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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. v.44 n.1 La Plata ene./mar. 2010

 

INMUNOLOGÍA

Ascaris lumbricoides:
Estudio de la cinética de captación de ácido hialurónico

Ascaris lumbricoides: Study of kinetics of hyaluronic acid capture

Patricia Ponce de León1*, Patricia Foresto†2**, Juana Valverde2**

1. Bioquímica
2. Doctora en Ciencias Bioquímicas

* Laboratorio de Parasitología. Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas. UNR
** Laboratorio de Inmunohematología, Hemorrelogía e Inmunogenética. Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas. UNR

Resumen

El ácido hialurónico (AH) participa de la respuesta inmune porque es un constituyente de las barreras mecánicas naturales, un estimulador de la inflamación y un ligando de receptores involucrados en la inmunidad. En experiencias previas se demostró que adultos y larvas de Ascaris lumbricoides pueden unir AH. El objetivo de este trabajo fue estudiar la cinética de captación de AH por este nematodo. Se trabajó con un extracto de parásito adulto y un concentrado de larvas. Se utilizó la técnica modificada de Inhibición de la Agregación por Adhesión para detección del receptor CD44 soluble de hialuronato. Se evaluó la cinética de captación de AH por el parásito, variando el tiempo de contacto entre ambos desde un tiempo inicial hasta 90 minutos, con intervalos de 10 minutos. Para todos los tiempos se calcularon los valores de CexpAdhEAH e IexpCPAH que fueron analizados por las pruebas de Wilcoxon y de Friedman. Los resultados mostraron que al tiempo inicial de contacto, el parásito adulto y las larvas captan una pequeña cantidad de AH. A los 10 minutos se produjo la mayor captación que se mantuvo sin diferencias significativas durante 50 minutos. A partir de ese tiempo, hubo un leve incremento en la captación que permaneció sin diferencia significativa hasta el tiempo final. Esta experiencia demuestra que in vitro, A. lumbricoides realiza la mayor captación a los 10 minutos de contacto, por lo que se sugiere que in vivo sería capaz de unir AH rápidamente a los fines de modular la respuesta inmune.

Palabras clave: Ascaris lumbricoides; Ácido hialurónico; Cinética; Captación

Summary

Hyaluronic acid (HA) particípales in the immune response because it is a constituent of natural mechanical barriers, an inflammation stimulator and a ligand for receptors involved in immunity. Previous experiences have shown that adult specimens and larval concéntrales oí A. lumbricoides have hyaluronan binding capacity. The aim ofthis work was to study the kinetics ofhyaluronic acid capture by this parasite. Work was carried out with an extract of adult specimen and a larval concéntrate. The modlfled test of serum soluble CD44 Detectlon by Aggregatlon Inhlbltlon was used. Kinetics hyaluronlc acid capture by the nematode was assessed by varylng the contad time between HA and parasite, from an initial time to 90 minutes, with 10-minute intervals. CexpAdhEHA ana lexpCPHA were calculated for all the times and they were analysed by Wilcoxon and Friedman Tests The results showed that at initial time of contad, the adult paraslte and the larvae had captured a small amount of HA. The major capture was made at 10 minutes and it was maintained for 50 minutes without significad differences. From that time there was a slight increase in capture and it remaíned so untíi the end of the experiment without considerable variations. This experience demonstrates that at 10 minutes of in vitro contad, A. lumbricoides captures most of the HA, whích suggests that in vivo, the parasite would be able to capture HA quickly for the purpose of modulating the immune response.

Keywords: Ascaris lumbricoides; Hyaluronic acid; Kinetics; Capture

Introducción

Los avances en el estudio de la biología parasitaria y de la inmunogenética, han permitido conocer la participación de los parásitos en la evolución de la respuesta inmune del hospedero. A lo largo de la evolución, los parásitos tuvieron que desarrollar complejos mecanismos para poder perpetuarse crónicamente y para ello necesitaron diseñar estrategias de evasión que, entre otras cosas, han dificultado el desarrollo de vacunas (1). Los mecanismos puestos enjuego por los parásitos para escapar del sistema inmune de su hospedero siguen siendo motivo de estudio, pues aunque muchos ya han sido dilucidados, aún se van descubriendo aspectos novedosos que reflejan el desconocimiento que se tiene sobre la totalidad de las estrategias utilizadas por los parásitos. El estudio de la glucobiología ha aportado nuevos datos para comprender la delicada simbiosis entre parásito y hospedador y se ha comunicado que el mecanismo infeccioso involucraría a los glucoconjugados de ambos (2).
Se especula con la idea de que los nematodos hayan desarrollado moléculas similares, que recuerden funcionalmente a las de su hospedero, mediante las cuales modulan su inmunidad (3). En este contexto, se podría incluir la competencia de los receptores del parásito y los receptores humanos por la captación de acido hialurónico, debido a que este polisácarido participa activamente en el desarrollo de la respuesta inmune.
El ácido hialurónico (AH) no sólo es el constituyente principal del tejido conjuntivo, que es una de las barreras mecánicas naturales (4), sino es un reconocido estimulador del proceso inflamatorio. Tiene propiedades antioxidantes, capacidad de eliminación de radicales libres y actúa como barrera de degradación tisular (5). Asimismo, activa células dendríticas por TLR4 (Receptor Símil Toll 4) (6).
En experiencias previas se demostró que tanto los ejemplares adultos como las larvas de Ascaris lumbricoides
pueden unir AH (7)(8), y que esta captación es variable en los parásitos adultos y en las larvas es dependiente de la concentración larvaria (9).
El objetivo de esta experiencia fue estudiar la cinética de captación de AH por este nematodo.

Materiales y Métodos

MUESTRAS

Extracto deA. lumbricoides ([EA]):Se trabajó conunextracto parasitario obtenido a partir de la remoción de la cutícula de un ejemplar adulto y ruptura mecánica refrigerada (10). EL[EA] fue seleccionado porque mostró la mayor capacidad de unión AH en las experiencias previas (9).

Concentrado de Larvas ([CLAL]): Se utilizó un Concentrado de Larvas (L1/ L2) obtenido de la embrionación in vitro (11) y posterior eclosión de huevos de A. lumbricoides (12). Las larvas fueron recolectadas a 37 ºC por el método de Baermann-Moraes (13) en buffer fosfato. Completada la recolección fueron concentradas por centrifugación y se procedió al recuento de las mismas determinando una cantidad de 1000 a 1500 larvas/mL. El [CLAL] fue elegido porque era el de mayor concentración larvaria y en experimentos anteriores se determinó que la captación es dependiente de la cantidad de larvas presentes en el concentrado (9).

MÉTODO

El método se basa en la Técnica de Inhibición de la Agregación por Adhesión para detección del receptor CD44 soluble de hialuronato en suero humano (14) y la modificación empleada fue descrita en experiencias previas (9).
El sistema revelador fue una suspensión al 2% de eritrocitos Grupo O en medio enzimático de bromelina (15 min a 37 ºC). Se separó el plasma autólogo (PA) correspondiente a dichos hematíes.
Se preparó una suspensión de AH 1/128 y una suspensión en partes iguales de AH 1/64 y [CLAL] o [EA], según correspondió.
Para evaluar la cinética de captación de AH por el parásito, a los fines de hacer posible la unión del ácido hialurónico con el extracto parasitario o las larvas, se varió el tiempo de contacto de la mezcla AH- [CLAL] / [EA] desde un tiempo inicial (Tiempo 0) hasta 90 min a intervalos de 10 min (Tiempo 1, Tiempo 2,…Tiempo 9). La temperatura de contacto de la mezcla fue 4 ºC.
A continuación se prepararon los siguientes tubos de reacción, que se incubaron durante una hora a 4 ºC para hacer posible la captación de AH por el receptor de los eritrocitos.

Tubo 1: 50 µL de PA + 50 µL de PBS (bufferfosfato pH 7,4) + 50 µL GR 2%
Tubo 2: 50 µL de PA + 50 µL de AH (1/128) + 50 µL GR 2%
Tubo 3 (Tiempo 0,1,2, 3,..9): 50 µL de PA + 50 µL de AH- [CLAL] / [EA] + 50 µL GR 2%

Pasado este tiempo se procedió al conteo microscópico de eritrocitos libres, en una cámara de Neubahuer.
El conteo del tubo 1 correspondió al total de células libres de la experiencia. Los tubos 2 (AH 1/128) y 3 (AH-[CLAL] / [EA]), permitieron lavisualización microscópica de los eritrocitos adheridos por agregación por efecto del AH, y en ellos se contaron solamente los hematíes libres. Los conteos de ambos tubos indicaron el número de glóbulos que no fueron adheridos en las condiciones experimentales. Todos los conteos se hicieron por duplicado y se consideró el valor promedio.
La diferencia de conteo de células libres del tubo 1 con respecto a los tubos 2 y 3, indicó la cantidad de eritrocitos que se adhirieron por agregación en ambos casos (9).
Se calculó el Coeficiente Experimental de Adhesión Eritrocitaria por Ácido Hialurónico (CexpAdhEAH) que es el cociente entre los glóbulos rojos adheridos cuando el AH se pone en contacto con el parásito y los glóbulos rojos adheridos cuando el AH está en ausencia del parásito, en las mismas condiciones experimentales (9). Este coeficiente indica el porcentaje de células que se adhieren, después de la captación de AH por el parásito en relación a las adheridas por el AH total adicionado.
Cuando el parásito no capta AH, el coeficiente es igual o cercano a 1, porque habrá una cantidad igual o similar de células adheridas en los tubos 2 y 3. Por el contrario, el coeficiente será menor, a mayor cantidad de AH captado por A. lumbricoides.
Se determinó también el Índice Experimental de Captación Parasitaria de AH (IexpCPAH) definido como la cantidad de eritrocitos que se dejaron de adherir porque el parásito captó AH, referido al número total de eritrocitos, en las condiciones experimentales definidas (9). Este índice es una medida del consumo de AH por el parásito, en las condiciones experimentales establecidas, y se expresa como la cantidad de eritrocitos que se dejaron de adherir por acción del parásito en relación a la cantidad total de glóbulos rojos. Cuando mayor cantidad de AH capta el parásito, menor será el AH remanente, y menor la cantidad de glóbulos rojos adheridos (tubo 3), por lo que este índice aumenta.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para estudiar si existen diferencias significativas entre los tiempos de contacto de la mezcla AH- [CLAL] / [EA] en el análisis de ambas variables (CexpAdhEAH e IexpCPAH) se utilizaron las pruebas no paramétricas de Wilcoxon y la de Friedman con las correspondientes comparaciones múltiples (15).

Resultados

EXTRACTO DE A. LUMBRICOIDES

El estudio de la cinética de captación de AH por el extracto parasitario se realizó con 8 suspensiones globulares. Se observó que al tiempo 0 de contacto (T0), el extracto captó muy poco AH, tal como expresaron valores del CexpAdhEAH cercanos a la unidad para todas las experiencias realizadas. El análisis estadístico de los valores de este coeficiente a T0 mostró que no hay casi variación entre ellos y que son significativamente mayores a los obtenidos a los 10 min (T1) (p<0,01). La mediana y el rango intercuartil (RI) para el CexpAdhEAH a T0 fueron 0,96 y 0,04 respectivamente.
A los 10 min de contacto (T1), el parásito capta AH, provocando una significativa disminución del valor del CexpAdhEAH (mediana: 0,275, RI: 0,045) y si bien en los tiempos sucesivos esta captación va aumentando lentamente, el mayor salto del valor de CexpAdhEAH se produce en el T1.
El Test de Friedman permite concluir que los valores de los coeficientes difieren en al menos un tiempo (p<0,001). Las correspondientes comparaciones múltiples mostraron que no hay variaciones significativas entre los coeficientes de T1 respecto a los de T2, T3, T4 y T5, pero los valores de T1 difieren significativamente de los coeficientes de T6, T7, T8 y T9 (p < 0,05). Los coeficientes de los tiempos intermedios sólo presentan algunas diferencias significativas entre los más extremos.
Estos resultados mostraron que a los 10 min se produce una importante captación de AH por el parásito, que es similar a la producida en los 40 min siguientes (hasta T5), y que a partir de los 60 min esta captación presenta un pequeño incremento que se mantiene hasta los 90 min de la experiencia. La Tabla I muestra los valores del CexpAdhE ah y la Tabla II los resultados de los análisis estadísticos para esta variable obtenidos con el extracto de A. lumbricoides.

Tabla I. Estudio de la captación de ácido hialurónico por el parásito adulto: Valores de CexpAdhEAH

Tabla II. Estudio de la captación de ácido hialurónico por el parásito adulto: Estadísticas resumen y comparaciones múltiples para la variable CexpAdhEAH

Los valores de IexpCPAH también demostraron que al tiempo inicial de contacto, el AH captado por el parásito es muy poco y sólo puede agregar el 1 a 4% de los eritrocitos totales (mediana: 0,02; RI: 0,01). A T1 este índice aumentó mostrando una significativa agregación de los eritrocitos totales respecto de T0 (p<0,01), siendo el valor de la mediana a este tiempo 0,345 con un RI de 0,205. En la Figura 1, donde se muestra la distribución de los valores de IexpCPAH para los distintos tiempos estudiados, se puede observar la marcada diferencia del índice entre T0 y T1.


Figura 1. Captación de ácido hialurónico por el parásito adulto: Distribución de los valores de la variable IexpCPAH para los distintos tiempos estudiados

Los valores de IexpCPAH difieren en al menos uno de los 9 tiempos considerados (p<0,001). Los valores correspondientes a T1, T2, T3, T4 y T5 no difirieron entre sí (p>0,05). Los valores de T1 y T2 son significativamente menores respecto a T6, T7, T8 y T9 (p<0,05), no habiendo entre estos últimos diferencias significativas. Los valores de IexpCPAH se muestran en la Tabla III y los resultados estadísticos para esta variable, en la Tabla IV.

Tabla III. Estudio de la captación de ácido hialurónico por el parásito adulto: Valores de IexpCPAH

Tabla IV. Estudio de captación de ácido hialurónico por el parásito adulto: Estadísticas, resumen y comparaciones múltiples para la variable IexpCPAH

CONCENTRADO DE LARVAS

El estudio de la cinética de captación de AH por el concentrado de larvas se realizó con 8 suspensiones globulares. Los valores de CexpAdhEAH a T0 indicaron una pequeña captación de AH por las larvas (mediana: 0,96; RI: 0,01). Estos valores fueron significativamente mayores a los correspondientes a T1 (p<0,01). De la misma forma que se observó con el extracto del parásito adulto, a T1 se produjo el mayor salto del valor de estos coeficientes (mediana: 0,66; RI: 0,065). El Test de Friedman señaló que hay variaciones significativas entre los coeficientes para al menos uno de los nueve tiempos estudiados (p<0,001). Los valores de CexpAdhEAH para T1 no difieren de los correspondientes a los tiempos T2, T3, T4 y T5 (p>0,05), pero difieren con respecto a los valores de T6, T7, T8 y T9 (p<0,05), no habiendo entre estos últimos diferencias significativas. En la Figura 2 se observa la distribución de los valores de la variable CexpAdhEAH para los distintos tiempos estudiados.

 


Figura 2. Captación de ácido hialurónico por las larvas: Distribución de los valores de la variable CexpAdhEAH para los distintos tiempos estudiados

Los resultados demostraron que a los 10 min se produce el salto máximo del valor de CexpAdhEAH, que se mantiene durante 50 min, y pasado este tiempo el coeficiente aumenta levemente sin variaciones significativas hasta el tiempo final. La Tabla V muestra los valores de CexpAdhEAH, a los distintos tiempos estudiados con el concentrado de larvas y la Tabla VI los resultados estadísticos aplicados al estudio de esta variable.

Tabla V. Estudio de la captación de AH por las larvas: Valores de CexpAdhEAH

Tabla VI. Estudio de captación de AH por las larvas: Estadísticas resumen y comparaciones múltiples para la variable CexpAdhEAH

El valor de IexpCPAH mostró que a T0 las larvas captan el AH necesario para agregar el 1 a 3% de los eritrocitos totales de la experiencia (mediana: 0,02; RI: 0,015) y a T1 el valor del índice aumenta notablemente (mediana: 0,185; RI: 0,08; p<0,01).
El Test de Friedman demostró que los valores de IexpCPAH no son los mismos para los nueve tiempos considerados (p<0,001). Las comparaciones múltiples determinaron que no existen diferencias significativas entre los valores del índice del tiempo T1 con los tiempos T2, T3, T4 y T5, pero sí con respecto a los de T6, T7, T8 y T9 (p<0,05), que no difieren entre sí.
En la Tabla VII se observan los valores de IexpCPAH obtenidos en los distintos tiempos para las 8 suspensiones globulares. La Tabla VIII muestra los resultados del análisis estadístico de esta variable.

Tabla VII. Estudio de la captación de AH por las larvas: Valores del IexpCPAH

Tabla VIII. Estudio de captación de ácido hialurónico por las larvas: Estadísticas resumen y comparaciones múltiples para la variable IexpCPAH

Conclusiones

El estudio de los hidratos de carbono, cuyo auge fue a principios de este siglo, se vio obstaculizado por la falta de tecnología para caracterizar sus estructuras, en especial las cadenas de hidratos de carbono portadas por proteínas y lípidos, así como también por la ausencia de un código para predecir su biosíntesis. A finales de los años 80 surgen técnicas adaptadas al estudio de los glicanos, como son la resonancia magnética nuclear, la cromatografía líquida de alta presión y la electroforesis capilar, que permitieron entrever las funciones biológicas de los hidratos de carbono. La perspectiva tradicional de su función limitada al metabolismo y formación de estructuras celulares ha sido modificada radicalmente. En la actualidad se acepta que los hidratos de carbono, en la forma de glicanos, son portadores y moduladores de información intracelular y extracelular esencial, influyendo en la función y actividad de las moléculas que los portan y en las moléculas que interactúan con ellos, siendo este concepto aplicable a los vegetales, animales, hongos, protistas y moneras (16).
Desde esta nueva perspectiva que tienen las moléculas de naturaleza glucídica, el AH podría desempeñar un rol importante en la respuesta inmune frente a la infección parasitaria.
Experiencias previas han demostrado la captación de AH por parásitos adultos de A. lumbricoides, aunque se desconoce la naturaleza del receptor involucrado (7). Debido a la similitud existente entre los mecanismos biosintéticos de AH y de quitina (17), existe la posibilidad de que los receptores para quitina estén involucrados en esta captación. Los estudios realizados con larvas de este nematodo, que carecen de quitina, demostraron que los estadios larvales también tienen capacidad de unión a AH (8). Desde el punto de vista fisiológico, la demostración de que A. lumbricoides secuestra AH del medio, es importante de por sí y de manera independiente a la identificación de los receptores parasitarios involucrados en este hecho.
Se ha comunicado ampliamente la participación de AH en la migración y adhesividad celular (18); de hecho, se ha descrito que Plasmodium sp. lo utiliza para la cito-adherencia placentaria (19). A. lumbricoides no invade células, pero se podría especular que lo capta para adherirse o entrar en contacto, tal vez de manera efímera, a células implicadas en transducción de señales que le serían de alguna manera necesarias para la evasión inmunológica. También se sabe que el AH estimula el proceso
inflamatorio (5), que es una parte importante de la respuesta inmune innata, por lo que su captación por parte del parásito podría interferir en el desarrollo de la inflamación. Por otro lado, el AH es ligando de receptores que participan activamente en la respuesta inmune. Los principales son: CD44 y RHAMM.
CD44 está expresado en leucocitos, células epiteliales, células gliales, fibroblastos y células musculares. Es una molécula de adhesión, con acción quimiotáctica para linfocitos en el tejido linfoide de las mucosas (placas de Peyer), y se la relaciona a activación leucocitaria, linfopoyesis y metástasis tumoral (20). La unión de AH a CD44 actuaría como ruta de recaptación para la degradación lisosomal (5).
La proteína RHAMM se expresa en la mayoría de linfocitos B periféricos y se cree que está relacionada a su activación (20). La adhesión de AH a RHAMM induce la quimiotaxis (5). La captación de este glicano por el parásito podría significar una competencia con los receptores habituales del hospedero, a los fines de modificar y/o modular la respuesta inmune.
Por otro lado, se ha comunicado la activación de células dendríticas por AH a través de TLR4 (Receptor Toll 4) (6). Los TLR son los receptores principalmente involucrados en la activación a nivel intestinal. La activación de los TLR induce no sólo una reacción inflamatoria sino también inmunidad adquirida (6). Si bien las experiencias realizadas indicarían que los TLR no participarían en el reconocimiento de helmintos, tampoco se ha determinado claramente cuál sería el receptor involucrado en este reconocimiento (21), así como tampoco se han identificado aún los ligandos de todos los TLR y no se conoce cómo la activación de TLR se acompaña de expresión de distintos genes y respuestas biológicas (6).
Los resultados previos obtenidos al estudiar la captación de AH por los concentrados larvales utilizando la metodología empleada en esta experiencia, demostraron claramente que a mayor cantidad de larvas, mayor es la cantidad de AH secuestrado por ellas. Los análisis estadísticos concluyeron que existen diferencias significativas en los valores de CexpAdhEAH y de IexpCPAH por efecto de la concentración de larvas (9).
En ese estudio se pudo concluir también que la captación de AH por los parásitos adultos varía con los distintos extractos, tal como demostraron los valores de CexpAdhEAH y de IexpCPAH (9). Todos los resultados se correlacionaron con los observados aplicando la técnica de Inhibición de la Agregación por Adhesión para detección del Receptor CD44 soluble de hialuronato en suero humano (9)
La cinética de captación de AH por A. lumbricoides permitió observar que al tiempo inicial de contacto, el parásito, tanto en su fase adulta como larval, une muy poca cantidad de este polisacárido. A T0 los CexpAdhEAH indicaron que sólo se produjo la adhesión de un valor cercano al 96% de los eritrocitos adheridos en ausencia del parásito ([EA]: mediana 0,96; RI 0,04; [CLAL]: mediana: 0,96; RI: 0,01). Los valores de IexpCPAH mostraron que esta captación inicial es responsable de que sólo el 1 a 4% de los eritrocitos totales de la experiencia se dejen de adherir por acción parasitaria ([EA]: mediana: 0,02; RI: 0,01; [CLAL]: mediana: 0,02; RI: 0,015).
Después de transcurridos los primeros 10 minutos, la captación para ambos estadios parasitarios es significativa, y se traduce en el mayor salto de valores de coeficientes e índices de todos los tiempos estudiados.
En el caso del parásito adulto el valor del CexpAdhEAH indica que la captación deja un remanente de AH libre como para adherir el 27% de los eritrocitos adheridos en ausencia del nematodo (mediana: 0,275, RI: 0,045), así como también el IexpCPAH revela que el parásito consume el AH necesario para adherir el 35% de los eritrocitos totales de la experiencia (mediana: 0,345; RI 0,205).
En el caso de las larvas, a T1 el remanente de AH luego de la captación adhiere el 66% de los eritrocitos adheridos en ausencia del parásito (mediana: 0,66; RI: 0,065) y el IexpCPAH aumenta notablemente con respecto a T0 mostrando que la captación producida por el parásito deja de adherir el 19% de los eritrocitos totales (mediana: 0,185; RI: 0,08; p<0,01).
El Test de Friedman concluye que tanto con el parasito adulto como con las larvas, no se producen diferencias significativas en los valores de CexpAdhEAH e IexpCPAH por 50 minutos, indicando que no hay variaciones en la captación de AH por el parásito. Recién a la hora de contacto de la mezcla AH-[EA] / [CLAL], hay un leve aumento de captación que se mantiene hasta los 90 minutos finales.
Los resultados de esta experiencia demuestran que in vitro, a los 10 min de contacto, A. lumbricoides realiza la mayor captación, por lo que se sugiere que in vivo sería capaz de unir AH rápidamente a los fines de modular la respuesta inmune.

CORRESPONDENCIA

DRA. PATRICIA PONCE DE LEÓN
Laboratorio de Parasitología. Dpto. de Microbiología
Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas
Suipacha 531, 2000 ROSARIO, Argentina
E-mail
: tefu1958@hotmail.com

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Aceptado para su publicación el 3 de julio de 2009