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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. v.43 n.4 La Plata oct./dic. 2009

 

BIOQUÍMICA CLÍNICA

Cuantificación de aminoácidos en plasma empleando Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia#

Plasma amino acid quantification using High Performance Liquid Chromatography

Luis Fernando Malaver Ortega1*, Carlos Javier Alméciga-Díaz2*, Inés Stella Morales Monsalve1*, Olga Yaneth Echeverri Peña1*, Johana Guevara Morales1*, Estefania Zuluaga Torres3*, Henry Alírio Córdoba Ruiz4*, Luis Alejandro Barrera Avellaneda5*

1. Bacteriólogo
2. Dr. en Ciencias Biológicas
3. Nutricionista
4. M. Sc. en Ingeniería Química
5. Dr. en Bioquímica

*  Instituto de Errores Innatos del Metabolismo. Pontificia Universidad Javeriana. Carrera 7 N° 43-82, Laboratorio 305A Edificio 53. Bogotá D.C., Colombia.

# Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá D.C., Colombia.

Resumen

Las aminoacidopatías son errores innatos del metabolismo intermediario de los aminoácidos. Su confirmación diagnóstica y seguimiento se realiza con la cuantificación de aminoácidos libres en fluidos biológicos por técnicas como la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), para lo que es necesario comparar con valores de referencia normales. La población colombiana no cuenta con estos valores disponibles y el diagnóstico es realizado por comparación con los de otras poblaciones. En el presente trabajo se obtuvieron valores de referencia de aminoácidos en plasma en una población de niños (n=36) y adultos no afectados (n=17), mediante HPLC por derivatización postcolumna con ninhidrina. Los valores de referencia obtenidos fueron ligeramente más elevados que los informados para otras poblaciones y permitieron la identificación de doce casos de aminoacidopatías, incluyendo fenilcetonuria clásica, hiperfenilalaninemia, hiperglicinemia no cetósica, desórdenes del ciclo de la urea, tirosinemia. La implementación de la cuantificación de aminoácidos por HPLC y la obtención de los valores de referencia de aminoácidos en plasma permitirán aumentar el conocimiento sobre la incidencia de las aminoacidopatías en el país para garantizar, junto con otros factores, su diagnóstico preciso y oportuno y la implementación de un adecuado seguimiento nutricional.

Palabras clave: Valores de referencia; Aminoácidos; Aminoacidopatías; Cromatografía líquida de alta eficiencia

Summary

Aminoacidopathies are inborn errors of the amino acid intermediary metabolism. The benchmark method used for their diagnosis and monitoring is the quanti!cation of free amino acids in biological fluids using High Performance Liquid Chromatography (HPLC), which needs to be compared against normal reference values. However, those amino acid reference values are not available for the Colombian population and the diagnosis is usually made using values from American or European populations. In this work, plasma amino acid reference values in non-affected children (n=36) and adults (n=17) were established, using an HPLC method with a postcolumn derivatization with ninhidrine. Plasma amino acid reference values in a Colombian population were slightly higher compared with those reported for other populations, and enabled the identification of twelve aminoacidopathies including urea cycle disorders, phenylketonuria, hyperphenylalaninemia, nonketotichyperglycinemia, hepatorrenaltyrosinemia and maple syrup urine disease. The implementation of amino acid cuantification by HPLC and the construction of plasma amino acid reference values is very useful for a suitable and precise diagnosis of amino acid disorders, the implementation of proper nutritional treatments, and an increased knowledge of aminoacidopathy incidence in Colombia.

Key words: Reference values; Amino acids; Aminoacidopathies; High performance liquid chromatography

Introducción

Las aminoacidopatías son errores innatos en el metabolismo de los aminoácidos, producidos por la alteración en la actividad de enzimas o transportadores ubicados antes de la formación del correspondiente tio éster de acil-CoA (1). Hasta el momento se han caracterizado cerca de 55 enfermedades distintas con prevalencias que van desde 1:12000 para el caso de la fenilcetonuria clásica (PKU) hasta desórdenes de los que apenas se han descrito unos pocos casos (2).
El esquema de diagnóstico básico de las aminoacidopatías comienza con los exámenes de tamizaje inicial que incluyen las pruebas de dinitrofenilhidrazina, nitrosonaftol, nitroprusiato de sodio y cloruro férrico, para la identificación de cetoácidos, tirosina (en orina), grupos sulfihidrilos (cistina y homocistina) y cetoácidos hidroxilados, respectivamente (3). Posteriormente, las muestras son analizadas por cromatografía en capa delgada de alto desempeño (HPTLC), en donde el diagnóstico preliminar de aminoacidopatía es realizado por la alteración en el perfil cromatográfìco de las muestras de los pacientes con respecto a las de controles normales y mezclas de estándares de aminoácidos (3). Finalmente, en el diagnóstico y seguimiento de las aminoacidopatías, la cuantificación de aminoácidos permite monitorear la evolución del paciente y realizar los ajustes necesarios durante su tratamiento, de una manera más efectiva (2). Aunque el tamizaje por espectrometría de masas en tándem ha surgido como una importante alternativa para el diagnóstico de algunas aminoacidopatías (4), la cuantificación de aminoácidos en fluidos biológicos mediante HPLC continúa siendo el método de referencia para el diagnóstico y seguimiento de los defectos que involucran el metabolismo intermediario de los aminoácidos (5).
El análisis de aminoácidos en muestras biológicas tiene el inconveniente de la presencia de un número considerable de aminoácidos en un amplio rango de concentraciones. La separación cromatográfica de estos compuestos permite una alta especificidad, sensibilidad, linealidad y reproducibilidad para su cuantificación (6). Los métodos usados para la determinación de aminoácidos en fluidos biológicos incluyen HPTLC (5), cromatografía de gases (7), y cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) (8-13). La determinación directa de los aminoácidos no es posible debido a la ausencia de importantes grupos cromóforos o fluoróforos, siendo necesaria su derivatización, pre o postcolumna, para su posterior detección por métodos ultravioleta (10)(13), fluorescentes (12)(14) o radiactivos (15).
Los patrones de excreción en orina, así como los valores de aminoácidos en plasma se ven afectados tanto por factores nutricionales como por la edad (7)(16-17). Scout et al. (9) informaron que los perfiles de aminoácidos en plasma para poblaciones comparables de recién nacidos variaban en función de la dieta aportada, sin encontrar diferencias basadas en el género y con valores mayores durante el primer mes de vida.
La relación entre la edad y la concentración de aminoácidos también fue estudiada por Lepage et al. (16), quienes describieron una dinámica distinta de los aminoácidos del plasma y los de la orina, con tres perfiles bien definidos. En 148 individuos con edades que comprendían desde el nacimiento hasta los dieciocho años, nueve de los aminoácidos (alanina, arginina, asparagina, metionina, ornitina, fenilalanina, prolina, treonina y tirosina) mostraron una disminución gradual hasta el año de vida, seguida de un aumento discreto hasta la adultez. Otros nueve (cistina, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, triptófano y valina) mostraron un aumento gradual durante los primeros dieciocho años de vida, mientras que cinco (aspartato, citrulina, glutamato, serina, y taurina) mantuvieron niveles constantes durante este período. Hallazgos similares fueron descritos por Chuang et al. (18).
En la actualidad no existen informes sobre los valores de aminoácidos en plasma para la población colombiana y no se cuenta con un método de cuantificación de aminoácidos para el diagnóstico de errores innatos del metabolismo (EIM), por lo que las muestras debían ser enviadas fuera del país para su cuantificación, aumentando considerablemente el tiempo de diagnóstico e inicio de tratamiento, en estas enfermedades que, en su gran mayoría, son consideradas urgencias médicas (3) (19-20). Adicionalmente, los valores de referencia de aminoácidos en plasma son de gran utilidad para el seguimiento de mujeres embarazadas (21), de condiciones como la desnutrición (22) y la anorexia nerviosa (23), y para el establecimiento de valores de ingesta diaria de proteínas (24). En el presente trabajo se establecieron valores de referencia de aminoácidos en plasma en una población colombiana de individuos no afectados que fueron divididos en dos grupos etáreos: (1) infantes, entre un día y un año de vida, e (2) individuos mayores de 18 años. La cuantificación de los aminoácidos se realizó mediante HPLC con derivatización postcolumna con ninhidrina y detección a 440 y 570 nm. Estos valores de referencia permitieron confirmar el diagnóstico en un grupo de individuos con sospecha de aminoacidopatías.

Materiales y Métodos

MUESTRAS

La obtención de los valores de referencia se realizó en dos grupos etáreos. El grupo I estuvo conformado por 36 individuos (16 niñas y 20 varones), que tenían entre un día y un año de edad (x = 4,35 meses). Los menores estaban bajo custodia legal del Instituto Colombiano de Bienestar Familiar (ICBF). Se excluyeron del estudio sujetos con antecedentes de enfermedad muscular, enfermedad ósea, enfermedad de la piel, enfermedad ocular, enfermedad infecciosa, quienes hubieran recibido transfusión sanguínea o tratamiento con antibióticos con una semana de anterioridad a la toma de la muestra, y quienes no tuvieran un desarrollo normal basado en la comparación de la edad cronológica con los parámetros peso y talla. Previa realización de la encuesta y de la firma del consentimiento informado por parte del tutor legal, se extrajeron 5 mL de sangre que se colocaron en un tubo heparinizado. Por otro lado, el grupo II estuvo conformado por 17 adultos normales (10 mujeres y 7 hombres), entre 19 y 50 años (x =31,5 años), a los cuales se les extrajeron 5 mL de total sangre que se colocaron en un tubo heparinizado.
Un tercer grupo de individuos estuvo constituido por doce pacientes remitidos al Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) de la Pontificia Universidad Javeriana entre el segundo semestre de 2006 y el primero de 2008, con sospecha de aminoacidopatía o acidemia orgánica. Las muestras de orina de los pacientes fueron sometidas a pruebas de tamizaje con dinitrofenilhidrazina, nitrosonaftol, nitroprusiato de sodio y cloruro férrico y análisis de ácidos orgánicos en orina por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). El análisis de aminoácidos en las muestras de plasma fue realizado por HPTLC y HPLC.

PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE SANGRE

El plasma se separó por centrifugación a 4000 rpm durante 10 min y se conservó a -80 °C hasta el momento del análisis. El plasma se desproteinizó por adición de ácido 5-sulfosalicílico (50 mg/mL) y se incubó por 1 hora a 4 ºC. Finalmente, el plasma desproteinizado se centrifugó a 13200 rpm por 5 min a temperatura ambiente y se filtró por membrana de 0,22 µm (Alltech Associates Inc. Deerfield, IL, EE.UU.).

ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS POR HPTLC

Se utilizaron placas cromatográficas HPTLC de 20 x 10 cm de celulosa (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). La fase móvil consistió en una mezcla de butanol: ácido-acético:agua en proporción 12:3:5, respectivamente. Dos microlitros de la muestra de plasma desproteinizado y filtrado o de la mezcla patrón fueron sembrados en la placa. La mezcla patrón estaba conformada por cisteína, lisina, histidina, ornitina, arginina, glicina, serina, ácido glutámico, glutamina, prolina, valina, metionina, triptofano, tirosina, alanina, fenilalanina, leucina e isoleucina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.), cada una en una concentración de 1 mg/mL en HCl 0,1N. La placa se reveló con ninhidrina al 1%.

CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR HPLC

El análisis de aminoácidos por HPLC se realizó en un analizador de aminoácidos Biochrom 20® (Pharmacia Biotech, Cambridge, Reino Unido) con una columna de intercambio catiónico de alta resolución de 200 mm x 4,6 mm (Pharmacia Biotech), siguiendo las instrucciones del fabricante (25) (26). De la solución estándar o del plasma filtrado desproteinizado fueron cargados 80 µL en la cápsula de inyección (Pharmacia Biotech) y colocados en el automuestreador mantenido a 4 ºC. Como fase móvil se emplearon las soluciones tampón de citrato de litio contenidas en el Ultra Physiological Fluid Chemical Kit (Pharmacia Biotech), a un flujo de 1 mL/min. Las características de cada una de las soluciones tampón, así como las condiciones de los gradientes de fuerza iónica y temperatura, se ilustran en la Tabla I. La detección se realizó postcolumna a 440 y 570 nm previa derivatización con ninhidrina (Ultra Ninhydrin Reagent, Pharmacia Biotech) a 135 ºC. Los cromatogramas fueron analizados utilizando el programa EZChrom Elite® (EZchrom Scientific Software, San Ramon, CA, EE.UU.).

Tabla I. Soluciones tampón y gradientes de fuerza iónica y temperatura utilizados en los análisis de aminoácidos por HPLC.

Para la determinación de los tiempos de retención y de su coeficiente de variación, se inyectó por triplicado una solución que contenía una mezcla de los siguientes aminoácidos: ácido aspártico (Asp, 0,53 mM), treonina (Thr, 0,44 mM), serina (Ser, 0,76 mM), ácido glutámico (Glu, 0,47 mM), asparagina (Asn, 0,49 mM), glutamina (Gln, 0,44 mM), cisteína (Cys, 0,58 mM), prolina (Pro, 0,63 mM), glicina (Gly, 0,80 mM), alanina (Ala, 0,56 mM), citrulina (Cit, 0,29 mM), valina (Val, 0,66 mM), metionina (Met, 0,35 mM), cistina (0,23 mM), isoleucina (I-Leu, 0,44 mM), leucina (Leu, 0,40 mM), tirosina (Tyr, 0,33 mM), fenilalanina (Phe, 0,38 mM), lisina (Lys, 0,34 mM), triptofano (Trp, 0,24 mM), histidina (His, 0,36 mM) y arginina (Arg, 0,26 mM). Esta mezcla de aminoácidos fue preparada a partir de soluciones de reserva de 0,2-0,3 mg/mL en HCL 0,1 N de cada uno de los aminoácidos. Para la construcción de las curvas de calibración se realizaron tres diluciones seriadas 1:2, en HCl 0,1 N, de esta mezcla de aminoácidos. Cada uno de los puntos de la curva fue inyectado por triplicado. Las curvas de calibración de cada aminoácido fueron construidas grancando el área bajo la curva del aminoácido contra su concentración (mM). La precisión del método se determinó como reproducibilidad interensayo con determinaciones de una misma muestra en diferentes días por dos operadores diferentes (n=4).
Los valores de concentración (mM) fueron expresados como media ± desviación estándar (DE), rangos o percentiles 25/50/75 con el objetivo de comparar los resultados obtenidos en este trabajo con los informados por otros autores. Para el diagnóstico de los pacientes con aminoacidopatías se utilizaron los valores de los percentiles 2,5 y 97,5.

ANÁLISIS DE ÁCIDOS ORGÁNICOS POR CROMATOGRAFÍA GASEOSA-ESPECTROMETRÍA DE MASAS (GC-MS).

El análisis de ácidos orgánicos en los pacientes remitidos al IEIM con sospecha de aminoacidopatía fue realizado empleando el método de extracción con acetato de etilo y etiléter y derivatización con bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (Sigma-Aldrich) previamente descrito (27). La muestra derivatizada se analizó en un cromatógrafo de gases HP-6890 (Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE.UU.) acoplado a un detector de espectrometría de masas selectivo HP-5973 (Agilent Technologies). El ensayo se desarrolló por 35 min con helio ultrapuro como fase móvil a un flujo constante de 0,6 mL/min sobre una fase sólida de polimetilsiloxano de 0,2 mm de espesor, en una columna capilar de 12,5 m de largo. La mezcla de ácidos orgánicos derivatizados se separó con una rampa constante de temperatura entre 80 y 220 °C. Los datos obtenidos se analizaron con el programa ChemStation Data System G1701CA-C.00.00 (Agilent Technologies). El espectro de masas fue comparado con las bases de datos de uso corriente en el laboratorio para el diagnóstico de errores innatos del metabolismo.

CONSIDERACIONES ÉTICAS

El proyecto fue aprobado por los comités de ética investigativa de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana y del Instituto Colombiano de Bienestar Familiar (ICBF), seccional Bogotá. Todos los individuos aceptaron y firmaron el consentimiento informado donde se especificaba el tipo de muestra a tomar y los procedimientos y resultados esperados del trabajo.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El análisis estadístico descriptivo se realizó con el paquete SPSS Versión 13.0 para Mac (Chicago, Illinois, EE.UU.).

Resultados

CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR HPLC

El método de análisis de aminoácidos por HPLC empleado en el presente trabajo permitió la identificación de los 22 aminoácidos listados en la Tabla II, los cuales aportan al diagnóstico diferencial de aminoacidopatías (3) (6). Con excepción de prolina que se monitoreó a 440 nm (donde presenta la mayor absorbancia), todos los aminoácidos fueron monitoreados y cuantificados a 570 nm (Figura 1a). Bajo las condiciones empleadas no fue posible la resolución de los picos de glutamato y asparagina, y de alanina y citrulina, por lo que estos aminoácidos fueron informados con base en el área total del pico. La separación de glutamato y asparagina fue posible a bajas concentraciones (>0,1 mM), como se observó durante la construcción de la curva de calibración (dato no mostrado).

Tabla II. Tiempos de retención (TR) y sus coeficientes de variación (CV), según el orden de elusión de los aminoácidos puros. La ventana de elusión fue ajustada con respecto al CV para la máxima resolución de los picos.


Figura 1. (a) Cromatograma por HPLC de una mezcla de aminoácidos puros. (b) Cromatograma típico de una muestra de plasma de un individuo no afectado. La mezcla de estándares o de plasma desproteinizado y filtrado (80 µL), fue inyectada en el HPLC y separada en una columna de intercambio iónico. Los aminoácidos fueron derivatizados postcolumna con nihindrina y monitoreados a 440 nm y 570 nm.

La Tabla II resume los resultados del análisis de los coeficientes de variación (CV) para los tiempos de retención. El método mostró CV de los tiempos de retención entre 0,3 y 1,5, y CV interensayo para los tiempos de retención menores a 15 con excepción de serina, glicina, cisteína y metionina, quienes mostraron CV de 16, 28, 30 y 33, respectivamente. Los curvas de calibración de los aminoácidos mostraron coeficientes de regresión mayores a 0,90, con excepción de serina, cisteína y prolina, quienes mostraron coeficientes de regresión de 0,8501, 0,6560 y 0,8107, respectivamente.

ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS POR HPTLC

Debido a que el análisis de aminoácidos por HPTLC es la técnica regularmente empleada en este laboratorio para el diagnóstico de aminoacidopatías, las muestras de plasma de los individuos del grupo I y II fueron analizadas por esta técnica cromatográfica luego de HPLC. Con excepción de tres individuos del grupo I que mostraron un leve aumento en la banda de valina-metionina-triptofano, no se observó una diferencia apreciable entre los perfiles obtenidos para los diferentes individuos, independientemente de la edad de éstos (dato no mostrado).

ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS EN PLASMA POR HPLC EN POBLACIÓN ADULTA

La Tabla III resume los datos obtenidos en población adulta expresados como media, desviación estándar y rango, con el objetivo de comparar los resultados del presente estudio con los informados por otros autores. Las medias calculadas corresponden a los valores encontrados en el total de los individuos. Algunos aminoácidos como aspartato, treonina y serina no fueron identificados de manera constante en los cromatogramas. Tales casos fueron incluidos en la estadística descriptiva con un valor de concentración de cero. La Figura 1b muestra un cromatograma típico de aminoácidos en plasma de un individuo no afectado.

Tabla III. Valores de aminoácidos en plasma para población adulta comparados con los informados en la literatura. Los valores son expresados como mM.

Todos los aminoácidos mostraron una distribución normal (Shapiro-Wilk, p>0,05) y fueron identificados en el 80-100% de los individuos con excepción del aspartato (6/17) y treonina (8/17). En todos los casos la cisteína fue detectable pero no cuantificable, con una altura de pico entre tres y diez veces el ruido de fondo. La mayor dispersión se encontró en los valores de glutamina, valina y metionina. Cuando los valores obtenidos se expresaron como rangos (Tabla III), los valores mínimos fueron iguales a cero para aspartato, treonina, serina, prolina, cisteína, metionina, lisina, triptofano y arginina.

ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS POR HPLC EN POBLACIÓN MENOR A UN AÑO DE EDAD

La Tabla IV resume los resultados del análisis de aminoácidos para la población menor de un año, con los valores expresados como media, desviación estándar, rango y percentiles (25/50/75), con el objetivo de comparar los resultados del presente estudio con los informados por otros autores. Todos los aminoácidos fueron encontrados en la totalidad de los muestras analizadas, con excepción de aspartato (22/27), treonina (26/27) y serina (25/27), y mostraron una distribución normal (Shapiro-Wilk, p>0,05) Los perfiles cromatográficos fueron similares a los observados en adultos (Figura 1b). Los valores de glutamina, valina, tirosina y lisina mostraron los mayores valores de dispersión. A diferencia de lo observado en el grupo de adultos, en el límite mínimo no se detectó aspartato, treonina, serina ni glicina (valores tomados como cero).

Tabla IV. Valores de aminoácidos en plasma para población de niños dentro del primer ano de vida comparados con informes internacionales. Los valores son expresados como mM.

ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS EN PACIENTES CON AMINOACIDOPATÍAS

Una vez realizada la validación parcial del método de cuantificación de aminoácidos por HPLC y establecidos los valores de referencia, doce individuos remitidos al IEIM bajo sospecha de aminoacidopatía o acidemia orgánica fueron seleccionados, con base en su historia clínica y resultados de pruebas tamizaje y/o ácidos orgánicos por GC-MS, para la cuantificación de aminoácidos en plasma por HPLC. Con el objetivo de evitar un elevado número de falsos positivos, los valores de referencia fueron establecidos como los percentiles 2,5 y 97,5 (Tabla V). Los valores de aminoácidos encontrados, así como los principales hallazgos clínicos sugestivos de un error innato del metabolismo, se resumen en la Tabla VI.

Tabla V. Valores de referencia de aminoácidos en plasma para población menor de 1 año y adulta, empleados para el diagnóstico de aminoacidopatías.

Tabla VI. Hallazgos clínicos y de laboratorio en pacientes con diagnóstico de aminoacidopatía. Los valores de aminoácidos son presentados como mM

La Figura 2 muestra el cromatograma típico obtenido para un paciente con hiperfenilalaninemia. En el primer caso de hiperfenilalaninemia, los valores de fenilalanina en sangre fueron 7,4 veces más elevados que los observados en individuos no afectados, similar a lo informado en la literatura para el diagnóstico de hiperfenilalaninemias(3)(28). Este valor se comparó con la cuantificación fluorométrica de fenilalanina, obteniéndose una elevación de 8,6 veces con respecto a los valores normales (dato no mostrado), similar a la informada por HPLC. Para el segundo y tercer caso los valores de fenilalanina se encontraban alrededor de seis veces por encima de los valores de referencia (Tabla VI).


Figura 2. Cromatograma de aminoácidos en plasma por HPLC (570 nm) de un individuo con hiperfenilalaninemia. Los valores de tirosina y fenilalanina fueron 0,092 mM (0,046/0,514 mM) y 0,740 mM (0,050/0,120), respectivamente. Los aminoácidos restantes se encontraban dentro de rangos normales.

En el paciente con tirosinemia, el análisis de ácidos orgánicos demostró la elevación en orina del ácido 4-hidroxi-fenil láctico, ácido 4-hidroxi-fenil acético, ácido 4-hidroxi-fenil pirúvico, n-acetil tirosina y succinilacetona, este último compuesto patognomónico de tirosinemia hepatorrenal (3) (Figura 3a). La confirmación del diagnóstico se realizó por cuantificación de aminoácidos por HPLC encontrando niveles de tirosina y fenilalanina 5,1 y 1,9 veces por encima de los valores de referencia (Figura 3b).

                             


Figura 3. (a) Cromatograma de ácidos orgánicos en orina por GC-MS de un individuo con tirosinemia tipo I. (1) ácido láctico, (2) estándar interno, (3) fenilláctico, (4) 4-hidroxifenil piruvato, (5) succinilacetona, (6) N-acetiltirosina, (7) 4-hidroxifenil láctico, (8) 4-hidroxifenil pirúvico, (9) N-acetiltirosina y (10) N-acetiltirosina. (b) Cromatograma de aminoácidos en plasma por HPLC (570 nm). Los valores de concentración de tirosina y fenilalanina fueron 0,665 mM (0,046/0,514) y 0,229 mM (0,050/0,120), respectivamente. Los aminoácidos restantes se encontraban dentro de rangos normales.

Para el caso del paciente con orina con olor a jarabe de arce (EOJA), la sospecha clínica apoyada en los resultados de ácidos orgánicos que mostraron una marcada excreción de 2-hidroxivalerato, 2-hidroxi metilvalerato, 2-metil 3-hidroxivalerato, ácido 2-ceto-isocaproico, d-isoleucina y d-alloisoleucina (Figura 4a), fue confirmada por el análisis por HPLC (Figura 4b). Aunque se observaron valores normales de valina, la leucina y la iso-leucina se encontraban elevadas 7,4 y 1,2 veces por encima de los valores de referencia. Adicionalmente, el cromatograma presentó una señal de alloisoleucina que se encuentra en sujetos afectados y es altamente sugestiva de EOJA (29)(30).


Figura 4. (a) Cromatograma de ácidos orgánicos en orina por GC-MS en un individuo afectado por la enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce (EOJA). (1) ácido láctico, (2) 3-hidroxicaproico, (3) 3-hidroxibutirato, (4) 2-hidroxi-isovalérico, (5) acetoacetato, (6) 3-hidroxi-valérico, (7) acetoacetato, (8) 2-hidroxi-isocaproico, (9) 2-ceto-isocaproico, (10) 4-hidroxi-isovalérico, (11) 3-ceto-2-metil-valérico, (12) estándar interno y (13) d-aloisoleucina. (b) Cromatograma de aminoácidos en plasma por HPLC (570 nm) del mismo paciente. Los valores de valina, isoleucina y leucina fueron 0,244 mM (0,041/0,322), 0,132 mM (0,050/0,110) y 1,943 mM (0,062/0,260). La elevación en los valores de glutamina y metionina es producida por el daño hepático asociado con la enfermedad. Los aminoácidos restantes se encontraban dentro de rangos normales.

Cuatro casos de desórdenes del ciclo de la urea son informados en el presente trabajo. En todos los casos la hiperamonemia fue un hallazgo constante, así como la elevación de glutamina, alanina-citrulina y lisina en los análisis por HPLC (Figura 5a), de acuerdo con lo informado en la literatura (20)(31). Estos casos ejemplifican las limitaciones de la técnica de HPTLC, pues los aminoácidos histidina, lisina y ornitina presentan una distancia de migración muy similar a la de arginina, impidiendo una interpretación acertada del patrón cromatográfico. Adicionalmente las bandas de aumento de aspartato, glutamina, glicina, alaninacitrulina y metionina no fueron detectadas como elevadas por HPTLC (dato no mostrado). En el tercer caso se encontró, además, la elevación de ornitina, identificada de acuerdo al tiempo de retención informado en la literatura (32), hallazgo compatible con una deficiencia de ornitina trans-carbamilasa (OTC) (20)(31).


Figura 5. (a) Cromatograma de aminoácidos en plasma por HPLC (570 nm) de un paciente con desorden del ciclo de la urea. Los valores de glutamina, alanina-citrulina y lisina fueron 1,545 mM (0,021/0,988), 0,614 mM (0,050/0,546) y 0,888 mM (0,000/0,358), respectivamente. Los picos de amonio y ornitina fueron identificados de acuerdo a los tiempos de retención informados en la literatura. (b) Cromatograma de aminoácidos por HPLC (570 nm) en plasma y líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente con hiperglicinemia no cetósica. Los valores de glicina en plasma y LCR fueron 1,087 mM (0,351±0,097 mM) y 0,218 mM (0.071±0.01mM). En los dos casos los aminoácidos restantes se encontraban dentro de rangos normales.

Con respecto a los valores encontrados en el diagnóstico de la hiperglicinemia no cetósica (Figura 5b), en tres de los casos el aumento de glicina en plasma y líquido cefalorraquídeo (LCR) estuvo entre tres y cinco veces por sobre el valor de referencia, con una relación plasma/LCR para la glicina superior a 0,8 que concuerda con lo descrito para la variante neonatal de la enfermedad (33)(34). A pesar de que en el último caso los valores de glicina en plasma y LCR se encontraban dentro del rango de normalidad, la relación plasma/ LCR estuvo elevada (0,33).

Discusión

Las aminoacidopatías constituyen un grupo importante de EIM, en el que el oportuno y correcto diagnóstico permite la instauración de tratamientos nutricionales que evitan la aparición de daños irreversibles o fatales (3)(20). En el presente trabajo se construyeron valores de referencia de aminoácidos en plasma para una población colombiana, para ser empleados en el diagnóstico de pacientes con sospecha de aminoacidopatías.
Durante la validación del método se observó que todos los aminoácidos fueron identificados, salvo glutamato-asparagina y alanina-citrulina, los cuales no pudieron serlo resueltos bajo las condiciones empleadas en el método. A pesar que la cuantificación específica de la citrulina es importante en el diagnóstico y seguimiento de los desórdenes del ciclo de la urea, el diagnóstico diferencial puede establecerse con la identificación y cuantificación de otros aminoácidos que se encuentran alterados en estos pacientes, como la glutamina o el ácido aspártico (29). Por otro lado, la alanina no se encuentra elevada ordinariamente en aminoacidopatías, motivo por el cual un incremento en el área del pico de alanina-citrulina seguramente corresponderá a un aumento en la concentración de citrulina. Por lo tanto, el diagnóstico y seguimiento de pacientes con alteraciones en el metabolismo de citrulina, puede ser realizado mediante la determinación del área bajo la curva del pico de alanina-citrulina. Para el caso del pico de glutamato-asparagina, debido a que su resolución fue posible en concentraciones inferiores a 0,1 mM, se recomienda que en aquellos pacientes con elevación en este pico se realice dilución de la muestra, con el objetivo de separar estos aminoácidos y determinar cuál es el responsable del aumento de la señal.
Los coeficientes de variación para el tiempo de retención (Tabla II) fueron similares a los informados por
Turnerll y Cooper (10) y Georgi, et al. (35) para la cuantificación de aminoácidos en muestras biológicas, pero ligeramente más altos que los logrados por Biggs y Gentilcore (36) y Qu, et al. (11). Los coeficientes de variación interensayo variaron entre 4 y 30%, valores inferiores a los informados por Turnerll, et al. (10) y Biggs y Gentilcore (36), con excepción de los aminoácidos con grupos sulfihidrilos (cistina, metionina) y la glicina. A pesar de que para la mayoría de los aminoácidos los valores de linealidad no cumplen los criterios establecidos para su cuantificación en otras aplicaciones biológicas (37), cuando se presenta un paciente con aminoacidopatía la elevación en la concentración del aminoácido es tan marcada (cerca de 6 veces por encima de los valores normales), que el diagnóstico puede ser realizado fácilmente y de una manera precisa (2). De los valores de R2 se destaca el de cisteína (0,6560), pues en principio no permitiría su cuantificación en muestras de pacientes. Sin embargo, como se discutirá más adelante, este aminoácido fue detectable pero no cuantificable (entre tres y diez veces el ruido de fondo) en las muestras de los individuos del grupo control.
En conjunto, estos resultados muestran que el método de cuantificación de aminoácidos por HPLC establecido en este laboratorio, puede ser usado para la construcción de valores de referencia de aminoácidos en plasma y para el diagnóstico de aminoacidopatías.
La cuantificación de aminoácidos en adultos no afectados mostró una distribución normal y fueron identificados en más del 80% de los individuos, con excepción de aspartato y treonina (Tabla III). Estas diferencias no se observaron cuando las muestras fueron analizadas por HPTLC, mostrando la limitación de esta técnica y la importancia del análisis de aminoácidos por HPLC.
Entre los valores de concentración de aminoácidos en adultos (media ± DE), se destaca el de ácido aspártico, que se encuentra elevado veinte veces con respecto a lo informado por Chuang, et al (18) para una población china y 40 veces lo reportado por Perry y Hansen (17). No fue posible establecer la causa de este marcado incremento, aunque diferencias nutricionales y factores asociados con la toma y manejo de la muestra pueden jugar un papel importante en este hallazgo (17); dichas posibilidades están siendo evaluadas en la actualidad. Para los demás aminoácidos los valores hallados (media ± DE) fueron entre 0,2 y dos veces más altos que los informados por otros autores (17) (18) (38), con excepción de lisina, que presentó valores similares a los publicados por Perry y Hansen (17), pero 3 veces por encima de los informados por Chuang, et al. (18). Para los casos de valina, metionina y tirosina la media de la concentración fue similar a lo informado por otros autores (17)(18). Los valores de glutamina fueron similares a los informados por Chuang, et al. (18) pero más bajos que los indicados por Perry y Hansen (17). Los valores de prolina, lisina y triptofano fueron similares a los informados por Perry y Hansen (17).
En el caso de la población menor de un año, similar a lo observado en la población adulta, los valores de aspartato (media ± DE) fueron 10, 20 y 50 veces más elevados que los informados por Chuang, et al. (18), Brodehl y Gellissen (39) y Soupart (40), respectivamente, sugiriendo un posible efecto de la metodología sobre la cuantificación de este aminoácido. Los valores de glutamina (media ± DE) fueron más bajos que los hallados por Shapira, et al. (38) y Soupart (40). Para los demás aminoácidos, los valores (media ± DE) fueron entre 0,2 y 2 veces más elevados que los hallados por Lepage, et al. (16). Cuando los valores fueron expresados como rangos, los límites máximos fueron mayores que los informados por otros autores.
El análisis de aminoácidos en plasma y orina por HPTLC constituye una herramienta importante para el tamizaje de individuos con sospecha de aminoacidopatías (3) (20). Sin embargo, este método no permite una adecuada separación y cuantificación de los aminoácidos, dificultando la identificación precisa de una disminución o aumento en la concentración de un determinado aminoácido, lo que produce un elevado número de falsos positivos y falsos negativos (5). La disminución en la concentración de algunos aminoácidos es determinante para el diagnóstico de los desórdenes del ciclo de la urea, en los que la cuantificación de arginina y citrulina permite diferenciar entre una u otra enfermedad (2)(31). Al comparar los hallazgos de HPTLC para los tres individuos del grupo I en los que se observó un aumento en la banda valinametionina-triptofano, con los resultados obtenidos por HPLC para cada uno de estos aminoácidos, se observó que los valores se encontraban dentro de los rangos normales. Adicionalmente, las variaciones observadas en las concentraciones de los diferentes aminoácidos (Tablas III y IV), no se observan por HPTLC. Estos resultados muestran la importancia de confirmar cualquier hallazgo encontrado en HPTLC mediante cuantificación de aminoácidos por HPLC, pues la información obtenida por el primer método puede verse alterada por diversos factores externos e internos, que limitan el correcto diagnóstico de la enfermedad (3).
A diferencia de lo reportado por Lepage, et al. (16) y Chuang, et al (18), para poblaciones canadienses y chino-taiwanesas, respectivamente, en el presente estudio no se observó una diferencia significativa entre los valores de aminoácidos en plasma de adultos y niños menores de un año (Tablas III y IV). Estos resultados, así como las variaciones en las concentraciones de los aminoácidos con respecto a otros informes, pueden ser debidos a la variabilidad ocasionada por los métodos analíticos y equipos empleados en uno u otro caso, así como al número de individuos presentes en cada grupo. Es importante destacar que el tamaño de los grupos en el presente trabajo es similar al informado por otros autores (Para adultos: Perry y Hansen (17) n= 20, Chuang, et al. (18) n=46; para menores de un año: Brodehl y Gellissen (39) n=12, Soupart (40) n=20, Lepage, et al. (16) n=34, Chuang, et al. (18) n=34). Sin embargo, es necesario ampliar el número de sujetos de los dos grupos, incluyendo niños mayores de un año y adolescentes.
Finalmente, en los 12 individuos con sospecha de aminoacidopatía fue posible realizar la confirmación del diagnóstico, mostrando la validez de los valores de referencia construidos en el presente trabajo. Se identificaron tres hiperfenilalaninemias (elevación de fenilalanina), una tirosinemia (elevación de tirosina), una enfermedad de Orina con Olor a Jarabe de Arce (elevación de aminoácidos ramificados: valina, leucina e isoleucina), tres desórdenes del ciclo de la urea (elevación de glutamina, alanina-citrulina y lisina) y tres hiperglicinemias no cetósicas (elevación de la relación glicina plasma/líquido cefalorraquídeo 2,6-11 veces).
Entre los casos con sospecha de aminoacidopatía se destaca el cuarto paciente del grupo de hiperglicinemias no cetósicas, el cual, como se observa en la Tabla VI, presentó una relación del aminoácido en LCR/plasma por encima de los valores de referencia pero con valores normales de glicina en plasma. Análisis posteriores mostraron que el paciente presentaba excreción elevada de cuerpos cetónicos en orina, descartándose la hiperglicinemia no cetósica y llevando hacia la búsqueda de un nuevo diagnóstico. De esta manera, en el diagnóstico de la hiperglicemia no cetósica es conveniente tener en cuenta no sólo la elevación de la relación de glicina en LCR y plasma, sino también la elevación simultánea del aminoácido en los dos fluidos, la presencia de cuerpos cetónicos, las alteraciones en los perfiles de ácidos orgánicos en orina y las anormalidades (tipo estallido-supresión) en el electroencefalograma.

Conclusiones

Se construyeron valores de referencia de aminoácidos en plasma para niños menores de 1 año y población adulta, los cuales mostraron diferencias con los informados para otras poblaciones, destacando la importancia del establecimiento de valores de referencia propios de cada población, especialmente para países en los que la carga genética y las costumbres alimenticias varían considerablemente con respecto a otras poblaciones con las que generalmente son construidos estos valores de referencia. La comparación entre lo resultados obtenidos por HPTLC y HPLC mostró la importancia de confirmar cualquier hallazgo encontrado en HPTLC mediante cuantificación de aminoácidos por HPLC, destacando la importancia de la implementación de esta metodología y de la construcción de los valores de referencia. Aunque es necesario ampliar el número de individuos para el cálculo de los valores de referencia, la implementación de esta técnica permitirá mejorar el conocimiento sobre este grupo de enfermedades, hasta el momento subdiagnosticadas entre la población colombiana y latinoamericana.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo fue financiado por la Pontificia Universidad Javeriana (ID PPTA 00000322, ID PRY 000335). Los autores expresan sus agradecimiento al Dr. James Bonham del Sheffield Children's Hospital, UK, por la donación del analizador de aminoácidos; a la Dra. María Angélica Bruges y al Dr. Orlando Scoppetta Díaz Granados del ICBF, por su colaboración en el reclutamiento de los niños y a María Alejandra Burbano por su asistencia. LFMO recibió una beca de Joven Investigador del Departamento de Administrativo de Ciencia, Tecnología e Investigación (COLCIENCIAS).

CORRESPONDENCIA
DR. LUIS ALEJANDRO BARRERA
Instituto de Errores Innatos del Metabolismo
Pontificia Universidad Javeriana
Carrera 7 No. 43-82, Laboratorio 305A Edificio 53
Tel: +57-1-3208320 Ext:4099
BOGOTÁ D.C., Colombia.
E-mail: abarrera@javeriana.edu.co

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Aceptado para su publicación 29 de diciembre de 2009

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