TOXICOLOGÍA

Alteraciones bioquímicas en individuos expuestos al arsénico en el agua de bebida en Tucumán, Argentina*

Biochemical alterations in individuals consuming high levels of arsenic in drinking water in Tucuman, Argentina

Analía Soria de González¹, Rosa Silvina Guber², Mateo Martínez³, Nilda Arias², Liliana Tefaha³, Noemí Sandoval², Marta Fernández², Roxana Toledo³

1. Doctora en Bioquímica
2. Bioquímica
3. Médico

* Laboratorio de Patología Molecular (LAPAM). Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Universidad Nacional de Tucumán. Hospital Centro de Salud "Zenón Santillán". Av. Avellaneda 750. San Miguel de Tucumán. CP: 4000. Tucumán. Argentina. Teléfono: 54-381-4222392.

Resumen

El objetivo de esta investigación fue evaluar los niveles del ácido siálico (S) y enzimas hepáticas en individuos que consumieron agua con arsénico (As) relacionándolos con la presencia ("I con H") o no de hepatomegalia ("I sin H"). Se incluyeron 200 individuos, 85 correspondieron al Grupo Control (GC), 32 "I con H" y 83 "I sin H" quienes habían consumido agua con niveles mayores a 0,01 mg/L. Se les tomó una muestra de sangre venosa y se les realizó el dosaje del S y de las enzimas alaninaninotransferasa (ALT), aspartatoaminotransferasa (AST), fosfatasa alcalina (FAL), gamma glutamil transferasa (GGT), bilirrubina directa (BD) y total (BT), lactato deshidrogenasa (LDH) y 5' nucleotidasa (5'Nu). En los individuos que consumieron agua contaminada se encontró un aumento de los niveles del S. En el grupo "I con H", la FAL, la GGT y la LDH se encontraron aumentadas. En el grupo "I sin H", la GGT y la LDH tuvieron niveles elevados. En los individuos expuestos al As, no se encontraron alteraciones en los otros parámetros bioquímicos estudiados y la prevalencia de hepatomegalia no fue significativa. Los cambios bioquímicos encontrados fueron compatibles con la presencia de un patrón colestásico. Estos datos muestran que la concentración del S sérico podría servir como un indicador de exposición al arsénico que podría ser utilizado en forma conjunta con otros marcadores.

Palabras clave: Arsénico; Agua; Ácido siálico; Enzimas hepáticas; Tucumán; Argentina

Summary

The aim of this study was to investígate the relationship between the levels of serum sialic acid (S) and hepatic enzymes in individuáis who drink As contaminated water. Two hundred individuáis were selected: 85 were the control group, 32 presented hepatomegaly (I with H) and 83 did not present hepatomegaly (I without H) who had consumed drinking water containing As levels higher than O.Ol mg/L. Blood samples were collected for the determination of S and hepatic enzymes in serum: alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (FAL), gamma glutamil transpeptidase (GGT), direct (BD) and total bilirrubin (BT), lactate deshydrogenase (LDH) and 5'nucleotldase (5'Nu). The populatlon exposed to As in drinking water presented high levels of S, FAL, GGT, LDH and GGT, LDH were increased in I with H and I without H respectively. No significant changes were observed in the other parameters studied. Prevalence of hepatomegaly was not significantly higher and the hepatic biochemical changes were related with the presence of cholestasis in As-exposed people. These data show that people with high As level intake would have an increased sialoprotein replacement which could be an marker with other one of the alterations caused by arsenic.

Key words: Arsenic; Water; Sialic acid; Hepatic enzymes; Tucumán; Argentina

Introducción

La contaminación de agua provocada por arsénico (As) es un serio problema de salud pública de importancia a nivel mundial. El As absorbido en su forma inorgánica es sometido a biometilación hepática, mediante metiltransferasas, a la forma de ácido monometilarsónico (MMAs) y ácido dimetilarsínico (DMAs). Aproximadamente el 50% de lo ingerido puede ser eliminado principalmente por la orina en 3 a 5 días y una pequeña cantidad lo hace por las heces, bilis, sudor, células descamadas, pelo y leche (1). La forma trivalente del DMAs es el metabolito urinario principal; representa el 49% del As urinario total, seguido por la forma pentavalente del DMAs (23,7%) (2). La exposición a aguas arsenicales causa un conjunto de manifestaciones que afectan a casi todos los órganos. Los cambios en piel son una característica común, ya que el As se deposita en tejidos ricos en queratina, siendo los más comunes la hiperpigmentación e hiperqueratosis palmoplantar. El comienzo de los síntomas puede ocurrir a partir de los 5 años de exposición y las lesiones malignizarse, con un período de latencia que puede ser de décadas. La exposición crónica al As causa, entre otras patologías, injuria miocárdica, arritmias cardíacas y enfermedad vascular periférica, posible causa de gangrenas en las piernas de los individuos expuestos. El hallazgo neurológico más frecuente es una neuropatía periférica. Estudios epidemiológicos en poblaciones que consumen agua de bebida con niveles elevados de As han establecido que existe un riesgo elevado de cáncer del tracto urinario, pulmón, piel, colon e hígado (1) (3). El hígado es el órgano responsable de la metabolización del As, habiéndose documentado en el examen histopatológico fibrosis periportal asociada con leve a moderado agrandamiento del tracto portal e infiltración de células inflamatorias (4) (5). Asimismo, se demostró hipertrofia de vénulas intrahepáticas que resulta en obstrucción del flujo venoso portal, aumento de la presión esplénica e hiperesplenismo (5). Al examen físico los pacientes afectados presentaron hepatomegalia y la incidencia tuvo una relación lineal proporcional al aumento de la exposición al As en el agua de bebida en ambos sexos (4).
Las lesiones hepáticas en animales de experimentación expuestos a As inorgánico en el agua de bebida, incluyen balonización de mitocondrias y alteración de la función hepática (5), observándose infiltración grasa del hígado en ratones expuestos 12 meses, la que evolucionó a fibrosis hepática luego de 15 meses (6). Como consecuencia de la exposición crónica al As⁺³ y As⁺⁵ se observaron alteraciones degenerativas, áreas de necrosis focal y un incremento en la actividad de la caspasa-3 hepática involucrada en la apoptosis, lo cual indicaría injuria hepática (7). Asimismo, se ha demostrado que la exposición en útero al As inorgánico en el período de gestación de los ratones induce, en la edad adulta de las crías, tumores de hígado (8) (9). En ratones expuestos a 0,25 mg/L de As⁺³ en agua de bebida durante 5 semanas se observó un cambio en la remodelación vascular del hígado, con un incremento de células endoteliales sinusoidales capilarizadas, sin cambios en la estructura y morfología del hígado (10). Las neoplasias primarias hepáticas del tipo hemangioendotelioma fueron referidas por Zaldivar et al, que describieron el caso de un hombre de 22 años procedente de Antofagasta con lesiones cutáneas asociadas de arsenicismo provocado por ingestión de aguas contaminadas durante 12 años (11). El ácido siálico (S) es el derivado acetilado del ácido neuramínico. Se encuentra unido a los residuos de hidratos de carbono de las cadenas de glicoproteínas y glicolípidos. Entre las principales funciones se puede mencionar la estabilización de las glicoproteínas de la membrana celular, la intervención en la interacción célula-célula y en la transformación maligna (12). La concentración de S aumenta en distintos procesos patológicos por diferentes mecanismos. Es un marcador reactante de fase aguda. Se encontró aumento de los niveles séricos del S en patologías como infarto de miocardio, diabetes, cáncer y osteoartritis (13-16). El objetivo de este trabajo fue evaluar los niveles séricos del S y de enzimas hepáticas en individuos que consumen agua de bebida con niveles elevados de As relacionándolos con la presencia, o no, de hepatomegalia.

Materiales y Métodos

POBLACIÓN ESTUDIADA

Este trabajo es un estudio descriptivo de corte transversal de carácter exploratorio. Los grupos poblacionales seleccionados correspondieron a zonas rurales pertenecientes a los departamentos Graneros y Leales ubicados al este de la provincia de Tucumán (República Argentina). En esas localidades, la Universidad Nacional de Tucumán (UNT) posee unidades docente-asistenciales, pertenecientes a la Facultad de Medicina, denominadas Pasantías Rurales. Previo consentimiento escrito, se seleccionaron 208 individuos de ambos sexos, mayores de edad y que habitaban las zonas en forma permanente por más de 10 años.
A todas las personas se les realizó un examen físico por un profesional médico y se confeccionó una historia clínica completa de cada paciente, habiéndose evaluado los signos dermatológicos de arsenicismo. Los datos fueron recolectados en fichas en donde fueron consignados los datos demográficos y personales, como la historia de permanencia en el lugar, consumo de tabaco y alcohol, o de otras drogas (medicamentos, hierbas naturales etc.), historia familiar de cáncer, enfermedades previas, el tiempo de exposición al As y el tipo de provisión de agua para consumo. Los criterios de exclusión fueron establecidos para todos aquellos individuos que consumían hierbas medicinales, alcohol en exceso y cualquier otra patología hepática de otra etiología.

DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN EL AGUA DE BEBIDA

De los pozos domiciliarios de donde consumían habitualmente agua de bebida los sujetos seleccionados, se recolectaron muestras de agua en recipientes de polietileno escrupulosamente limpios y se las remitió al Laboratorio de Patología Molecular de la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia de la UNT. La determinación de As se efectuó por el método colorimétrico cuantitativo descripto por Vasaky Sedivek en 1952 (17), AQAssay (GTlab). Dicho método consiste en una reducción del As inorgánico a arsina y la reacción de la misma con una solución pirídica de dietilditiocarbamato de plata, generando un complejo rojizo, cuya intensidad de color fue medida espectrofotométricamente a 530 nm.
Se procesaron simultáneamente un blanco con 50 mL de agua destilada desmineralizada, un estándar con 0,1 mg/L de As y 50 mL de las muestras a analizar.
La lectura se realizó en un espectrofotómetro Metrolab 1700 (Buenos Aires, Argentina) a530nm (ancho de banda 1 cm).

DETERMINACIONES EN MATERIAL BIOLÓGICO

A todos los pacientes se les realizó serología para los virus de la hepatitis B y C, y por esta causa no fueron incluidos en este estudio 8 individuos. A todas las personas se les tomó una muestra de sangre venosa que se colocó en tubos libres de anticoagulante y se dejó coagular espontáneamente 30 min a 37 °C separándose el suero por centrifugación.
Los dosajes se realizaron según correspondía en suero fresco o conservado a -20 °C hasta su uso.
La cuantificación de S sérico se realizó empleando el método del ácido tiobarbitúrico de Warren modificado por Ponnio el al (18). El método consiste en una hidrólisis acida a 80 °C durante 60 min, posterior oxidación con metaperiodato de sodio en medio fosfórico, posterior reacción con meta arsenito de sodio en medio sulfúrico y ácido tiobarbitúrico 42 mmol/L con calentamiento en baño de agua hirviendo y, finalmente, extracción con ciclohexanona.
La lectura se hizo a 549 y 513 nm mediante el espectrofotómetro antes mencionado. Se calcularon diferencias de absorbancias y las concentraciones de las muestras fueron extrapoladas en una curva de calibración realizada con concentraciones de 5 hasta 125 mg/L del ácido N-acetilneuramínico.
La alaninaminotransferasa (ALT) y la aspartatoamino-transferasa (AST) se determinaron mediante un método colorimétrico "Transammasas 200" (Wiener Lab.) en el que se cataliza el sustrato específico para cada una de ellas. En ambas reacciones el piruvato formado reacciona con la 2-4 dinitrofenilhidracina produciendo en medio alcalino, un compuesto coloreado que se mide a 505 nm.
El dosaje de la fosfatasa alcalina (FAL) se realizó empleando el método colorimétrico optimizado. La FAL desdobla al fenilfosfato de sodio en medio alcalino tamponado con aminometil propanol liberando fenol, que reacciona con 4-aminoantipirina (y ferricianuro como agente oxidante), generando un color directamente proporcional a la actividad enzimática que se mide a 520 nm.
La actividad de gamma glutamil transferasa (GGT) se cuantificó por colorimetría en donde la p-nitroanilina liberada a partir del sustrato específico se diazota y copula con un compuesto fenólico dando un producto coloreado que se lee a 500 nm (Wiener Lab).
La determinación de bilirrubina directa (BD) y total (BT) se basa en un método colorimétrico, en su reacción con ácido sulfanílico diazotado, produciendo un pigmento rojo-violáceo que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm (Wiener Lab).
La lactato deshidrogenasa (LDH) se determinó por el método optimizado, el cual usa como sustrato NADH y piruvato, se calcula la diferencia promedio de absorbancia por minuto a 340 nm y se obtiene la concentración al multiplicar por el factor correspondiente (Wiener Lab).
La 5' nucleotidasa (5' Nu) cataliza la desfosforilación de fosfonucleósidos con grupos fosfato en posición Cg del anillo de ribosa, con máxima actividad a pH 7,5. A este pH, el AMP también es hidrolizado inespecíficamente por la FAL. La 5' Nu es inhibida selectivamente por iones Ni²⁺- La diferencia de medidas entre el fosfato liberado en presencia y en ausencia de Ni²⁺ (determinado con equipo "Fosfatemia" (Wiener Lab), es proporcional a la actividad de 5' Nu. Los datos fueron expresados como promedio ± desviación estándar.
El análisis estadístico fue realizado con la Prueba de Student. Con el propósito de establecer la especificidad, sensibilidad y el punto de corte del S se realizó el análisis mediante la curva ROC (Receiver Opemting Charocteristics). El valor de p menor a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Se utilizó el sistema informático SSPS 9.0.

Resultados

Los resultados se organizaron de acuerdo con los valores obtenidos, según superaran o no el nivel sugerido por la OMS y por el Código Alimentario Argentino (0,01 mg/L). De la población estudiada 85 individuos consumían agua con niveles permitidos de As (GC) cuya edad era de 52,07± 19,29 años (x ± DE). Se analizaron los individuos que consumieron niveles elevados de As en el agua de bebida, de acuerdo con las manifestaciones clínicas hepáticas, específicamente si presentaban ("I con H") o no presentaban hepatomegalia ("I sin H"). Se estudiaron 32 individuos "I con H" de 57,92± 13,67 años (x ± DE) y 83 "I sin H" de 43,17± 16,55 años (x ± DE).
La concentración promedio de As en el agua de bebida consumida por los grupos de "I con H" y de "I sin H" fueron similares. El rango de concentración para los "I con H" fue de 0,026 a 0,820 mg/L y para los "I sin H" fue de 0,016 a 0,750 mg/L. El 29,7% de los "I con H" y el 25,2% de los "I sin H" presentaron síntomas de exposición crónica al As en la piel, los que incluyeron cambios en la pigmentación, hiperqueratosis e hiperhidrosis palmo-plantar.
La concentración promedio del S sérico en el GC (con el objeto de establecer los valores de referencia) fue de 658,5± 133,7 mg/L en las mujeres y de 650,2± 141,9 mg/L en los varones.
Considerando la edad de los individuos, se los dividió en tres grupos según la edad: menores de 40, de 41 a 50 y mayores de 50 años. Los valores encontrados fueron de 675,55± 117,9, 616,25± 119,4 y 653,2 ± 148,8 mg/L, respectivamente. Los valores de referencia del S no se modifican por el sexo, ni la edad de los sujetos estudiados, por lo que se consideró a todos como un único grupo. Bajo ese concepto, el grupo de "I con H" y el de "I sin H" poseían valores mayores estadísticamente significativos que los del GC. No se encontraron diferencias significativas entre los individuos expuestos al As con o sin hepatomegalia (Tabla 1) (Figura 1).

Tabla I. Niveles séricos de los parámetros bioquímicos analizados en los grupos estudiados.

Figura 1. Niveles séricos de Acido Siálico (S) en los grupos estudiados. GC: grupo control. "I con H": individuos con hepatomegalia que consumen niveles de As mayores a 0,01 mg/L. "I sin H": individuos sin hepatomegalia que consumen niveles de As mayores a 0,01 mg/L

Se realizó el análisis mediante la curva ROC para establecer la aplicación clínica del S como indicador de exposición a niveles elevados de As en el agua de bebida. Se observó que el área bajo la curva del S en individuos que consumieron e individuos que no consumieron agua contaminada con As fue de 0,765 (Intervalo de confianza 95% entre 0,693 y 0,857). Aproximadamente el 77% de los individuos que consumieron agua contaminada presentaron valores elevados del S sérico comparado con el grupo control. Basados en la curva ROC para un valor de corte de 653 mg/L la sensibilidad y especificidad fue de 75% y 51%, respectivamente (Fig. 2).

Figura 2. Curva ROC calculada para los datos de Ácido Siálico (S) en individuos que consumen niveles de As mayores a 0,01 mg/L.

Cuando se analizaron las enzimas hepáticas se encontró que en el grupo de "I con H" la FAL, la GGT y la LDH estaban aumentadas respecto al GC siendo las diferencias estadísticamente significativas en el caso de la GGT, habiéndose analizado los datos en mujeres y varones debido a que los valores de referencia difieren según el sexo (Tabla 1) (Figura 3) (Figura 4) (Figura 5) (Figura 6).

Figura 3. Niveles séricos de fosfatasa alcalina (FAL) en los grupos estudiados. GC: grupo control. "I con H": individuos con hepatomegalia que consumen niveles de As mayores a 0,01 mg/L. "I sin H": individuos sin hepatomegalia que consumen niveles de As mayores a 0,01 mg/L.

Figura 4. Niveles séricos de gamma glutamil transferasa (GGT) en mujeres según los grupos estudiados. GC: grupo control. "I con H": individuos con hepatomegalia que consumen niveles de As mayores a 0,01 mg/L. "I sin H": individuos sin hepatomegalia que consumen niveles de As mayores a 0,01 mg/L.

Figura 5. Niveles séricos de gamma glutamil transferasa (GGT) en varones según los grupos estudiados. GC: grupo control. "I con H": individuos con hepatomegalia que consumen niveles de As mayores a 0,01 mg/L. "I sin H": individuos sin hepatomegalia que consumen niveles de As mayores a 0,01 mg/L.

Figura 6. Niveles séricos de lactato deshidrogenasa (LDH) en los grupos estudiados. GC: grupo control. "I con H": individuos con hepatomegalia que consumen niveles de As mayores a 0,01 mg/L. "I sin H": individuos sin hepatomegalia que consumen niveles de As mayores a 0,01 mg/L.

Los niveles séricos de la 5'Nu, AST, ALT, BT y BD fueron similares a los encontrados en el GC (Tabla I). En las Figuras 4, 5 y 6 se ilustran en diagrama de caja los valores séricos de GGT y LDH en el grupo de "I sin H", observándose niveles significativamente elevados de ambas enzimas.
En la Tabla 1 se muestran los resultados para FAL, 5'Nu, AST, ALT, BT, BD, no habiéndose encontrado diferencias estadísticamente significativas cuando se compararon con el GC. No hubo diferencias significativas en los niveles séricos de los parámetros analizados entre el grupo de "I con H" y el grupo de "I sin H".

Discusión y Conclusiones

El consumo de agua de bebida contaminada con As es un grave problema de salud pública a nivel mundial. En la República Argentina existe una amplia zona con concentraciones naturalmente elevadas de As en el agua subterránea. La zona este de la provincia de Tucumán presenta aquel problema, por lo que este estudio se realizó con la participación de individuos que residen en el área de riesgo y consumieron agua de bebida de pozos domiciliarios. El análisis de la concentración de As en las muestras recolectadas confirmó que es un serio problema en esta zona ya que aproximadamente el 60% de las muestras exceden los niveles permitidos de ese elemento.
Del total de individuos expuestos, el 27,8% y el 72,2% correspondieron al grupo de "I con H" y a "I sin H", respectivamente. Las manifestaciones cutáneas en ambos grupos fueron similares (29,7% y 25,2% respectivamente) . No se encontraron diferencias en los niveles de concentración de As en los pozos domiciliarios de los individuos que presentaron o no hepatomegalia. La prevalencia de hepatomegalia fue inferior a la encontrada por Santra et al en la India en donde se documentó que un 76,6% de los individuos expuestos la presentaron (19).
Las diferencias en las características clínicas que se encontraron en distintos grupos poblacionales de áreas geográficas diferentes, podría ser explicada por el polimorfismo genético que regula las enzimas involucradas en el mecanismo de biotransformación del As (20) (21). El S es un marcador para pacientes con distintos tipos de cáncer, en patologías no malignas que involucran procesos inflamatorios y otros procesos como diabetes e infarto de miocardio (14) (18) (22). En este estudio se demostró que el S sérico es un marcador que tiene una alta sensibilidad para diagnosticar individuos expuestos a niveles elevados de As en el agua de bebida. Sin embargo, es necesario aumentar la especificidad para disminuir el número de falsos positivos, por lo que se propone el uso combinado con otros marcadores de exposición, como la concentración de As en orina. Los niveles del S sérico se encontraron significativamente aumentados en los grupos de "I con H" y de "I sin H" cuando se compararon con el grupo control. No se observaron diferencias significativas en la expresión sérica entre los grupos expuestos, por lo que la presencia de hepatomegalia no sería la etiología de la elevación observada. La exposición crónica al As podría considerarse como la causa que regularía la expresión aumentada del S en el suero de los individuos estudiados. El envenenamiento crónico con As provoca una enfermedad multisistémica, que comúnmente causa cambios dermatológicos, injuria miocárdica, cardiomiopatías, enfermedad vascular periférica, neuropatías periféricas, enfermedades respiratorias (1), y su consumo prolongado se relaciona con distintos tipos de cáncer como por ejemplo, de piel (23), pulmón, riñon (24) (25), hígado (26), vejiga (27) (28). En estos procesos pueden activarse sialiltransferasas, las cuales podrían ser las responsables del aumento de la concentración del S en el suero de los individuos expuestos. Asimismo, al ser una proteína reactante de fase aguda, los procesos inflamatorios causados por la ingestión continua de As podrían explicar los hallazgos encontrados (29). Con el propósito de estudiar la acción hepatotóxica del As se analizaron los niveles séricos de RAL, GGT, 5' Nu, BT y BD, como marcadores de injuria colestásica y AST, ALT, LDH, como marcadores de injuria hepatocelular. En los "I con H" se encontró un aumento no significativo de la FAL y LDH, acompañado de un aumento significativo de GGT, no observándose cambios en las otras enzimas analizadas. En los "I sin H" se encontró un aumento significativo de las enzimas GGT y LDH no encontrándose alteraciones en las otras enzimas estudiadas. El aumento significativo de la GGT en ambos grupos, cuya localización es microsomal, podría explicarse por la inducción producida por el As. Su aumento en forma conjunta con la FAL en los "I con H" definiría un cuadro clínico compatible con colestasis, con severidad menos marcada en los "I sin H". Estos hallazgos son similares a los encontrados por Nabi et al en pacientes expuestos crónicamente al As en el agua de bebida en Bangladesh, donde se encontraron cambios significativos en los parámetros bioquímicos (30). Hernández-Zavala et al. estudiaron la función hepática en individuos expuestos al consumo crónico de agua contaminada con As y observaron un aumento de BD y de FAL sérica cuya actividad fue relacionada con la concentración total de As en orina sugiriendo un patrón de colestasis (31). En conclusión, en este trabajo se demostró que en individuos expuestos a consumo crónico de agua de bebida contaminada con As, la prevalencia de hepatomegalia no fue una manifestación clínica significativa. La concentración del S sérico podría servir como un indicador de exposición que podría ser utilizado en forma conjunta con otros marcadores. Los cambios bioquímicos encontrados son compatibles con la presencia de un patrón colestásico. Según documentos previos, hay un número importante de personas expuestas a niveles elevados de As en el agua de bebida en el este de la provincia de Tucumán. Esta problemática es de alta importancia socio-sanitaria, por su magnitud, por su severidad real y potencial, y por su estabilidad. En el presente trabajo se aportan datos necesarios para establecer las causas de morbilidad en los individuos expuestos pertenecientes a zonas deprimidas con una inadecuada provisión de agua potable.

CORRESPONDENCIA
DRA. ANALÍA SORIA DE GONZÁLEZ
Santiago 1316-PB
4000 SAN MIGUEL DE TUCUMÁN, Tucumán, Argentina
E-mail: gonzalez_stojan@uolsinectis.com.ar

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Aceptado para su publicación el 23 de junio de 2009