EDITORIAL

Proteómica Clínica

Las separaciones de las proteínas del suero humano han evolucionado tecnológicamente con la aplicación de la electroforesis bidimensional, por isoelectroenfoque y posterior separación ortogonal en gradiente de concentración empleando geles de policrilamida, los cuales generan un filtro molecular que permite separar familias de proteínas de punto isoeléctrico y masa molecular de similares características.
El empleo posterior sobre este mapa proteico de técnicas de fraccionamiento por ionización con láser y análisis por espectroscopía de masas para la identificación por relación con la base de datos, conforman un gran aporte al conocimiento de la proteómica del suero y líquidos biológicos humanos que se agrupan en lo que se llama proteómica clínica.
Este nuevo enfoque relaciona los mapas proteicos-bidimensionales con cuadros clínicos diversos y ha inducido la búsqueda de biomarcadores proteicos relacionados con la etiología y manifestaciones clínicas, que en su gran mayoría están vinculadas a alteraciones del mapa proteico del suero humano normal.
En el año 2008, en Cambridge – Massachusetts, tuvo lugar una reunión propiciada por el Clinical Proteomic Technology Assessment for Cancer (CPTAC) compuesta por miembros del National for Cancer (CPTC). Esta reunión fue apoyada por el National Cancer Institute NCI y por la FDA (Food and Drug Administration) y la Interagency Oncolology Task Force (IOTF), a los efectos de llevar a cabo la identificación y validación analíticas requeridas en la tecnología proteómica, en especial la vinculada a la espectrometría de masas y a la basada en los ensayos múltiples conocidos como ensayos multiplex (microarrays) o multi-micro ensayos empleando electroforesis capilar.
Se pretende encontrar consenso a los efectos de validar las nuevas tecnologías para el estudio de las próximas generaciones de reactivos a nivel molecular con el objetivo del descubrimiento, verificación y validación de biomarcadores en el estudio del cáncer.
El desarrollo de nuevas plataformas basadas en el complejo espectrometría de masas/ensayos múltiples por inmunoafinidad, todavía no se encuentra bien establecido, teniendo en cuenta que la FDA aún no ha aprobado el detector cuadrupolar de la espectrometría de masas por considerar que la plataforma de software no reúne los requisitos de calidad exigidos para la validación.
Con respecto a la Norma 201 (h) de la Federal Food, Drugs and Cosmetic para diagnóstico "in vitro", que involucra a los "reactivos-instrumentos", la FDA considera su accionar como regulador en los dispositivos médicos para uso "en el diagnóstico de la enfermedad u otras condiciones, en la cura, mitigación, tratamiento o prevención de la enfermedad en el hombre y animales".

Discusión de casos

El sponsor (Grupo constituido por investigadores de un ámbito empresario que tendrá a su cargo el aporte económico y científico sobre la investigación analítica y su correlación con las alteraciones normales producida por la enfermedad) provee los estudios de los casos clínicos referidos a los datos clínicos y a la performance analítica de las determinaciones, considerando cuidadosamente los elementos necesarios de la prueba, condiciones para su uso y los parámetros de la interpretación.
Deben analizarse los niveles de riesgo que requiere una validación para la prueba que se desea usar, considerando las exigencias de la FDA. Aún cuando la FDA no especifica los requerimientos referidos a los métodos para generar biomarcadores, es necesario conocer el rol de los analitos en el estado de salud y enfermedad.
El estudio requiere un procedimiento con su correspondiente análisis estadístico para demostrar la seguridad y efectividad del plan que debe ser consultado previamente con el organismo.

Requerimientos sobre calidad

La FDA requiere según el sub-capítulo H Part. 820 normas de calidad para la plataforma de la instrumentación, reactivos necesarios para su uso y otros ítems relacionados con la prueba y puede exigir control de calidad para otros requerimientos de otros dispositivos.

Algoritmos de software

La FDA requiere que los algoritmos de software sean incluidos en las pruebas para la interpretación de los datos y deben ser establecidos antes, y en caso de modificaciones pueden invalidar los datos.

Sponsors

No es siempre necesario que el sponsor suministre detalles o explicite los mecanismos de análisis y evaluación si demuestra que el algoritmo empleado es realizado apropiadamente y determinado caso por caso. Se debe asegurar al sponsor que no será hecho público por la FDA.
La validación clínica de una prueba es crítica para determinados ensayos y su desarrollo y requerimientos de validación exigen ensayos especiales y, por consiguiente, un análisis imparcial.

Etapa preanalítica

Los factores que intervienen son muy importantes cuando están relacionados con la muestra y, muy especialmente, cuando son inestables, pues los aspectos preanalíticos están relacionados con la etapa clínica y preclínica. Por otra parte, pueden afectar la variabilidad de los resultados, el límites de detección y la cuantificación.

Seguridad

La FDA requiere seguridad de las pruebas cuando difieren de las normas de Estandarización de los Organismos Internaciones y definen la seguridad de las pruebas con un riesgo inaceptable, incluyendo la seguridad, la obtención de datos falsos positivos o negativos, y también aquellas pruebas invasivas que pudieren dañar al paciente (por ej. colección, invasión con espécimen, o nivel de radiación durante el procedimiento diagnóstico).

Controles

Se requieren controles de procesos internos y externos para determinar la performance de fabricaciones antes de su envío al mercado.
Las pruebas de estandarización requieren el empleo de estándares internacionales que definen la calidad, trazabilidad y control del material.
En la performance clínica de la prueba, el sponsor generalmente suministra datos de ella, de su aplicación a una población, estableciéndose si la misma es adecuada. Posteriormente, la evaluación clínica se extiende amúltiples laboratorios con un alto nivel analítico y luego de un examen estadístico minucioso es crítica la discusión científica con la FDA y el sponsor.
Cuando el sponsor busca la aprobación de una prueba en la que se empleen diferentes instrumentos y fabricantes, deberá indicar la performance de los distintos instrumentos y cuando existan dispositivos complejos fabricados por distintas empresas deberán acompañar los límites normales de su uso y de cada plataforma.

Diversidad analítica

Cuando los reactivos pueden ser usados para diferentes pruebas deberán ser evaluados en cada una con un estudio que acompañe los estudios de validación clínica y analítica debiendo acreditar lote a lote para cada prueba y la performance de la variación.

Interferencias

La reactividad cruzada entre el analito y otras sustancias, muy frecuente en la valoración de proteínas, requiere discusiones adicionales entre los expertos en proteómica y la comunidad regulatoria. Por ejemplo, en la valoración de proteínas con diversas isoformas, producidas por la incorporación de glucanos, es esencial determinar en qué situación esos marcadores pueden ser usados ante interferencias relevantes que deben ser probadas.
Los datos deben ser provistos mostrando la performance del instrumento empleado para una prueba en particular. La FDA admite listas maestras para establecer la performance de los instrumentos, la cual permite su aplicación para nuevas pruebas y no requiere ningún instrumento específico.

Elección del blanco de reactivo analito cero

Las pruebas requieren para exámenes cuantitativos la performance para bajos niveles y es muy importante usar muestras sin analito. Por lo tanto, en las pruebas para el análisis proteómico es necesario considerar con la FDA la discusión para algunos casos en los que el análisis del plasma con el analito cero es prácticamente no disponible en una matriz apropiada.
Resulta, por consiguiente, muy importante determinar en una muestra apropiada, matriz y el uso de la muestra analito cero en las pruebas randomizadas, pues el efecto matriz puede tener un impacto enorme en la exactitud y cuantificación de las muestras.

Valoración de proteínas

Numerosos tipos de pruebas con proteínas han sido aprobadas por la FDA en el pasado, como inmunoensayos tipo sandwich incluyendo ELISA y los ensayos basados en inmunoensayos múltiplex que han resultado seguros y efectivos hasta el presente.

Estándar interno

La normalización puede presentar otros problemas en el análisis empleando multimarcadores como el Manual Print análisis que incluye estándar interno de referencia.

Recolección de muestras

Las pruebas prospectivas, los estudios y recolección de muestras pueden ser necesarios para excluir prejuicio y la recolección de las muestras, su tiempo de conservación y procesamiento pueden permitir al sponsor demostrar que las condiciones de almacenamiento y otros factores relevantes han sido controlados.
De todo lo expuesto surge que la agencia prefiere conocer las bases científicas de los temas relevantes y la justificación de las decisiones para facilitar la aprobación. Se recomienda que antes de la validación clínica y analítica de exámenes complejos el sponsor consulte con la FDA. Las conclusiones de esta reunión han de permitir orientar y fijar las bases para la comunidad proteómica para explorar la validación analítica del panel de marcadores proteicos en cualquier nueva tecnología.
Por ejemplo, en publicaciones recientes se ha demostrado que las reacciones para monitoreo múltiple, las reacciones asociadas con dilución isotópica unida a la espectrometría de masas, han resultado ser un camino para cuantificar rápidamente biomarcadores proteicos en sangre.
Los participantes de la reunión en Cambridge también concluyen y recomiendan que las publicaciones de la FDA se efectúen en papel (White paper) especialmente destinadas a los investigadores de la comunidad clínica.

DR. Juan Miguel Castagnino
Director
Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana

1. Anderson NL. The Clinical Plasma Proteome: A Survey of Clinical Assays for Proteins in Plasma and Serum. Clin Chem 2010; 56: 177-85.        [ Links ]

2. Ellington AA, Kullo JI, Bailey RK, Klee GG. Antibody-Based Protein Multiplex Platforms: Technical and Operational Challenges. Clin Chem 2010; 56: 186-93.        [ Links ]