MICROBIOLOGÍA

Etiología bacteriana de la diarrea aguda en pacientes pediátricos*

Bacterial etiology of acute diarrhea in pediatric patients

Silvina Giugno¹, Sebastián Oderiz¹

1.Bioquímico.

* Sala de Microbiología, Hospital Interzonal de Agudos Especializado en Pediatría “Superiora Sor Maria Ludovica”. Calle 14 N° 1631 (1900) La Plata, Buenos Aires, Argentina

Resumen

La diarrea aguda es una causa importante de morbilidad y mortalidad en países en desarrollo. Sólo requiere tratamiento antimicrobiano en situaciones puntuales y el uso adecuado de los mismos depende del conocimiento previo de la epidemiología local. Para conocer estos parámetros se estudiaron en forma retrospectiva los resultados bacteriológicos de 7.075 muestras de materia fecal de niños ambulatorios hasta 15 años, en el período 2001-2003, atendidos en el Hospital de Niños de La Plata. Se aislaron 1.221 bacterias enteropatógenas (17,26%). Los patógenos identificados por métodos estándar fueron: Shigella flexneri(27%), Shigella sonnei(21,2%), Campylobacterspp. (30,1%), Aeromonas spp.(9,4%), Salmonella spp. (5,4%), Escheríchia coli enteropatógena (5,7%), Escheríchia coli enteroinvasiva (0,9%) y Escheríchia coliO157 (0,4%). No se aislaron cepas de Shigella dysenteriae, Shigella boydii ni Yersinia spp. Las cepas de Shigella flexneri presentaron una alta resistencia: ampicilina (92,4%, 89,2% y 91,9%), cotrimoxazol (51,5%, 50% y 44,4%) y cloranfenicol (73,8%, 85,9% y 79,2%) en 2001, 2002 y 2003, respectivamente. En el caso de Shigella sonnei, la resistencia a ampicilina fue menor (39,4%, 20,6% y 12,9%), la resistencia a cotrimoxazol fue similar (60,6%, 54,3% y 38,7%) y para cloranfenicol mucho menor aún (6%, 2,9% y 3,3%) en los mismos años. No se aislaron cepas resistentes a ciprofloxacina, nitrofuranos ni cefalosporinas de tercera generación en el período de estudio.

Palabras clave: Diarrea; Bacterias; Niños; Resistencia

Summary

Acute diarrhea is an important cause of morbidity and mortality in developing countries, and in some cases, it requires antimicrobial therapy .The use of antibiotics needs a previous knowledge of local epidemiology. In order to know these parameters, the result of enteropathogenic bacteria isolated from 7.075 fecal samples from ambulatory patients up to 15 years old, assisted at the Hospital de Niños de La Plata from 2001 to 2003 was retrospectively studied. A total of 1,221 enteropathogenic bacteria were isolated (17.26%). The pathogens identified by standard methods were Shigella flexneri (27%), Shigella sonnei (21.2%), Campylobacter spp.(30.1%),
Aeromonas spp.(9.4%), Salmonella spp. (5.4%), enteropathogenic Escherichia coli ( 5.7% ), enteroinvasive Escherichia coli (0.9%) and Escherichia coli 0157 (0.4%). Strains from Shigella dysenteriae, Shigella boydii and Yersinia spp were not isolated in this study. Shigella flexneri strains were resistant to ampicillin (92.4%, 89.2%, 91.9%), cotrimoxazole (51.5%, 50%, 44%) and chloramphenicol (73.8%, 85.9%, 79.2%) for 2001, 2002 and 2003 respectively. Shigella sonnei strains were resistant to ampicillin (39.4%, 20.6%,12.9%), cotrimoxazole (60.6%, 54.3% 38.7%) and chloramphenicol (6%, 2.9%, 3.3%) for each year. Strains resistant to ciprofloxacin, nitrofurans and third generation cephalosporins were not isolated.

Keywords: Diarrhea; Bacteria; Children; Resistance

Introducción

La diarrea aguda es una de las causas más importantes de morbilidad y mortalidad en los países en desarrollo. Por esta causa mueren más de 2 millones de personas en el mundo por año, la mayoría niños, debido a una alta susceptibilidad y mayor exposición a los agentes causales. La infección entérica puede ser atribuida a distintos agentes infecciosos y la epidemiología depende del huésped, estación del año, exposición, etc. El agua contaminada es una importante fuente y reservorio de agentes causales de diarrea en los países en desarrollo. En el mundo más de 1.100 millones de personas no tiene acceso a fuentes de agua segura y 2.400 millones no tienen servicios sanitarios básicos (1)(2). En Argentina más de 8 millones (23%) de habitantes no tienen red de agua potable, mientras que más de 21 millones (57,5%) no cuentan con desagües cloacales (3). Existen también otras fuentes de infección y vías de transmisión asociadas a la diseminación de los enteropatógenos, incluyendo el consumo de otros alimentos contaminados además del agua y la transmisión persona a persona. El tratamiento de rehidratación en la diarrea grave se debe instaurar rápidamente, pero en ciertas ocasiones se necesita además terapia antimicrobiana por la gravedad de la enfermedad o el riesgo de complicaciones, para lo cual es necesario conocer la epidemiología local y los perfiles de resistencia (4). La utilización de sales de rehidratación oral adoptada por el Fondo de las Naciones Unidas para la Infancia (UNICEF) y la Organización Mundial de la Salud en los años ´70 ha logrado una importante disminución en las tasas de mortalidad, evitando más de un millón de muertes por esta patología en la última década (5).
El objetivo de los autores fue determinar la incidencia de los enteropatógenos bacterianos que producen diarrea aguda en niños atendidos en forma ambulatoria en el Hospital de Niños “Sup. Sor María Ludovica” de La Plata, relacionándolos con el género, edad, variación estacional y la reacción inflamatoria. Además, se evaluaron los perfiles de resistencia de las cepas aisladas de Shigella por ser uno de los agentes causales de infección entérica donde el tratamiento antimicrobiano trae beneficios clínicos y epidemiológicos.
Las medidas preventivas para la enfermedad diarreica aguda son la higiene personal, principalmente el lavado de manos, el acceso a agua segura, la eliminación sanitaria de excretas y el acceso a alimentos de calidad microbiológica.

Materiales y Métodos

Se evaluaron en forma retrospectiva los resultados de los coprocultivos realizados entre enero de 2001 y diciembre de 2003. Se estudiaron 7.075 muestras de materia fecal (2.519 en el año 2001, 2.246 en 2002 y 2.310 en 2003) de niños con diagnóstico de diarrea aguda (una muestra por paciente), asistidos en forma ambulatoria en el Hospital de Niños “Sup. Sor María Ludovica”, La Plata, Argentina. Las edades de los pacientes estaban comprendidas entre 0 y 15 años. Las muestras de heces se recogieron por evacuación espontánea en un recipiente estéril y se procesaron dentro de las 2 horas. Cuando ello no fue posible se conservaron en medio de transporte de Cary-Blair a 4 ºC hasta su procesamiento. Las muestras fueron examinadas en fresco y se les realizó una coloración con violeta de genciana durante 3 minutos para la observación de leucocitos, hematíes y formas compatibles con Campylobacter. En todos los pacientes se investigó la presencia de Shigella spp., Salmonella spp., Escherichia coli enteroinvasiva (ECEI), Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) serotipo O157, Yersinia spp., Campylobacter spp. y Aeromonas spp. según métodos bioquímicos convencionales (1)(6-8). No se incluyeron en los resultados la presencia de virus y no se realizaron estudios parasitológicos porque las muestras no se recolectaron para tal fin.
Todas las muestras de materia fecal fueron sembradas en agar EMB (eosina-azul de metileno), agar Salmonella-Shigella, agar cefsulodine-irgasan-novobiocina y agar MacConkey con sorbitol e incubadas a 35 ºC bajo condiciones aeróbicas por 18 a 24 h. Además, los especímenes fueron sembrados en caldo Selenito (medio para el enriquecimiento de Salmonella spp.) y después de 18 h de incubación a 35 ºC se repicó en agar salmonella-Shigella. Para la detección de Campylobacter spp., todas las muestras fueron sembradas en agar Skirrow e incubadas a 42 ºC bajo condiciones de microaerobiosis. En menores de 5 años se investigó la presencia de Escherichia coli enteropatógena (ECEP) serotipos O26, O55, O86, O111, O119, O125, O126, O127 y O128 utilizando suero nonavalente (Diagnostics Pasteur-Francia). Se determinaron los serogrupos de Shigella por la técnica de aglutinación en portaobjetos utilizando antisueros polivalentes (Difco, EE.UU). Para el serotipo O157 de ECEH se utilizó suero monovalente provisto por el Instituto Nacional de Producción de Biológicos-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. La serotipificación de los aislamientos de Shigella spp. y Salmonella spp y la confirmación fenotípica de ECEI se realizó en el INEI-ANLIS ”Dr. Carlos G. Malbrán”. La sensibilidad a los antimicrobianos se evaluó mediante el método de difusión con discos según recomendaciones del CLSI (9). Los antimicrobianos ensayados fueron: ampicilina, ciprofloxacina, cloranfenicol, cotrimoxazol, nitrofurantoina y cefpodoxima.

Resultados

Durante el estudio se aislaron 1.221 (17,3%) bacterias enteropatógenas a partir de 1.188 pacientes. En 1.155 (97,2%) pacientes se aisló un solo germen y en 33 (2,8%) de ellos se aislaron dos gérmenes. De los 1.188 pacientes se obtuvieron datos de género en 1.099, siendo 567 niños (51,6%). La distribución anual de aislamientos se observa en la Tabla I. De los 33 pacientes donde se aislaron 2 tipos de gérmenes, en 15 (45,4%) se aisló Shigella spp. y Campylobacter spp, en 9 (27,3%) Shigella spp. y Aeromonas spp., en 6 (18,2%) Campylobacter spp. y Aeromonas spp., en 2 (6,1%) Campylobacter spp. y ECEP y en un caso (3,0%) Campylobacter spp. y Salmonella spp. Durante el período de estudio, no se obtuvieron aislamientos de Yersinia spp, Shigella dysenteriae ni Shigella boydii.

Tabla I. Distribución anual de enteropatógenos bacterianos (n = 1.221) aislados de materia fecal. Período 2001-2003

Se determinó el serotipo de 173 aislamientos de Shigella flexneri, de las cuales 146 correspondieron al sero-tipo 2 (82,5%), 13 al serotipo 1 (7,3%), 12 al serotipo 3 (6,8%) y 2 al serotipo 6 (3,4%). Se serotipificaron 49 de las 64 cepas de Salmonella spp. 18 Salmonella Enteritidis (36,7%), 11 Salmonella Typhimurium (22,4%), 8 Salmonella Infantis (16,3%), 4 Salmonella Javiana (8,2%), 2 Salmonella Give (4,1%), 2 Salmonella Newport (4,1%), 1 Salmonella Typhi (2%), 1 Salmonella Derby (2%), 1 Salmonella Chester (2%) y 1 Salmonella Montevideo (2%). La distribución por edad de los pacientes con cultivos positivos se observa en la Tabla II.

Tabla II. Distribución de enteropatógenos bacterianos (n=1.221) aislados de materia fecal de pacientes ambulatorios pediátricos de acuerdo a la edad. Período 2001-2003

En la Figura 1 se muestra la frecuencia estacional (2001-2003).

Figura 1. Frecuencia estacional acumulada de los enteropatógenos bacterianos en el período 2001-2003 (n=1.221). 1:Sh. flexneri, 2:Sh. sonnei, 3: Campylobacter spp., 4: Salmonella spp., 5: Aeromonas spp., 6: ECEP, 7: ECEI, 8: ECEH.

La reacción inflamatoria se evaluó mediante observación microscópica. La presencia de leucocitos y hematíes (positivo, más de 5 elementos por campo de 40X) relacionada con cada uno de los enteropatógenos estudiados se ve en la Figura 2.

Figura 2. Presencia de reacción inflamatoria en muestras de materia fecal donde se aisló un solo germen (n=1.155). 1: Sh. flexneri, 2: Sh. sonnei, 3: Campylobacter spp., 4: Salmonella spp., 5: Aeromonas spp., 6: ECEP, 7: ECEI.

El perfil de resistencia en los aislamientos de S. flexneri en los años 2001(n=66), 2002 (n=65) y 2003 (n=74) fue: ampicilina 92,4%, 89,2% y 91,9%, cotrimoxazol 51,5%, 50% y 44,4% y cloranfenicol 73,8%, 85,9% y 79,2% respectivamente. No hubo resistencia para ciprofloxacina, nitrofuranos ni a cefalosporinas de tercera generación.
Para los aislamientos de S. sonnei en los años 2001 (n=104), 2002 (n=34) y 2003 (n=31) la resistencia hallada fue: ampicilina 39,4%, 20,6% y 12,9%, cotrimoxazol 60,6%, 54,3% y 38,7% y cloranfenicol 6%, 2,9% y 3,3%. No hubo resistencia a ciprofloxacina, nitrofuranos y cefalosporinas de tercera generación. El perfil de resistencia en los aislamientos de Salmonella spp. en los años 2001 (n=28), 2002 (n=20) y 2003 (n=16) fue: ampicilina 27,3%, 37,1% y 23,1%, nitrofuranos 32%, 42,9%, 23,1%, cotrimoxazol 9,1%, 0% y 0% respectivamente. No se aislaron cepas resistentes a cefalosporinas de tercera generación, ciprofloxacina ni a cloranfenicol.

Discusión y Conclusiones

La diarrea aguda es principalmente una enfermedad de infantes y niños pequeños. El síndrome diarreico agudo puede ser atribuido a muchos enteropatógenos, sin embargo los distintos patógenos pueden mostrar diferentes patrones epidemiológicos de acuerdo a la edad del huésped, estación del año y localización geográfica.
La tasa global de recuperación en esta población fue de 17,3% con un ligero predominio en varones, similarmente a lo referido en Brasil, Grecia e Irán (10-12). Cuando la búsqueda de agentes etiológicos de diarrea incorpora virus, parásitos y otras categorías de E. coli diarreogénicos o más de una muestra de materia fecal la recuperación puede alcanzar valores mayores al 40% (13).
La shigelosis est á distribuida en todo el mundo, pero es endémica en países tropicales y de clima templado con mayor incidencia en verano, y representa una importante causa de morbimortalidad en los países en desarrollo (14)(15). El número de episodios de diarrea causados por Shigella spp. en el mundo se estima en 164,7 millones de casos por año de los cuales 163,2 millones se presentan en países en desarrollo (con 1,1 millones de muertes anuales) (16). En este estudio, Shigella spp. fue el agente causal de diarrea bacteriana más frecuente en los niños ambulatorios con el hallazgo de leucocitos en más del 85% de los casos. S. flexneri fue más prevalente que S.sonnei en los años 2002 y 2003 en coincidencia con lo descrito en otros países en desarrollo (7). No obstante en Irán, Farshad et al., describieron en un estudio de 719 muestras de heces una mayor frecuencia de S. sonnei con respecto a S. flexneri (74,4% y 19,5% respectivamente) en coincidencia con lo observado en el año 2001 (17). En este estudio los niños más afectados por Shigella spp. fueron los mayores de 2 años con una alta frecuencia en los meses cálidos como ocurre en Chile (18). El subtipo 2 de S. flexneri fue el más frecuentemente aislado (82,5%), hecho similar a lo observado en Brasil y Chile (18)(19). Cuatro serotipos de Shigella (S. sonnei, S. flexneri 2, 1 y 3) dieron cuenta de la mayoría de los casos, como ocurre desde principios de los ´90 (datos no mostrados), lo cual puede ser de suma importancia para el desarrollo y/o la utilización de una vacuna en áreas de alta endemicidad.
La infección por Campylobacter spp. es hiperendémica en países en desarrollo. La alta tasa de recuperación en países desarrollados (entre el 5 y 20%) demuestra que el control de esta infección es un problema a nivel mundial (19)(20). Las principales fuentes de infección son el agua y los alimentos contaminados. Se los aísla a lo largo de todo el año especialmente en primavera (12)(19) y los niños menores de 23 meses son el principal grupo afectado (54,1%) como se ha informado en otros países en desarrollo (20)(21). Se ve en los resultados que la diarrea causada por Campylobacter puede ser acuosa o acompañada de leucocitos, reflejo de su mecanismo de patogenicidad.
En países en desarrollo, Shigella y Campylobacter son aislados con relativa frecuencia asociados con otros gérmenes o entre ellos. En algunos estudios cerca de la mitad de los pacientes con enteritis por Campylobacter tienen asociado otro patógeno, hecho no observado en países desarrollados (20).
Las especies del género Aeromonas son consideradas habitantes de ambientes acuáticos no salinizados, por lo que son importantes en el control de calidad del agua a beber y en los últimos años han adquirido importancia como patógenos intestinales. La infección es usualmente autolimitada, pero puede requerir hospitalización debido a la deshidratación. En este estudio se ha obtenido un 9,4% de recuperación, especialmente en menores de 4 años y en los meses de verano y otoño con ausencia de reacción inflamatoria en la mayoría de los casos (62,6%). En un estudio publicado por Mikhail et al. (22), se aisló en un 3,3% de los casos con diarrea y no en los controles, lo que reafirma su importancia como agente diarreogénico. Las proteínas producidas por este germen móvil incluyen: hemolisinas, citotoxinas y enterotoxinas, que son considerados como los factores de virulencia asociados al síndrome diarreico (23)(24).
ECEP sigue siendo una importante causa de diarrea acuosa y no invasiva, en particular en países en desarrollo, afectando fundamentalmente a lactantes y niños pequeños (menores de 2 años) (7)(25). Se la aísla a lo largo de todo el año como se ve en la Figura 1 con un ligero aumento en otoño, provocando un cuadro diarreico prolongado, con vómitos y fiebre y se lo ha asociado a diarrea crónica (25).
La salmonelosis es una zoonosis de distribución mundial. Es una enfermedad fundamentalmente de origen alimentario cuya tasa de incidencia es mayor en lactantes y en niños de corta edad. Salmonella spp es un patógeno de baja recuperación (5,2%), a diferencia de lo que ocurre en Brasil, donde este germen ocupa el tercer lugar en frecuencia (10) y en países de Europa donde es una de las principales causas de diarrea (11). La población más afectada fue la de niños mayores de 4 años y su recuperación aumentó en los meses cálidos, con reacción inflamatoria en el 50,8% de los casos. Distintos serotipos fueron identificados, Salmonella enterica serovar Enteritidis (36,7%) fue la serovariedad que se aisló con mayor frecuencia, como ocurre en la mayoría de los países del mundo (11)(19).
Fue muy baja la recuperación de ECEI y ECEH O157 por los métodos convencionales de cultivo en coincidencia con lo publicado por Medeiro, et al. en Brasil (19). Con respecto a otras categorías de E. coli diarreogénicos solamente se puede realizar su estudio por biología molecular o cultivo celular y no se pudieron investigar en este laboratorio.
Ni la microscopia para la detección de leucocitos ni los ensayos de sangre oculta, solos o combinados, permiten predecir la presencia de patógenos entéricos o la selección de muestras para cultivo (26). Esto es debido a que los gérmenes enteropatógenos pueden actuar mediante mecanismos de invasión (que se manifiestan en la presencia de leucocitos en materia fecal) y/o producción de toxinas (con presencia o ausencia de leucocitos en materia fecal). Por lo tanto, como se observa en la Figura 2, la ausencia de leucocitos en materia fecal, no excluye la presencia de ninguna bacteria enteropatógena (18)(19)(27).
La terapia antimicrobiana en el caso de las infecciones por Shigella spp. disminuye la duración de los síntomas y la excreción del microorganismo, pero el uso inadecuado aumenta el riesgo de desarrollar resistencia a los antibióticos (28). La alta resistencia a cotrimoxazol, ampicilina y cloranfenicol observada en los aislamientos de S. flexneri restringe las opciones orales al momento de tomar decisiones terapéuticas. Las cefalosporinas de tercera generación permanecen altamente activas contra Shigella, sin embargo deben ser reservadas para el tratamiento de casos graves de shigellosis debidos a cepas multirresistentes. La mayor sensibilidad de S. son fenómenos observados en otros lugares del mundo. Una probable explicación es la desaparición y reemergencia de clones específicos (28)(29). Esta posibilidad debería ser confirmada mediante la realización de estudios de epidemiología molecular que permitan determinar la relación genética entre los aislamientos con distinto perfil de resistencia. En este estudio no se aislaron cepas de Shigella spp resistentes a ciprofloxacina como ocurre en otros países (28-31) ni a cefalosporinas de tercera generación como ocurrió en el norte argentino (32). En el caso de salmonelosis no tíficas, no se ha demostrado la efectividad de la terapia antimicrobiana; al contrario es común la portación ulterior en los pacientes medicados. De todos modos, en este trabajo se realizó la vigilancia y se observó un bajo nivel de resistencia a los antibióticos comúnmente usados en casos de diarrea (11)(22).
El presente estudio retrospectivo da información de la prevalencia de bacterias enteropatógenas recuperadas en pacientes con diarrea aguda atendidos en este Hospital. Estos datos son muy importantes para la toma de medidas terapéuticas empíricas adecuadas. Nuevos estudios prospectivos se requieren para definir la epidemiología de la diarrea incluyendo las distintas categorías de Escherichia coli diarreogénicos, virus y parásitos

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a las Dras. Inés Caffer y Marta Rivas (ANLIS-INEI “Carlos G. Malbrán”. Buenos Aires, Argentina), por su apoyo técnico y colaboración y a la Dra. Silvia Gonzalez Ayala (Hospital Sor Maria Ludovica) por la corrección del manuscrito.

CORRESPONDENCIA.
DRA. SILVINA GIUGNO
Sala de Microbiología, Hospital Interzonal de Agudos
Especializado en Pediatría “Superiora Sor Maria Ludovica”
Calle 14 nº 16311900 LA PLATA, Buenos Aires, Argentina
E-mail: silvinagiugno@ciudad.com.ar

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Aceptado para su publicación el 9 de febrero de 2010