacción final y las condiciones de medición se listan en las Tablas I y II.

Tabla I. Concentraciones en la mezcla de reacción completa final para la medición de a-amilasa.

Tabla II. Condiciones para la medición de a−amilasa.

Nota: El cumplimiento con las tolerancias prescriptas para los parámetros temperatura, pH, camino óptico y longitud de onda se confirma si la incertidumbre expandida combinada de la calibración es igual a o menor que las tolerancias y si el rango de incertidumbre de la calibración se superpone con los intervalos de referencia prescriptos.

Reactivos

1. Ácido N-2-Hidroxietilpiperazina-N'-etansulfónico [HEPES] (C8H18N2O4S), PM = 238,31
2. 4,6-Etilideno(G1)-4-nitrofenil(G7)-a-(1→4)-Dmaltoheptósido [EPS], (C50H77NO38), PM= 1300,1
3. a-Glucosidasa (EC 3.2.1.20)
4. Cloruro de Sodio (NaCl), PM=58,44
5. Cloruro de cálcio dihidrato (CaCl2.2H2O), PM= 147,02
6. Solución de hidróxido de sodio (NaOH), PM=40,00, 0,2 mol.L-1
7. Albúmina de suero bovino, fracción V, PM=68000
8. Solución acuosa de cloruro de sodio (NaCl), PM=58,44, 0,154 mol.L-1
9. Agua (grado analítico), PM=18,02

Se deben utilizar reactivos de la más alta pureza. La calidad de los reactivos tiene que ser probada por medio de certificados de análisis de los proveedores. Si se sospecha que un reactivo químico contiene impurezas que afectan la actividad catalítica del analito, se debe profundizar más en la investigación, por ejemplo, realizar comparaciones con productos de diferentes fabricantes y de diferentes lotes. Se recomienda utilizar reactivos que hayan sido testeados y aprobados en las comparaciones.

EPS: La contaminación del sustrato EPS por 4-nitrofenil- a-D-maltoheptósido (G7-4-NP) podría originar una fase prolongada de aletargamiento y podría interferir en la determinación de la concentración catalítica de la a-amilasa. La fracción de masa de G7-4-NP en EPS se limita a 0,001. Si la fracción de masa de G7-4-NP es desconocida para el usuario o no está claramente especificada en el certificado, la concentración de masa de G7-4-NP tiene que ser determinada (Ver Apéndice 2).
a-Glucosidasa: Sólo son convenientes las preparaciones enzimáticas de a-glucosidasa que separan a todas las uniones glucosídicas de los productos de reacción de la a-amilasa (por ejemplo, del Bacillus stearothermophilus).
Albúmina de suero bovino: La albúmina de suero bovino que se utilice debe estar libre de proteasas, como se declara en las especificaciones del fabricante.

Calibración del pehachímetro

El coeficiente de absorción molar del indicador depende en gran medida del pH. Por lo tanto, la calibración del pehachímetro y los ajustes del pH de la solución 2 y de la solución del reactivo iniciador deben ser muy precisos. Se tienen que usar al menos dos soluciones estándares de buffer para el procedimiento de calibración. Las soluciones estándares de buffer deben tener valores certificados dentro del rango de pH 6 a pH 8 y deberán incluir el ajuste del pH de las soluciones del reactivo. La incertidumbre del pH certificado tiene que ser ≤ 0,01 pH.

Nota: Se recomienda el uso de las soluciones estándares de buffer que contengan fosfato diácido de potasio (anhidro) y fosfato ácido de sodio (anhidro). Se encuentran disponibles de manera comercial soluciones buffer de referencia apropiadas trazables con materiales de referencia estándares nacionales o internacionales.
Nota: El coeficiente de absorción molar del indicador (4-nitrofenóxido) depende en gran medida del pH. Un desvío de 0,01 en el pH ocasiona un cambio en la cinética del 1% aproximadamente. Por consiguiente, se debe ajustar el pH de manera muy precisa.

Esquemas para el ajuste y control del pH

PROCEDIMIENTO PARA EL AJUSTE DEL pH A TEMPERATURAS QUE SE ALEJAN DE 37 °C

Tanto el termómetro como el electrodo de pH se suspenden en la solución mixta simultáneamente. La solución mezclada luego se titula al pH listado en las Tablas III y IV para la verdadera temperatura medida. La velocidad de agitación deberá ser la misma durante la calibración y el control del pehachímetro y durante el ajuste del pH de las soluciones del reactivo. El electrodo de pH debe estar ubicado en el centro de la solución mezclada. El hecho de que la temperatura puede cambiar durante la titulación debe ser tenido en cuenta. Es por eso que se debe controlar nuevamente la temperatura en la proximidad del valor de pH deseado y se debe corregir el pH de ser necesario. Lo mismo se aplica para el ajuste de la compensación de la temperatura del pehachímetro.

Tabla III. Dependencia respecto de la temperatura, del pH de la Solución 2

Tabla IV. Dependencia del pH de la solución del reactivo del comienzo de la temperatura

Preparación de las soluciones

La masa dada para los compuestos para la preparación de las soluciones se refiere al 100% del contenido. Si el contenido del reactivo químico empleado es menor (por ejemplo, yz%), la cantidad equivalente a la masa dada se calcula usando un factor:

Las impurezas en el agua para preparación de las soluciones de reactivos para medir a-amilasa pueden producir inhibición de la actividad catalítica. Las guías que describen la preparación y la realización de pruebas del agua para reactivos se publican en algún otro sitio (9). Sin embargo, los estándares que describen la calidad del agua específicamente para las mediciones de enzimas todavía no se han definido. En el caso de sospechar la influencia del agua en la determinación de la concentración de la actividad catalítica, es necesario realizar investigaciones sistemáticas. La incertidumbre expandida (k=2) combinada (normalmente distribuida) de cada procedimiento de peso (inclusive la incertidumbre de la pureza de la sustancia) deberá ser ≤ 1,5% y la masa en el visor de la balanza no deberá ser diferente de la masa esperada en más ± 0,5%.

SOLUCIÓN 1

6,14 g (417,5 mmol.L-1) de cloruro de calcio, dihidrato.

• Disolver en aproximadamente 80 mL de agua.
• Transferir a un recipiente volumétrico de 100 mL
• Equilibrar el recipiente volumétrico y el agua a 20 °C.
• Llenar con agua (20 °C) hasta la marca para calibración que tiene el recipiente volumétrico.

Estabilidad a 20 °C: 3 meses.

SOLUCIÓN 2

3,10 g (52,10 mmol.L-1) de ácido N-2-Hidroxietilpiperazina- N'-etansulfónico

1, 26 g (86,13 mmol.L-1) de cloruro de sodio.

• Disolver en aproximadamente 200 mL de agua.
• Agregar 0,75 mL de la solución 1.
• Ajustar a pH (37 °C) 7,00 con 0,2 mol.L-1 de solución de hidróxido de sodio.
• Transferir a un recipiente volumétrico de 250-mL.
• Equilibrar el recipiente volumétrico y el agua a 20 °C.
• Llenar con agua (20 °C) hasta la marca de calibración del recipiente volumétrico.

Estabilidad a 2-8 °C: 5 semanas.

REACTIVO DILUYENTE PARA ENZIMAS

1,20 g de albúmina bovina.
0,90 g (154 mmol L-1) de NaCl.

• Disolver en aproximadamente 80 mL de agua.
• Transferir a un recipiente volumétrico de 100-mL.
• Equilibrar el recipiente volumétrico y el agua a 20 °C.
• Llenar con agua (20 °C) hasta la marca de calibración del recipiente volumétrico.

Estabilidad a 2 °C-8 °C: al menos 3 meses.

SOLUCIÓN 3

16,9 mkat.L-1 (1014 kUL-1) de a-glucosidasa a 37 °C.

• Determinar la concentración catalítica de a-glucosidasa de acuerdo con el Apéndice 1.
• Reconstituir la a-glucosidasa liofilizada con un volumen del Reactivo Diluyente para Enzimas hasta obtener una concentración catalítica del material reconstituido de 16,9 mkat.L-1 (1014 kU.L-1) a 37 °C.
• Freezar la solución enzimática en porciones de 0,25 mL a -25 °C.

Estabilidad a -25 °C: al menos 6 meses.

SOLUCIÓN DE REACCIÓN

• Mezclar 25 mL de la solución 2 con 0,25 mL de la solución 3.

Estabilidad a 2-8 °C: 2 semanas.

SOLUCIÓN DEL REACTIVO INICIADOR

1,01 g (31,00 mmol.L-1) de 4,6-etilideno(G1)-4-nitrofenil (G7)- a-(1→4)-D-maltoheptósido.
0,310 g (52,10 mmol.L-1) de ácido N-2-Hidroxietilpiperazina- N'-etansulfónico.

• Disolver en aproximadamente 20 mL de agua.
• Ajustar a pH (37 °C) 7,00 con 0,2 mol.L-1 de solución de hidróxido de sodio.
• Transferir a recipiente volumétrico de 25-mL.
• Equilibrar el recipiente volumétrico y el agua a 20 °C.
• Llenar con agua (20 °C) hasta la marca de calibración del recipiente volumétrico.

Estabilidad a 2-8 °C: 2 semanas.

Procedimiento de medición

Equilibrar sólo un volumen adecuado (≈0,6 mL por medición) de la solución del reactivo iniciador a 37 °C inmediatamente después del procedimiento de medición. El volumen restante de la solución del reactivo iniciador debe guardarse a 2-8 °C. Pipetear los volúmenes listados en la Tabla V uno tras otro dentro de la cubeta. Se deberán utilizar un espectrómetro de alto rendimiento y elementos volumétricos de alta precisión. La imprecisión de las mediciones fotométricas cinéticas y la imprecisión de la fracción de volumen de las muestras se determinarán por medio de procedimientos de pruebas con incertidumbres estándares conocidas.

Tabla V. Sistema analítico para medición de a-amilasa

BLANCO DE REACTIVO

Para determinar el blanco del reactivo, la muestra se reemplaza por una solución de cloruro de sodio 9 g.L-1 (154 mmol.L-1). El procedimiento de medición luego se lleva a cabo tal como se describe más arriba. La absorbancia inicial no deberá exceder 0,35 y el cambio en la absorbancia del blanco de reactivo deberá ser menor que 3,3X10-5 s-1 (0,002 min-1). De lo contrario, las fuentes de contaminación por amilasa salivar deberán identificarse y excluirse o se deberá reevaluar la pureza de los reactivos.

BLANCO DE MUESTRA

Para la determinación del blanco de muestra, la solución del reactivo iniciador se reemplaza por una solución de 9 g.L-1 (154 mmol.L-1) de cloruro de sodio. El procedimiento de medición luego se lleva a cabo tal como se describe más arriba.
Nota: El blanco de muestra se determina y documenta pero no se lo tiene en cuenta para el cálculo de la concentración catalítica de a-amilasa en suero control y calibradores. Si el valor del blanco de muestra excede en 1% a la a-amilasa total, se debe advertir que el material no es apropiado para la calibración.
Nota: El blanco de reactivo para la muestra se determina reemplazando la solución del reactivo iniciador y la muestra por una solución de cloruro de sodio 9 g.L-1.
Nota: La omisión del reactivo iniciador significa que se omite la sustancia que forma el indicador. Por lo tanto, no se identifica la interferencia de la matriz de la muestra en la reacción del indicador.

LÍMITE SUPERIOR DEL RANGO DE MEDICIÓN

Si el cambio en la absorbancia excede 0,0039 s-1 (0,235 min-1) en el intervalo de medición, se debe diluir una porción analítica de la muestra con una solución acuosa de cloruro de sodio 9 g.L-1 (154 mmol.L-1) y el procedimiento de medición debe repetirse con la muestra diluida. El valor obtenido luego debe multiplicarse por el factor de dilución correspondiente.

FUENTES DE ERROR

La concentración catalítica de a-glucosidasa en la mezcla de reacción completa final está inhibida de manera diferente por la matriz específica diluida del espécimen identificado (ver los comentarios correspondientes en el Apéndice 3). Por lo tanto, es necesario determinar la inhibición de a-glucosidasa dependiente de la matriz de para cada material investigado (Ver Apéndice 1).
Los agentes que complejan el calcio reducen la concentración disponible de este componente esencial y pueden originar valores de medición reducidos. La contaminación con amilasa salivar (por ejemplo, por contacto del dedo con las soluciones o de los bordes internos de los recipientes con la solución) da lugar a concentraciones catalíticas de a-amilasa falsamente concentradas o blancos de reactivo incrementados.

Cálculo

El cambio temporal en la absorbancia (s-1) se calcula utilizando análisis de regresión (método de mínimos cuadrados). Luego de la sustracción del blanco del reactivo (s-1), el cambio de absorbancia corregida (s-1) se multiplica por el factor

F=3063
[medición a 405 nm, 405(4-NP)=1012 m2.mol-1 ]

Nota: La IFCC y la IRMM recomiendan el uso del coeficiente de absorción molar ε405(4-NP)=1012 m2 .mol-1 (10).
La concentración catalítica de a-amilasa se calcula en in μkat.L-1.

La concentración catalítica en μkat.L-1 se puede convertir a U.L-1 multiplicando por el factor f= 60.

Límites de referencia preliminares altos y bajos

VALORES DE REFERENCIA

Los intervalos de referencia preliminares se obtuvieron en dos laboratorios de referencia diferentes midiendo la actividad de a-amilasa en muestras de suero de dos cohortes de referencia (146 varones y 89 mujeres). Las cohortes de referencia comprendían muestras de sueros de empleados que se realizaban un chequeo anual de salud (primera cohorte) y de donantes de sangre (segunda cohorte). Las muestras se excluían de la cohorte de referencia si la concentración en al menos una de las siguientes determinaciones en suero excedían el límite de referencia superior: creatinina, glucosa, AST, ALT, GGT (y/o ALP) y lipasa (cohorte 2 solamente). No se pudieron observar diferencias significativas (prueba t,p<0,05) entre las dos cohortes de referencia o entre las muestras de varones y de mujeres.
Los límites de referencia preliminares para hombres y para mujeres (≥17 años) son:

Límite de referencia inferior* (intervalo de confianza del 90% para el percentil 2,5)
0,52 μkat.L-1 (0,42 μkat.L-1-0,60 μkat.L-1)
31 U.L-1 (25 U.L-1-36 U.L-1)

Límite de referencia superior * (intervalo de confianza del 90% para el percentil 97,5)
1,78 μkat.L-1 (1,71 μkat.L-1-2,00 μkat.L-1)
107 U.L-1 (103 U.L-1-120 U.L-1)

* Los límites de referencia inferiores y superiores son los percentiles 2,5 y 97,5 de las cohortes de referencia. Los valores entre paréntesis son los intervalos de confianza del 90% para los percentiles 2,5 y 97,5.

Apéndice 1: Determinación de la concentración catalítica de a-glucosidasa bajo condiciones de reacción del procedimiento para a-amilasa.

REACTIVOS ADICIONALES

4-Nitrofenil-a-D-glucopiranósido (C12H15NO8) PM= 301,26

SOLUCIÓN A

1,24 g (52,08 mmol.L-1) de ácido N-2-Hidroxietilpiperazina- N'-etansulfónico
0,419 g (71,63 mmol.L-1) de NaCl.
• Disolver en aproximadamente 80 mL de agua.
• Agregar 0,25 mL de solución 1 para el procedimiento para a-amilasa (solución de reserva de cloruro de calcio).
• Ajustar pH (37 °C) a 7, 00 con solución de hidróxido de sodio 0,2 mol.L-1.
• Transferir a un recipiente volumétrico de 100-mL.
• Equilibrar el recipiente volumétrico y el agua a 20 °C.
• Llenar con agua (20 °C) hasta la marca de calibración del recipiente volumétrico.

Estabilidad a 2-8 °C: 5 semanas.

SOLUCIÓN B

0,900 g (154.0 mmolL-1) de cloruro de sodio.

• Disolver en aproximadamente 80 mL de agua.
• Transferir a un recipiente volumétrico de 100-mL
• Equilibrar el contenedor volumétrico y el agua a 20 °C.
• Llenar con agua (20 °C) hasta la marca de calibración del recipiente volumétrico.

Estabilidad a 20 °C: 3 meses.

SOLUCIÓN DE REACCIÓN PARA a-GLUCOSIDASA

0,0392 g (5,208 mmol.L-1) de 4-nitrofenil-a-D-glucopiranósido

• Transferir a un recipiente volumétrico de 25-mL y disolver en aproximadamente 20 mL de solución A.
• Equilibrar el recipiente volumétrico y la solución A a 20 °C.
• Llenar con solución A (20 °C) hasta la marca de calibración del contenedor volumétrico.

Estabilidad a 2-8 °C: 5 días.

Condiciones de medición

Las concentraciones en la mezcla de reacción y las condiciones de medición se listan en las Tablas VI y VII.

Tabla VI. Concentraciones en la mezcla de reacción completa final para la medición de a-glucosidasa.

Tabla VII. Condiciones para la medición de a-glucosidasa.

PREPARACIÓN DE a-GLUCOSIDASA

1. Pesar aproximadamente 10 mg de la enzima liofilizada (registrar la masa pesada; m) y reconstituir con 1000 μL de Reactivo Diluyente para Enzimas del procedimiento de a-amilasa.
2. Diluir 50 μL de la a-glucosidasa reconstituida con 1000 μl del Reactivo Diluyente para Enzimas. La dilución del primer paso es 1:21.
3. Diluir 50 μL de la solución del paso 1 con 1000 μl del Reactivo Diluyente para Enzimas. La dilución del segundo paso es 1:21. La dilución total luego del paso 1 y el paso 2 es 1:441. El factor de dilución es por lo tanto 441.

Nota: Las diluciones indicadas en el paso 1 y en el paso 2 son apropiadas para a-glucosidasa liofilizada que contiene 0,40-1,65 μkat.mg-1 (25-100 U.mg-1). La preparación de la a-glucosidasa liofilizada probablemente necesite otras diluciones. El factor de dilución debe cambiarse de acuerdo a la dilución.

Procedimiento de medición

La concentración catalítica de a-glucosidasa se determina bajo condiciones de reacción que se encuentran muy cerca de aquellas del procedimiento para a-amilasa.
La reacción comienza con la solución diluida de a-glucosidasa.
Pipetear los volúmenes indicados en la Tabla VIII secuencialmente dentro de la cubeta.

Tabla VIII. Sistema analítico para la medición de a-glucosidasa.

BLANCO DE REACTIVO

Para poder determinar el blanco del reactivo, la solución diluida de a-glucosidasa se reemplaza por el Reactivo Diluyente para Enzimas. El procedimiento de medición se lleva a cabo tal como se describe más arriba.

Cálculo

El cambio temporal en la absorbancia (s-1) se calcula usando análisis de regresión (método de los mínimos cuadrados). Se sustrae el blanco de reactivo. El cambio de la absorbancia corregido se usa para calcular la concentración de la masa catalítica:

Cálculo de la concentración de masa catalítica de polvo liofilizado de a-glucosidasa:

Nota: Esta fórmula es válida solamente si el volumen para la reconstitución es 1000 μl (ver paso 1 en la sección Preparación de a-glucosidasa).

La concentración de masa catalítica en μkat.mg-1 se puede convertir a U.mg-1multiplicando por el factor f=60.
Se usa también el mismo procedimiento para determinar la inhibición relativa de a-glucosidasa originada por la matriz de algunas muestras de a-amilasa. Se realizan dos mediciones: una, utilizando la Solución B y la otra sustituyendo la Solución B por la muestra de a-amilasa que se está investigando. En ambas mediciones, la reacción comienza con una solución de a-glucosidasa diluida con el Reactivo Diluyente para Enzimas a una concentración catalítica entre 8 μkat.L-1 y 33 μkat.L-1 (500 μ.L y 2000 U.L-1).

Cálculo de la inhibición de a-glucosidasa dependiente de la matriz

La inhibición relativa (%) de la concentración catalítica de a-glucosidasa causada por la matriz de la muestra en la mezcla de reacción final se calcula a partir de las tasas de conversión obtenidas con y sin la muestra investigada.

Nota: Si la inhibición relativa de la concentración catalítica de a-glucosidasa por la muestra en la prueba excede 45%, la fase de retraso probablemente no sea completa. Tal material no debería recomendarse como calibrador o como material de control.

Apéndice 2: Control de la fracción de masa de G7-4-NP en EPS

La solución 3 del procedimiento de referencia para a-amilasa se diluye 1+4 con el Reactivo Diluyente para Enzimas. Esta solución se mezcla con la solución del reactivo iniciador 1+ 100. Otra solución del reactivo iniciador se mezcla en la misma proporción con el Reactivo Diluyente para las Enzimas. Ambas mezclas se incuban a temperatura ambiente y se las protege de la luz durante 1 hora. La absorbancia a 405 nm de la solución del reactivo iniciador que contiene a-glucosidasa se mide a 37 °C. Como referencia se usa la solución del reactivo iniciador sin a-glucosidasa.
La contaminación de EPS por G7-4-NP es ≤ 0,1% si la absorbancia medida es ≤32.
Nota: El valor de la absorbancia de 0,32 se basa en EPS con un contenido del 100%. Se deben realizar correcciones si el lote de EPS que se utiliza tiene un contenido <100%.

Apéndice 3: Cambios en el procedimiento de referencia de la IFCC para mediciones a 37 °C comparados con el método de referencia para mediciones a 30 °C tal como se describe en el documento original de la IFCC

El procedimiento de referencia primario se deriva del método de referencia de la IFCC (8) que proporciona condiciones optimizadas para la medición de la actividad catalítica de las concentraciones de a-amilasa. La temperatura de medición de 37 °C en lugar de 30 °C requiere solamente mínimos cambios en ciertos parámetros de medición para preservar las condiciones de medición óptimas. Las modificaciones se listan y comentan en la Tabla IX. Además, en la misma tabla se describe también si es necesario realizar una especificación más precisa en comparación con el método de referencia a 30 °C para mejorar el alto nivel de estandarización de las mediciones.

Tabla IX. Comparación de los métodos de la IFCC para la medición a 30 °C y 37 °C.

CORRESPONDENCIA

PROF. GERHARD SCHUMANN,KLINISCHE CHEMIE,
Medizinische Hochschule Hannover,
Carl-Neuberg-Str. 1, 30623 HANNOVER, Germany
Teléfono: +49-511-5322523, Fax: +49-511-5325671,
E-mail: schumann.gerhard@mh-hannover.de

Referencias bibliográficas

1.Siekmann L, Bonora R, Burtis CA, Ceriotti F, Clerc-Renaud P, Férard G, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 1. The concept of reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes. Clin Chem Lab Med 2002; 40: 631-4.        [ Links ]

2.Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Clerc-Renaud P, Férard G, Ferrero CA, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 2. Reference procedure for the measurement of catalytic activity concentration of creatine kinase [ATP: creatine N-phosphotransferase (CK), EC 2.7.3.2]. Clin Chem Lab Med 2002; 40: 635-42.        [ Links ]

3.Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Clerc-Renaud P, Férard G, Ferrero CA, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 3. Reference procedure for the measurement of catalytic activity concentration of lactate dehydrogenase [L-lactate: NAD+ oxidoreductase (LDH), EC 1.1.1.27]. Clin Chem Lab Med 2002; 40: 636-48.        [ Links ]

4. Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Férard G, Ferrero CA, Franck PF, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 4. Reference procedure for the measurement of catalytic activity concentration of alanine aminotransferase [L-alanine: 2-oxoglutarate aminotransferase (ALT), EC 2.6.1.2] Clin Chem Lab Med 2002; 40: 718-24.        [ Links ]

5.Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Férard G, Ferrero CA, Franck PF, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 5. Reference procedure for the measurement of catalytic activity concentration of aspartate- aminotransferase [L aspartate: 2-oxoglutarateaminotransferase (AST), EC 2.6.1.1]. Clin Chem Lab Med 2002; 40: 725-33.        [ Links ]

6. Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, Férard G, Ferrero CA, Franck PF, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 6. Reference procedure for the measurement of catalytic activity concentration of g-glutamyltransferase [(?-glutamyl)-peptide: amino acid g-glutamyltransferase (GGT), EC 2.3.2.2]. Clin Chem Lab Med 2002; 40: 734-8.        [ Links ]

7. Siekmann L, Bonora R, Burtis CA, Ceriotti F, Clerc- Renaud P, Férard G, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 7. Certification of four reference materials for the determination of enzymatic activity of g-glutamyltransferase, lactate dehydrogenase, alanine aminotransferase and creatine kinase according to IFCC procedures at 37 ° C. Clin Chem Lab Med 2002; 40: 739-45.        [ Links ]

8.Lorentz K, International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). Approved recommendation on IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. Part 9. IFCC method for a-amylase (1,4- a-Dglucan 4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.1). Clin Chem Lab Med 1998; 36: 185-203.        [ Links ]

9.Clinical and Laboratory Standards Institute. Preparation and testing of reagent water in the clinical laboratory; Proposed guideline, 4th ed.        [ Links ]

10.Linsinger T, Schimmel H, Pauwels J, Schumann G, Siekmann L. IRMM/IFCC information. Catalytic concentration of a-amylase determined by IFCC reference method at 37°C, IRMM/IFCC-460. EUR 19927 EN. IRMM/IFCC, 2001.        [ Links ]