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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. v.43 n.4 La Plata oct./dic. 2009

 

INMUNOLOGÍA

Estudio de la captación de ácido hialurónico por Ascaris lumbricoides

Study of hyaluronic acid capture by Ascaris lumbricoides

Patricia Ponce de León1 *, Patricia Foresto2 **, Juana Valverde2 **

1. Bioquímica
2. Doctora en Ciencias Bioquímicas

* Laboratorio de Parasitología. Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas. UNR. Santa Fe. Argentina.
** Laboratorio de Inmunohematología, Hemorrelogía e Inmunogenética. Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas. UNR. Santa Fe. Argentina.

Resumen

El ácido hialurónico (AH) tiene importantes funciones en la inmunidad. En experiencias previas se demostró que extractos de adultos de A. lumbricoides y concentrados larvarios, tienen capacidad de unión a AH. El objetivo de este trabajo fue estudiar la captación de AH por este helminto. Se trabajó con tres extractos del parásito adulto ([EA]B,C,D) y 3 concentrados de larvas ([CLAL1]: 1100 a 1200 larvas/ mL; [CLAL2]: 400 a 600 larvas/ mL y [CLAL3]: 100 a 200 larvas/ mL). Se empleó la técnica modificada de Inhibición de la Adhesión para detección del Receptor CD44 soluble de hialuronato en suero humano. Se definió CexpAdhEAH como el cociente entre los eritrocitos adheridos por el AH en presencia y ausencia del parásito y se definió IexpCPAH, como la cantidad de eritrocitos que se dejaron de adherir debido a la captación de AH por el parásito, referido al número total de eritrocitos. Los resultados mostraron diferencias significativas en CexpAdhEAH y en IexpCPAH, por efecto de la concentración larvaria y del [EA]. Las medias aritméticas de CexpAdhEAH y de IexpCPAH para los concentrados larvarios fueron 0,636 y 0,21 ([CLAL1]); 0,819 y 0,068 ([CLAL2]); 0,97 y 0,013 ([CLAL3]). Las medianas de CexpAdhEAH y de IexpCPAH para los extractos fueron [EA]C 0,275 y 0,4; [EA]B: 0,20 y 0,43; [EA]D: 0,075 y 0,495. La experiencia permitiría suponer que el parásito puede captar AH para interferir en la respuesta inmune del hospedador.

Palabras clave: Ascaris lumbricoides; Ácido hialurónico; Captación

Summary

Hyaluronan Acid (HA) has important functions in immunity. Previous experiences have shown that A. lumbricoides’s extracts of adult specimens and larval concentrates have hyaluronan binding capacity. The aim of this study was to analyse the HA capture by this helminth. Three extracts of adult specimens ([AE]B,C,D) and 3 larval concentrates ([ALLC1]: 1100 to 1200 larvae/ mL; [ALLC2]: 400 to 600 larvae/ mL and [ALLC3]: 100 to 200 larvae/ mL) were studied. The modified test of serum soluble CD44 Detection by Aggregation Inhibition was used. CexpAdhEAH was defined as the quotient between erythrocytes adhered by the HA in presence and in absence of the parasite, and IexpCPAH was defined as the amount of erythrocytes that stopped adhering due to the HA capture by the parasite in relation to the total number of erythrocytes. The results showed significant differences in CexpAdhEAH and IexpCPAH as the result of larvae concentration and of the extracts. The arithmetic means of CexpAdhEAH and IexpCPAH for the larvae were 0.636 and 0.21 ([ALLC1]); 0.819 and 0.068 ([ALLC2]); 0.97 and 0.013 ([ALLC3]). Medians of CexpAdhEAH and IexpCPAH for the extracts were [EA]C:0.275 and 0.4; [EA]B: 0.20 and 0.43; [EA]D: 0.075 and 0.495. From the experience, it could be assumed that the parasite can capture the HA to interfere in the host’s immune response.

Keywords: Ascaris lumbricoides; Hyaluronic acid; Capture

Introducción

El ácido hialurónico (AH) es un glicosaminoglicano constituido por residuos alternantes de ácido glucurónico y N-acetilglucosamina. No tiene una forma definida en el espacio, sino que se extiende aleatoriamente tendiendo a ocupar un volumen muy grande debido a la repulsión electrostática de los grupos carboxilo del ácido urónico (1).
El AH no sólo representa el componente fundamental de la matriz extracelular de diversos órganos, tejidos, y articulaciones (2), sino que también participa activamente en su estabilización. El Inter –Alfa –Inhibidor (IAI) es un complejo proteico sanguíneo con actividad antiinflamatoria formado por una cadena liviana de bikunina (ITIL) y dos cadenas pesadas de interinhibidor (ITIHs). Tiene actividad anti-proteasa y por eso ejerce efectos anti-inflamatorios bloqueando la actividad biológica de enzimas plasmáticas, así como las liberadas por inmunocitos tipo neutrofilos. ITIHs pueden ser transferidas desde el IAI a moléculas de AH para unirse covalentemente y formar complejos AH-ITIHs en la matriz extracelular que aseguran su estabilidad (3)
El AH tiene también un rol importante en la respuesta inmune. Es el constituyente principal del tejido conjuntivo, que es una de las barreras mecánicas naturales (4). Su viscosidad ayuda a prevenir el pasaje de virus y bacterias por la zona pericelular (5)(6). Es un reconocido estimulador del proceso inflamatorio que tiene propiedades antioxidantes, capacidad para eliminar radicales libres y actúa como barrera de degradación tisular (7-9). Asimismo, puede activar células dendríticas por TLR4 (Receptor Símil Toll 4) (10) y es ligando de moléculas de adhesión fundamentales en la respuesta inmune (11).
Se ha comunicado que a pesar de que los mecanismos celulares de muchos procesos infecciosos no se conocen con exactitud, podrían involucrar a los glicoconjugados del parásito y del hospedador (12).
Debido al amplio espectro de funciones biológicas del AH y a las múltiples estrategias de evasión parasitaria de la respuesta inmune, en experiencias previas se investigó si extractos preparados a partir de la cutícula de ejemplares adultos de A. lumbricoides podían unir AH. Los resultados demostraron que el 63,89% de los 36 extractos estudiados tenían capacidad de unión a AH, indicando la existencia de un receptor en el nematodo con capacidad de unión a este heteropolisacárido (13).
Como la quitina es otro polisacárido, indispensable para el desarrollo de las cubiertas de los helmintos, y se ha demostrado similitud entre los mecanismos biosintéticos de AH y de quitina (14), se consideró la posibilidad de que los receptores para quitina fueran los que captaban AH. Por ese motivo, se realizaron experiencias con larvas de A. lumbricoides, ya que carecen de quitina, donde se demostró que los estadios larvales también tienen capacidad de unión de AH (15).
Las investigaciones realizadas demuestran que A. lumbricoides capta AH, lo que sugeriría una competencia entre los receptores del parásito y el hospedador por la unión a este ligando. El objetivo de esta experiencia fue estudiar la captación de AH por este nematodo.

Materiales y Métodos

MUESTRAS

Extractos de A. lumbricoides ([EA]): Se trabajó con tres extractos parasitarios ([EA] B, [EA] C y [EA] D) obtenidos a partir de la remoción de la cutícula de ejemplares adultos y ruptura mecánica refrigerada (16). Los [EA] fueron seleccionados porque habían unido AH en las experiencias previas (13).
Concentrados de larvas ([CLAL]): Se utilizaron 3 concentrados de larvas (L1/ L2) obtenidos de la embrionación in vitro (17) y posterior eclosión de huevos de A. lumbricoides (18). Las larvas fueron recolectadas a 37 ºC por el método de Baermann-Moraes (19) en buffer fosfato. Completada la recolección fueron concentradas por centrifugación y se procedió al recuento de las mismas: [CLAL1] tenía 1100 a 1200 larvas/mL; [CLAL2] 400 a 600 larvas / mL y [CLAL3] 100 a 200 larvas / mL.

MÉTODO

El método empleado fue una modificación de la técnica de Inhibición de la Agregación por Adhesión para detección del Receptor CD44 soluble de hialuronato en suero humano (20).
Para ello se utilizó una suspensión al 2% de eritrocitos Grupo O en medio enzimático de bromelina (15 min a 37 ºC), que es el mismo sistema revelador descrito por la técnica original (20). Se separó el plasma autólogo (PA) correspondiente a dichos hematíes.
Se preparó una suspensión de AH 1/128 (20) y una suspensión en partes iguales de AH 1/64 y [CLAL] o [EA], según correspondió (13)(15), que se dejó en contacto 30 minutos a 4 ºC, a los fines de hacer posible la unión del ácido hialurónico con el extracto parasitario o las larvas.
A continuación se prepararon 3 tubos y se dejaron 1 hora a 4 ºC.

Tubo 1: 50 µL de PA + 50 µL de PBS (buffer fosfato pH 7,4) + 50 µL GR 2%
Tubo 2: 50 µL de PA + 50 µL de AH 1/128 + 50 µL GR 2%
Tubo 3: 50 µL de PA + 50 µL de AH- [CLAL] / [EA] + 50 µL GR 2%

Pasado este tiempo se procedió al conteo microscópico de eritrocitos libres, en una cámara de Neubahuer.
El conteo del Tubo 1 correspondió al Total de células libres (T). Los Tubos 2 (AH 1/128) y 3 (AH-[CLAL]/ [EA]), permitieron la visualización microscópica de los eritrocitos adheridos por agregación por efecto del AH, y en ellos se contaron solamente los hematíes libres. Los conteos de ambos tubos indicaron el número de glóbulos que no fueron adheridos en las condiciones experimentales. Todos los conteos se hicieron por duplicado y se consideró el valor promedio.
En el Tubo 2 (donde se colocó AH) el valor esperado de eritrocitos libres debía ser menor que en el Tubo 3 (donde se agregó la mezcla AH- [CLAL] / [EA]), pues la captación de AH por el parásito dejaría una menor cantidad de AH libre, lo que se traduciría en una menor adhesión eritrocitaria y un mayor número de células rojas libres.
La diferencia de conteo de células libres del Tubo 1 con respecto a los Tubos 2 y 3, indicó la cantidad de eritrocitos que se adhirieron por agregación en ambos casos.

T – AH = glóbulos rojos adheridos por la acción del AH (GrAdhAH)
T- [AH-CLAL] / [EA] = glóbulos rojos adheridos por el remanente de AH que no fue captado por el parásito (GrAdhRAH)

Se definió el Coeficiente Experimental de Adhesión Eritrocitaria por Ácido Hialurónico, como el cociente entre los glóbulos rojos adheridos cuando el AH se pone en contacto con el parásito y los glóbulos rojos adheridos cuando el AH está en ausencia del parásito, en las mismas condiciones experimentales. Este coeficiente indica el porcentaje de células que se adhieren después de la captación de AH por el parásito en relación a las adheridas por el AH total adicionado.

Cuando el parásito no capta AH, el coeficiente es igual o cercano a 1, porque habrá una cantidad igual o similar de células adheridas en los Tubos 2 y 3. Por el contrario, el coeficiente será menor, a mayor cantidad de AH captado por A. lumbricoides.
Se define el Índice Experimental de Captación parasitaria de AH como la cantidad de eritrocitos que se dejaron de adherir porque el parásito captó AH, referido al número total de eritrocitos, en las condiciones experimentales definidas. Este índice es una medida del consumo de AH por el parásito, en las condiciones experimentales establecidas, y se expresa como la cantidad de eritrocitos que se dejaron de adherir por acción del parásito en relación a la cantidad total de glóbulos rojos.

Cuando mayor cantidad de AH capta el parásito, menor será el AH remanente, y menor la cantidad de glóbulos rojos adheridos (Tubo 3), por lo que este índice aumenta.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOS

Para el análisis de ambas variables (CexpAdhEAH e IexpCPAH) empleando los concentrados larvarios, se utilizó un análisis de la variancia a un criterio de clasificación y las comparaciones múltiples de Tukey, debido a que se verificó el cumplimiento de los supuestos exigidos por la técnica estadística (21).
Para el estudio del efecto de los distintos [EA] en ambas variables (CexpAdhEAH e IexpCPAH) se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis y las comparaciones múltiples de Dunn (21).

Resultados

[CLAL1] (1000 a 1200 larvas / mL)

Se hicieron las experiencias de captación de AH por las larvas utilizando 10 suspensiones globulares.
Los valores de CexpAdhEAH indicaron que después de que las larvas captaron AH (Tubo 3), el remanente de este heteropolisacárido sólo pudo adherir el 64% de los eritrocitos que se habían adherido en ausencia del parásito en las mismas condiciones experimentales (Tubo 2). La media aritmética de CexpAdhEAH fue 0,636 con una desviación estándar de 0,0675278.
En las condiciones experimentales definidas, los valores obtenidos de IexpCPAH indicaron que las larvas captaron el AH necesario para adherir alrededor del 21% de los eritrocitos totales, siendo la media aritmética 0,211 y la desviación estandar 0,0268535. Los resultados se muestran en la Tabla I.

Tabla I. Estudio de la captación de ácido hialurónico por los Concentrados Larvales de A. lumbricoides.

[CLAL2] (400 a 600 larvas / mL)

El estudio de la captación de AH por las larvas se realizó con 13 suspensiones globulares.
Los valores de CexpAdhEAH fueron, tal como se esperaba, más altos que en el caso anterior pues la concentración de larvas era menor y por lo tanto también más baja la cantidad de AH captado por ellas. El rango de los valores de CexpAdhEAH estuvo comprendido entre 0,70 y 0,91 con una media aritmética de 0,819231 y una desviación estándar de 0,06788.
En las condiciones experimentales definidas en el Tubo 3 se adhirieron por agregación aproximadamente el 82% de los eritrocitos adheridos en ausencia del parásito (Tubo 2).
La concentración de larvas de [CLAL2] captó el AH necesario para adherir un valor = al 10% de los eritrocitos totales (la media de los valores de IexpC PAH fue 0,0684615 y la desviación estándar 0,0199358)
Los resultados se muestran en la Tabla I.

[CLAL3] (100 a 200 larvas / mL)

Se calcularon los valores de CexpAdhE AH correspondientes a 4 suspensiones globulares para [CLAL3]. Se observó que los coeficientes fueron = 0,96, indicando que el consumo de AH por las larvas, era muy pequeño, tal como se esperaba debido a la concentración larvaria utilizada. Los eritrocitos adheridos en el Tubo 3 (mezcla AH- [CLAL3]) fueron el 96-98% de los que se habían adherido en el Tubo 2 (AH). La media aritmética de los valores de CexpAdhE AH fue 0,9725 con una desviación estándar de 0,00957427.
Los valores del IexpCPAH indicaron que esta concentración de larvas sólo captaba el AH necesario para adherir aproximadamente el 1% de los eritrocitos totales (la media aritmética fue 0,01325 y la desviación estándar 0,00485627).
Los resultados se muestran en la Tabla I.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se concluye que existen diferencias significativas en CexpAdhEAH por efecto de la concentración de larvas (p<0,0001).
Los valores promedios de CexpAdhEAH para [CLAL1] son significativamente menores que los correspondientes a los otros dos concentrados larvales. El promedio para [CLAL2] es además significativamente menor que para [CLAL3] (p<0,01).
Se concluye que existen diferencias significativas en el promedio de IexpCPAH por efecto de la concentración de larvas (p<0,0001).
Los valores promedios del IexpCPAH para la mayor concentración larvaria son significativamente mayores que los correspondientes a las otras dos concentraciones de larvas, así como también el promedio para la concentración de 400 a 600 larvas /mL es significativamente mayor que para la concentración de 100 a 200 larvas /mL (p<0,01).

[EA]a,b,c

Para estudiar la captación de AH por extractos del parásito adulto, se utilizaron 10 suspensiones eritrocitarias, cada una de las cuales fue ensayada con los 3 [EA].
En experiencias preliminares, se aplicó la técnica de Inhibición de la Agregación por Adhesión para detección del Receptor CD44 soluble de hialuronato en suero humano y se demostró que los tres tenían capacidad de unión de AH.
Los valores de CexpAdhEAH obtenidos mostraron que el [EA] C dejó un remanente de AH después de la captación, que adhería aproximadamente el 28% de los eritrocitos que se habían adherido en ausencia del extracto (el valor de la mediana fue 0,275 y el rango intercuartil 0,05). El AH remanente después del contacto con el [EA] B y con el [EA] D adhirió el 20% de los eritrocitos adheridos en el Tubo 2 (mediana 0,2 y rango intercuartil 0,04) y el 7-8% (mediana 0,075 y rango intercuartil 0,06) respectivamente.
Estos coeficientes indicaron que el [EA] D era el que tenía mayor capacidad de unión a AH.
Los valores de la mediana y el rango intercuartil de IexpCPAH fueron 0,4 y 0,07 para [EA] C; 0,43 y 0,04 para [EA] B; 0,495 y 0,06 para [EA] D.
Los resultados se muestran en la Tabla II.

Tabla II. Estudio de la captación de ácido hialurónico por extractos de A. lumbricoides.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se concluye que existen diferencias significativas en el CexpAdhEAH por efecto del extracto parasitario (p<0,0001).
Los valores de CexpAdhEAH para [EA]C son significativamente mayores que los correspondientes a los otros dos, siendo además para el [EA] B significativamente mayores que para el [EA] D (p<0,05).
Se concluye que existen diferencias significativas en el IexpCPAH por efecto del extracto parasitario (p<0,0001).
Los valores de IexpCPAH para [EA] D son significativamente mayores que para los otros dos extractos cuyos valores no difieren entre sí (p<0,05).

Discusión y Conclusiones

El AH participa en varias etapas de la respuesta inmune. En la resistencia natural, para impedir la penetración de gérmenes, participan las barreras mecánicas formadas por la piel, las mucosas (muchas con un epitelio ciliado o vibrátil y el manto de moco que las recubre) y las secreciones, que actúan a modo de lavado y arrastre. Otras defensas más profundas son las diferentes fascias y aponeurosis, y sobre todo, la especial constitución del tejido conjuntivo a manera de espesa malla de ácido hialurónico (4). El AH es simultáneamente componente y estabilizador de la matriz extracelular, con propiedades hidrofílicas, y desempeña un rol importantísimo de génesis, mantenimiento y resolución de la inflamación en la respuesta innata (3).
Por otro lado, se ha comunicado que el AH puede activar células dendríticas a través del TLR4 (Receptor Toll 4) (10). Los TLR son los receptores principalmente involucrados en la activación a nivel intestinal. Si bien las experiencias realizadas indicarían que los TLR no participarían en el reconocimiento de helmintos, tampoco se ha determinado claramente cuál sería el receptor involucrado (22).
Los hialuronatos son componentes sacáridos ligandos de importantes hialuroadherinas y moléculas de adhesión. Entre las primeras se encuentra TSG6 (factor estimulador de necrosis tumoral gen 6) que es una proteína soluble. El grupo de moléculas de adhesión que son receptores de AH, tiene dos miembros, ambos codificados por el gen ras: el CD44 (también denominado Pgp-1, H-CAM, GP90 o HER-MES) y el RHAMM (receptor para la motilidad mediada por hialuronato) (11). CD44 es una glicoproteína transmembrana relacionada con la interacción entre células y matriz extracelular, se expresa en leucocitos, células epiteliales, células gliales, fibroblastos y células musculares. Se la considera una molécula de adhesión, con acción quimiotáctica para linfocitos en el tejido linfoide de las mucosas (placas de Peyer), además se la relaciona a activación leucocitaria, linfopoyesis y metástasis tumoral (11). La proteína RHAMM activa un mecanismo locomotor que permite la adhesión entre las células por inducción transitoria de la fosforilación de la proteína tirosina al comportarse como una tirosina quinasa. Se expresa en la mayoría de linfocitos B periféricos y se cree que está relacionada a su activación (11). La adhesión de AH a RHAMM induce la quimiotaxis y a CD44 se cree que actuaría como una ruta de recaptación para la degradación lisosomal (3).
Experiencias previas han demostrado que los extractos de la cutícula del parásito adulto y los estadios larvales de A. lumbricoides tienen receptores que unen AH (13)(15). En el parásito adulto, esta unión podría deberse a la presencia de uno o más tipos de receptores, pero se desconoce hasta el momento si este receptor es específico para AH, o es un receptor para quitina, o si existen ambos que en forma simultánea pueden realizar la captación (13).

Los resultados obtenidos al estudiar la captación de AH por los concentrados larvales demostraron claramente que a mayor cantidad de larvas, mayor es la cantidad de AH secuestrado por ellas. En las condiciones experimentales definidas, la mezcla AH-[CLAL1] (1000-1200 larvas/mL) dejó un remanente de AH que adhirió el 64% de los eritrocitos que se habían adherido en ausencia de larvas y la mezcla AH-[CLAL2] (400-600 larvas/mL) dejó libre una cantidad de AH como para adherir el 82% de los hematíes que se habían agregado en el Tubo 2. La mezcla AH-[CLAL3] (100-200 larvas/mL) captó tan poca cantidad de AH, que se adhirieron la casi totalidad de los eritrocitos adheridos cuando las larvas no estaban presentes.
Los análisis estadísticos concluyeron que existen diferencias significativas en el valor de CexpAdhEAH por efecto de la concentración de larvas.
El valor del IexpCPAH también demostró que el consumo de AH por las larvas se relaciona en forma directa con la concentración larvaria, pues los resultados del análisis estadístico permitieron concluir que existen diferencias significativas en el promedio de IexpCPAH por efecto de la concentración de larvas.
Se observó que si bien concentraciones tan bajas como las de [CLAL3] captan el AH necesario para adherir el 1% de los eritrocitos totales de la experiencia, [CLAL2] y [CLAL1] pueden captar el AH que adhiere el 7% y 21%, respectivamente, de las células rojas totales. Estos resultados demostraron que el secuestro de AH por el parásito durante la infección, podría tener un valor significativo dependiendo de la concentración de larvas circulantes.
La técnica de Inhibición de la Agregación por Adhesión para detección del Receptor CD44 soluble de hialuronato en suero humano, utiliza dos series de diluciones de un suero (con alto título de CD44 soluble) donde se agrega AH en la primera serie y AH- [EA]/[CLAL] en la segunda. Se revela con eritrocitos Grupo O y se determina el título de CD44 soluble en ambas series. Se considera significativa una diferencia de dos o más diluciones entre los títulos de las dos series (14)(15). Cuando se aplicó esta metodología con los [EA]B,C,D, se observó que la diferencia de título era de 2 diluciones con el [EA]C, 3 con el [EA]B, y 5 diluciones con el [EA]D, lo que indicó que este último extracto era el que más AH captaba. En estas experiencias, los valores hallados de CexpAdh EAH se correlacionaron con los observados previamente, ya que [EA]D dejó un remanente de AH como para adherir solamente el 8% de los eritrocitos adheridos en el Tubo 2, el [EA]B el 20% y el [EA]C un remanente de AH como para adherir el 28% de los hematíes adheridos en ausencia de extracto. El análisis estadístico concluyó que existen diferencias significativas en el valor de CexpAdhEAH por efecto del extracto parasitario.
Los valores de IexpCPAH demostraron que los [EA] captan el AH necesario para adherir entre un 40-50% de los eritrocitos totales, indicando que la acción del parásito adulto en la captación podría ser más relevante que en los estadíos larvales. El análisis estadístico demostró que el valor de IexpCPAH obtenido con el [EA]D tiene una diferencia significativa con los valores obtenidos de este índice con los otros dos extractos.
Si se considera la importancia de las funciones biológicas del AH, los resultados obtenidos con esta experiencia permitirían especular que el parásito lo capta para interferir en el desarrollo de la respuesta inmune del hospedador. Esta captación puede constituir una estrategia de evasión.

CORRESPONDENCIA

DRA. PATRICIA PONCE DE LEÓN
Laboratorio de Parasitología. Dpto. de Microbiología
Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas
Suipacha 531
2000 ROSARIO, Santa Fe, Argentina
E-mail: tefu1958@hotmail.com

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Aceptado para su publicación el 12 de junio de 2009

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