BIOQUÍMICA CLÍNICA

Extracción de metabolitos ácidos durante el análisis de catecolaminas en tejido cerebral de ratas

Extraction of acid metabolites during the analysis of catecholamines in rat brain tissue

Nelson Araujo ^{1 a,b}, Estela Gotberg ^{2 c}

1. Magíster en Química.
2. Doctor en Ciencias Fisiológicas.

^a Laboratorio de Química de Proteínas, Departamento de Biología Celular, Universidad Simón Bolívar, Venezuela, Apartado Postal 89000.
^b Postgrado en Química, Coordinación de Química, Universidad Simón Bolívar, Venezuela, Apartado Postal 89000.
^c Laboratorio de Electrofisiología y Neuroquímica, Cátedra de Fisiología, Escuela de Medicina José María Vargas, Universidad Central de Venezuela, Venezuela.

Resumen

A través del método de equilibrio batch se comparó la adsorción de las catecolaminas Dopamina (DA), Noradrenalina (NA) y Adrenalina (A), y de los metabolitos ácido dihidroxifenilacético (Dopac) y ácido indolacético (5- HIAA) en las fases sólidas octadecil (C₁₈) hidrofóbica, diol (C_Diol) hidrofílica y de intercambio catiónico débil (WCX). En la fase sólida WCX a pH 4,0 se observó un 78% de adsorción de catecolaminas y 68% de adsorción de Dopac. Las isotermas de adsorción de las catecolaminas en la fase WCX son de tipo Langmuir. La adrenalina tiene mayor afinidad que la dopamina por la fase WCX a pH 4,0 y la dopamina mayor afinidad que el Dopac y éste es coadsorbido sobre las catecolaminas adsorbidas en la fase WCX. Un ensayo con solventes orgánicos demostró que el tolueno extrajo selectivamente de una mezcla sintética el Dopac y el 5-HIAA coadsorbido, mientras que en una muestra de tejido cerebral de ratas experimentales fueron extraídos el Dopac y el ácido homovanílico (HVA). Estos resultados sirvieron para proponer un paso adicional de extracción con solventes orgánicos para la separación de metabolitos ácidos durante la extracción en fase sólida (EFS) en el análisis de catecolaminas.

Palabras clave: Extracción en fase sólida; Catecolaminas; Ácido homovanílico; Ácido dihidroxifenilacético; Ácido indolacético; Intercambio catiónico débil

Summary

The adsorptions of Dopamine (DA), Noradrenaline (NA), and Adrenaline (A) catecholamines were compared by using the batch equilibrium method, as well as those of the dihydroxyphenylacetic acid (Dopac) and indolacetic acid (5-HIAA) metabolites on the hydrophobic octadecyl (C₁₈), hydrophilic diol (C_Diol) and weak cation exchange (WCX) solid phases. On the WCX solid phase at pH 4.0, catecholamines adsorption of 78% and Dopac adsorption of 68% were observed. The adsorption isotherms of catecholamines on the for the WCX phase at pH 4.0 than dopamine, dopamine has greater affinity than Dopac, and this latter is coadsorbed over the adsorbed catecholamines on the WCX phase. A trial with organic solvents demonstrated that toluene selectively extracted Dopac and the coadsorbed 5-HIAA from a synthetic mix, while in a brain tissue specimen from experimental rats, Dopac and homovanilic acid (HVA) were extracted. These results served to propose an additional extraction step with organic solvents throughout the separation of acid metabolites during solid phase extraction (EFS) for the analysis of catecholamines.

Key words: Solid phase extraction; Catecholamines; Homovanilic acid; Dihidroxyphenilacetic acid; Indolacetic acid; Weak cation exchange

Introducción

La partición de un soluto entre un líquido y un sólido adsorbente ha sido usada en muchas aplicaciones científicas entre las que se encuentra la separación de interferencias o sustancias de interés por extracción en fase sólida (EFS) (1)(2). En la EFS, el adsorbente generalmente debe tener una alta afinidad por el o los compuestos de interés; estos se retienen y se concentran en el adsorbente y luego se extraen con un solvente adecuado para su posterior análisis (3). En la EFS las moléculas adsorbidas se unen a la superficie mediante fuerzas covalentes; este tipo de adsorción es conocido como quimisorción y una vez que la superficie se ha recubierto con una sola capa de moléculas adsorbidas, queda saturada (4). Como la superficie del adsorbente está compuesta por un número fijo de sitios y cada molécula queda adsorbida por un sitio de adsorción, cuando las moléculas logran ocupar todos los sitios de adsorción cubren la superficie con una monocapa (5). Una vez formada la monocapa cesa la quimisorción (4).
Se han desarrollado muchos métodos de EFS para la determinación de catecolaminas y sus metabolitos en sangre, orina o líquido cefalorraquídeo debido a que estos compuestos son de interés clínico. El adsorbente más extensivamente usado en EFS para el análisis clínico de catecolaminas ha sido la alúmina que es un material de bajo costo, de fácil manejo y con el que se han obtenido buenos rendimientos. Durante la EFS con alúmina se utiliza como solvente de extracción el ácido perclórico (HClO₄) alcanzando hasta un 67% de recuperación de las catecolaminas (6). Por el contrario, los porcentajes de recuperación de los metabolitos derivados del indol como la serotonina (5-HT), el 5-hidroxitriptofano (5- HTP), el ácido indolacético (5-HIAA) y el triptofano (TRP) son mucho menores en comparación con las catecolaminas (6).
Se han informado distintos métodos de EFS que involucran la formación de complejos de catecolaminas, como en el caso de los complejos difenil boronato-catecolaminas, donde se emplea como adsorbente la fase C₁₈ o la de poliestireno/divinilbenceno (PLRP-S) que ha permitido obtener porcentajes de recuperación mayores al 85% (7)(8). Otros trabajos, en donde se sustituye la alúmina por las fases sólidas C₈ y C₁₈ utilizando la formación de complejos fenilboronatos han obtenido porcentajes de recuperación entre 80 y 90% en las catecolaminas, dihidrofenilalanina y ácido dihidroxifenilacético (Dopac) (9). Lo versátil del método de formación de complejos catecolamina- ácidofenilborónico es que una vez adsorbido puede ser degradado al cambiar la solución a pH ácido y extraído del adsorbente para su análisis (10)(11).
Una estrategia frecuentemente empleada en la determinación de catecolaminas por EFS es la combinación de métodos, como el empleo de cartuchos de intercambio catiónico fuerte (SCX) y cartuchos de afinidad con ácido fenilborónico (PBA) colocados en series donde se obtienen porcentajes de recuperación entre 90 y 107% (11). Por otro lado, la extracción con resinas de intercambio catiónico tipo Sephadex CM-25 combinada con la adsorción posterior en alúmina ha resultado en un porcentaje de recuperación de catecolaminas del 70% (12)(13).
Para la determinación específica de un metabolito como el ácido homovanílico (HVA) se ha desarrollado un procedimiento de EFS en cartuchos de intercambio aniónico fuerte (SAX), obteniéndose valores de recuperación del 98% (14).
El empleo de solventes orgánicos en la EFS es poco frecuente, pero se ha probado la extracción líquido-líquido en muestras de tejido de ratas donde se ha obtenido un 90% de recuperación en las catecolaminas utilizando el heptanol como solvente de extracción (15).
Durante la separación de las catecolaminas por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) en columna de fase reversa, se presentan frecuentemente problemas relacionados con la resolución cromatográfica, pero estos se han podido resolver parcialmente aplicando una fuerza iónica moderada en la fase móvil (6).
En investigaciones neurofisiológicas donde se utilizan ratas de experimentación para medir los niveles de catecolaminas en cerebro o líquido cefalorraquídeo (LCR) los homogenatos de cerebro son pretratados con ácido perclórico (HClO₄) (6). Al inyectar los sobrenadantes de los homogenatos con HClO₄ (0,2-0,4 M) para realizar una HPLC, la capacidad del buffer en la fase móvil es insuficiente y empiezan a coeluir las catecolaminas con sus metabolitos produciendo la superposición de los picos cromatográficos (6). Para evitar las superposiciones de los picos cromatográficos entre las catecolaminas y sus metabolitos en muestras tratadas con HClO₄, se propone extraer primero los metabolitos del sobrenadante ácido y recuperarlos para su análisis empleando para ello una resina de intercambio catiónico de ácido débil (WCX).

Materiales y Métodos

REACTIVOS

Dopamina (DA), Noradrenalina (NA), Adrenalina (A), Ácido 3,4-dihidroxifenilacético (Dopac), Ácido Indolacético (5-HIAA), Ácido Homovanílico (HVA) todos de Sigma, Ácido perclórico (HClO₄) y Octilsulfato de sodio de Aldrich. Metanol grado HPLC de Backer J.T. Agua desionizada Mill-Qplus de Millipore.

MATERIALES Y EQUIPOS PARA HPLC

Homogenizador ultrasónico Perkin Elmer (Waltham, Massachusetts, EE.UU.) microcentrífuga refrigerada 5415 R (Eppendorf, Hamburg, Alemania), adsorbentes para extracción en fase sólida tipo C₁₈, C_Diol y WCX Supelco (St Louis, Missouri, EE.UU.), bomba de alta presión modelo 510 (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, EE.UU.), puerto de inyección con válvula para 20 Rheodyne (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, EE.UU.), columna analítica LC-18-DB, diámetro de partícula 5 μm, 5 cm x 4,6 mm I.D y guarda columna LC-18- DB (Supelco, St Louis, Missouri, EE.UU.) Detector electroquímico de capa fina con electrodo de carbón vítreo y electrodo de referencia de Ag/AgCl modelo 467 (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, EE.UU.) Membranas de nitrocelulosa de 20 y 0,45 μm (Millipore, Billerica, Massachusetts, EE.UU.).

PROCEDIMIENTO

CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

La separación se realizó de forma isocrática con flujo constante de 0,9 mL/min. El detector se ajustó a un potencial de oxidación de +700 mV y ganancia de 50 nA/V. La temperatura de separación fue de 20 °C. La fase móvil consistió en 200 mL de metanol grado HPLC, 200 mL de solución 0,04 M de fosfato de sodio con 100 mg de EDTA y 100 mg de octilsulfato de sodio ajustada a pH 3,2 con ácido fosfórico. Esta solución se filtró en membranas de nitrocelulosa de 0,45 μm y se desgaseó con nitrógeno.

MÉTODO BATCH

Se preparó por triplicado una mezcla sintética de tres componentes constituida por DA, NA y Dopac a una concentración de 1 ppm respectivamente en buffer fosfato (K₂HPO₄/KH₂PO₄) a pH 2,0 y pH 4,0 con metabisulfito de sodio al 0,1% p/v. Se pesaron 50 mg de las resinas C₁₈, C_Diol, C_Fenil y WCX, respectivamente. Se colocaron 200 μL de la mezcla sintética con cada adsorbente en agitación por una hora a 20 °C. Las resinas se filtraron en membranas de nitrocelulosa de 20 μm. Se midieron 20 μL de la solución filtrada y se inyectaron al cromatógrafo.
Adsorción de Dopac en función de la concentración de A: Se preparó por duplicado una mezcla sintética de dos componentes constituidos por Dopac y A, donde la concentración de Dopac se mantuvo en 1,0 ppm y la concentración de A varió de 0,5 a 5 ppm a pH 4,0. Se pesaron 50 mg de la resina WCX y agitaron con 200 μL de la mezcla sintética Dopac-A por una hora a 20 °C. Las resinas se filtraron con membranas de nitrocelulosa de 20 μm. Se tomaron 20 μL de la solución filtrada y se inyectaron al cromatógrafo.

ISOTERMAS DE ADSORCIÓN EN RESINA TIPO WCX

Se realizaron las isotermas de adsorción de A, DA y Dopac mediante el método de equilibrio por tanda. Las concentraciones utilizadas fueron 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 y 5,0 ppm a pH 3,0 por triplicado inyectándose 20 μL de cada solución al cromatógrafo. Doscientos microlitros de cada solución se agitaron por una hora en 20 mg de resina WCX a 20 °C. La resina fue filtrada en membranas de nitrocelulosa de 20 μm. Se tomaron 20 μL de la solución filtrada y se inyectaron al cromatógrafo. La cantidad de la sustancia adsorbida se calculó a partir de la diferencia de concentración antes y después de la adsorción en WCX para un volumen fijo.

EXTRACCIÓN DE DOPAC Y 5-HIAA ADSORBIDOS EN RESINA TIPO WCX

Se preparó una mezcla sintética de tres componentes constituida por NA, Dopac y 5-HIAA a una concentración de 1 μg/mL en buffer fosfato (K₂HPO₄/KH₂PO₄) a pH 2,0 y pH 4,0 con metabisulfito de sodio al 0,1% p/v. Se agitaron por una hora 200 μL de la mezcla sintética en 20 mg de resina tipo WCX a 20 °C. La resina fue lavada con buffer de fosfato y filtrada en membranas de nitrocelulosa de 20 μm. Luego la resina seca se trató con 1 mL de tolueno, acetona, éter dietílico, acetato de etilo y cloroformo respectivamente, se filtró y 20 μL del solvente recuperado fue inyectado directamente al cromatógrafo.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Cerebro entero: Las ratas Sprague-Dawley (350-450 g) obtenidas del Bioterio de la Escuela de Medicina José María Vargas de la Universidad Central de Venezuela fueron sacrificadas por decapitación rápida. Los cerebros removidos rápidamente del cráneo (2 min.) se envolvieron en papel de aluminio y luego fueron enfriados por inmersión en una mezcla frigorífica de isopropanol con hielo seco a –70 °C por 4 min. Los cerebros congelados fueron sumergidos en una solución antioxidante fría (5 °C) de bisulfito de sodio al 0,1% y HClO₄ 0,06 M. Luego se procedió a cortar la corteza prefrontal sobre una plancha de aluminio en una cava que contenía una mezcla frigorífica de sal común e hielo a -20 °C.
Homogenización: Las muestras de corteza prefrontal (200-500 mg) con 100 μL de HClO₄ 0,06 M y 300 μL de buffer antioxidante de fosfato a pH 4,0 con metabisulfito de sodio al 0,1% p/v previamente enfriadas fueron homogenizadas con una punta ultrasónica. Los homogenatos se centrifugaron a 12.000 r.p.m por 20 min a 4 °C. Se extrajo el sobrenadante y se guardó en frío para su análisis.
Adsorción y extracción de catecolaminas y sus metabolitos en WCX: Se preparó una solución con 250 μL del sobrenadante de corteza prefrontal y 150 μL de buffer fosfato a pH 4,0 con metabisulfito de sodio al 0,1% p/v. Para reducir el tiempo de la EFS se agitó por 15 min con 50 mg de resina tipo WCX a 20 °C. La resina fue filtrada en membranas de nitrocelulosa de 20 μm, se lavó con buffer de fosfato y se dejó secar. Luego fue tratada con 400 mL de tolueno por 5 min. La resina fue filtrada y 20 μL del solvente fueron inyectados al cromatógrafo. Finalmente, la resina fue lavada previamente con buffer fosfato y tratada con 400 μL de HClO₄ 0,2 M por 5 min, se filtró nuevamente y 20 μL de la solución recuperada fue inyectada al cromatógrafo.

Resultados

ADSORCIÓN DE CATECOLAMINAS EN DIFERENTES RESINAS POR EL MÉTODO BATCH

Para lograr la separación de los metabolitos HVA, 5- HIAA y Dopac de las catecolaminas, se propuso desarrollar un método de EFS donde se separen los metabolitos ácidos citados, adsorbidos previamente en una fase sólida. Las catecolaminas DA, NA y A tienen un pKa de 8,8; 8,6 y 8,7 respectivamente y los metabolitos ácidos 5-HIAA y Dopac un pKa de 4,7 y 4,8 (17-19). Esta diferencia en el pKa puede ser aprovechada para separar estas moléculas de forma selectiva a través de pequeños cambios de pH y/o aplicación de un solvente orgánico adecuado.
En la Tabla I se presentan los porcentajes de adsorción de DA, NA y Dopac en las resinas C₁₈ y C_Diol, así como en una resina de intercambio iónico WCX a pH 2,0 y pH 4,0. Estos resultados fueron comparados con los obtenidos por otros autores que utilizaron alúmina como fase sólida para el pretratamiento de muestra de tejido cerebral en el análisis simultáneo de catecolaminas y metabolitos. En general, la adsorción de DA, NA y Dopac en las resinas C₁₈, C_Diol y en la resina WCX a pH 2,0 estuvo por debajo de los valores de adsorción obtenidos en alúmina. Un resultado prometedor fue conseguido en la resina WCX a pH 4,0 donde, con respecto a la alúmina, aumentó un 26% la adsorción de Dopac; asimismo se presentó un aumento en la adsorción de 5-HIAA (datos no presentados).

Tabla I. Porcentaje total de catecolaminas y de Dopac adsorbidos en diferentes tipos de resinas adsorbentes.

ISOTERMAS DE ADSORCIÓN EN RESINA TIPO WCX

En la Figura 1 se muestran las isotermas de adsorción de A, DA y Dopac. En general, las catecolaminas presentaron un aumento rápido de la adsorción entre 0 y 1 ppm, que corresponde a la primera etapa de adsorción lineal que ocurre durante la formación de una monocapa. Luego prosigue un aumento lento entre 1 y 5 ppm donde lo que predomina es una función asintótica que indica haber llegado a la saturación en 20 mg de adsorbente, que en el caso de A se produjo entre 4,5 y 5,0 ng. Este tipo de isotermas según la clasificación de Brunauer pertenecen al tipo I o isotermas de Langmuir (20).

Figura 1. Isotermas de adsorción de catecolaminas y Dopac en 20 mg de resina WCX, 20 ºC a pH 3,0 para n=3.

ADSORCIÓN DE DOPAC EN FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ADRENALINA

El Dopac es una molécula ácida y su afinidad hacia la resina WCX igualmente ácida está menos favorecida en comparación con las catecolaminas que son moléculas básicas. Cuando en una solución sintética están ausentes las catecolaminas, la adsorción de Dopac en la resina WCX a pH 2,0 es del 5%, pero cuando están presentes las catecolaminas la adsorción de Dopac aumenta hasta el 30%. Para explicar un aumento de seis veces en la adsorción de Dopac se evaluó su adsorción en la resina WCX variando la concentración de las catecolaminas a una concentración constante de Dopac. Para este ensayo fue escogida la A por su alta afinidad a la resina WCX. Los resultados indicaron que al aumentar la concentración de A aumenta proporcionalmente la adsorción de Dopac en la resina WCX (Fig. 2).

Figura 2. Adsorción de Dopac en función de la concentración de adrenalina en 20 mg de resina WCX, 20 ºC a pH 2,0 para n=2.

EXTRACCIÓN DE DOPAC Y 5-HIAA CON DISTINTOS SOLVENTES ORGÁNICOS

En EFS la selectividad se define como la capacidad del adsorbente y del método de extracción para discriminar entre el analito de interés y otras sustancias que se encuentren en la matriz de la muestra (21). En este sentido se ensayó la selectividad con distintos solventes orgánicos de diferentes fuerzas eluetrópicas en una mezcla de NA con Dopac y 5-HIAA previamente adsorbidos sobre una resina WCX a pH 4,0 y analizado por HPLC (Fig. 4).
El uso de solventes orgánicos ha sido empleado en el análisis de catecolaminas y sus metabolitos durante la extracción líquido-líquido y se han conseguido buenos resultados empleando acetato de etilo y éter etílico (22-24). La extracción con acetato de etilo y éter etílico en una mezcla de NA, Dopac y 5-HIAA previamente adsorbidos en la resina WCX no fue selectiva, ya que se observaron en el extracto orgánico los picos cromatográficos de todas las sustancias de la mezcla inicial. Por su parte, durante la extracción con tolueno se observaron en el extracto orgánico sólo los picos cromatográficos de Dopac y 5-HIAA indicando que fueron separados selectivamente de la resina WCX donde quedó aún adsorbida la NA (Fig. 4).

EXTRACCIÓN DE DOPAC, HVA Y CATECOLAMINAS EN MUESTRAS DE TEJIDO CEREBRAL DE RATAS

Inicialmente fueron identificadas cinco señales cromatográficas del sobrenadante de un homogenato de corteza prefrontal de ratas Sprague-Dawley por comparación con los tiempos de retención de muestras patrones, entre las cuales están las catecolaminas NA y DA, la serotonina (5-HT), dos metabolitos ácidos Dopac y HVA, y tres señales sin identificar con las letras X, Y y Z (Fig. 5-A). El primer paso consistió en una extracción preliminar con tolueno donde se logró separar Dopac y HVA de la mezcla inicial, ya que sólo fueron identificados en el extracto orgánico los picos cromatográficos de Dopac, HVA y el pico del compuesto X (Fig. 5-B). Luego de varios lavados se realizó una segunda extracción con HClO₄ que extrajo completamente todas las catecolaminas y los compuestos Y y Z, así como parcialmente el 5-HT (Fig. 5-C). Estos experimentos demostraron cualitativamente que el tratamiento preliminar con tolueno durante la EFS en una resina WCX fue selectivo y capaz de separar los metabolitos ácidos Dopac y HVA de una mezcla de catecolaminas en una muestra real.

Discusión

Desarrollar un método para EFS implica seleccionar el tipo de adsorbente, los solventes para la extracción y optimizar las condiciones de extracción durante la etapa de preparación de la muestra (16).
Las catecolaminas presentan un pKa entre 8,6 y 8,8, lo que indica que los grupos amino presentes en estas moléculas a pH 2,0 se encuentran totalmente protonados y tienen carga neta positiva. En esta condición las interacciones hidrofóbicas entre las catecolaminas y la resina C₁₈, así como las interacciones por puentes de hidrógeno entre las catecolaminas y la resina C_Diol, no se encuentran favorecidas y por ello se observa un bajo porcentaje de adsorción. Por otro lado, a pH 2,0 son muy similares los porcentajes de adsorción de catecolaminas en las resinas C₁₈ y WCX (Tabla I). Esto se explica porque la resina WCX es una fase sólida mixta, es decir, presenta grupos con características de fase reversa y de intercambio catiónico con un pKa igual a 5 (16). A pH 2,0 los protones de los grupos ácido carboxílico de la resina WCX no se encuentran en su forma disociada, y en este estado la resina funciona como una fase hidrofóbica C₁₈. Por otro lado, a pH 4,0 los protones de los grupos carboxílicos de la resina WCX se encuentran disociados y pueden intercambiar cationes; esto no afecta su capacidad de adsorción por mecanismos de hidrofobicidad y ambos tipos de interacciones contribuyen en la adsorción a pH 4,0, pero la interacción por intercambio catiónico es determinante en el aumento del porcentaje de adsorción de las catecolaminas a pH 4,0.
Como en la resina WCX a pH 4,0 se consiguió el mayor porcentaje de adsorción de las catecolaminas así como de DOPAC y 5-HIAA en comparación con otras resinas en estudio, se procedió a caracterizar mejor la adsorción de estas moléculas en la resina WCX a través de la elaboración de isotermas de adsorción.
Las isotermas de adsorción de las catecolaminas y Dopac fueron utilizadas como una medida indirecta de su afinidad con la resina WCX. Cuando una sustancia alcanza rápido el estado de saturación es porque la misma es muy afín al adsorbente. En este sentido se observó que la A alcanzó la saturación entre 0,75 y 1,25 ppm ubicándose a una concentración menor en comparación con la DA y el Dopac (Fig. 2). Asimismo, la DA alcanzó la saturación a partir de 2 ppm mientras que en el Dopac aún no se observó la saturación. En este sentido, el orden de afinidad de estas sustancias en la resina WCX fue: A>DA>Dopac.
El Dopac puede establecer interacciones favorables con las moléculas de A adsorbidas por la resina WCX a través de un mecanismo de coadsorción. El Dopac, de naturaleza ácida, puede coadsorberse favorablemente en la fase WCX si está en presencia de moléculas básicas como la A adsorbida por intercambio catiónico sobre la superficie de la resina. Entre la fase sólida y Dopac, así como entre A adsorbido y Dopac se pueden establecer interacciones tipo Van der Waals por medio de los anillos aromáticos, pero también pueden ocurrir interacciones dipolares entre los grupos OH de Dopac y la monocapa de catecolaminas en la fase WCX (Fig. 3).

Figura 3. Coadsorción de Dopac sobre la adrenalina adsorbida en una resina WCX. (→): Interacción dipolo-dipolo entre adrenalina y Dopac. (↔):Interacción por intercambio catiónico entre la resina WCX y la adrenalina.

Figura 4. Cromatogramas de la extracción con solventes orgánicos de una mezcla de NA, Dopac y 5-HIAA adsorbidos en una resina WCX. Volumen de inyección: 20 μL. A. Solución estándar de NA, Dopac y 5-HIAA. B. Extracción con 1 mL de acetato de etilo. C. Extracción con 1 mL de éter etílico. D. Extracción con 1 mL de Tolueno.

Figura 5. Cromatogramas de la EFS en WCX de corteza prefrontal de ratas Sprague-Dawley. A. Sobrenadante del homogenato de corteza prefrontal antes de la EFS. B. Extracción con tolueno. C. Reextracciónácida con HClO₄. Noradrenalina (NA), Adrenalina (A), Ácido dihidroxifenilacético (Dopac), Dopamina (DA), Serotonina (5-HT), Ácido homovanílico (HVA).

Los metabolitos ácidos como el Dopac y el 5-HIAA a pH 4,0 no tienen la posibilidad de ocupar los sitios de intercambio catiónico en la resina WCX pero pueden ser coadsorbidos mediante interacciones hidrofóbicas con las catecolaminas que se encuentran adsorbidas en la resina WCX en las mismas condiciones. El tolueno, que es un solvente de baja fuerza eluetrópica (25)(26), es altamente hidrofóbico y puede extraer con facilidad sólo aquellas moléculas débilmente adsorbidas en la fase sólida y que a su vez presenten un carácter parcialmente hidrofóbico. En este sentido, se puede considerar al tolueno como un solvente de extracción suave para sustancias fuertemente adsorbidas en WCX y selectivo para las sustancias hidrófobas coadsorbidas en WCX.
La cuantificación simultánea de catecolaminas y metabolitos ácidos como Dopac y HVA a partir de tejido cerebral de ratas experimentales o de LCR ha sido empleada como un indicador de recambio metabólico en el análisis clínico, así como índice de actividad dopaminérgica central (27). Cuando se quiere realizar una determinación simultánea de catecolaminas y sus metabolitos en muestras de tejido cerebral o de LCR, éstas son tratadas previamente con HClO₄. El HClO₄ es utilizado frecuentemente en estos protocolos para precipitar las proteínas del tejido homogenizado y retardar la oxidación de las catecolaminas (27), pero es frecuente encontrar problemas de coelución durante la separación cromatográfica de las catecolaminas con los metabolitos ácidos y otras sustancias endógenas cuando las muestras contienen HClO₄. Por otro lado, también hay que considerar que cuando se realiza una determinación simultánea de catecolaminas y sus metabolitos el potencial aplicado al detector electroquímico es fijo y las sensibilidades de las catecolaminas y de los metabolitos son muy diferentes. En muchas ocasiones se hace necesario aplicar un potencial electroquímico para favorecer la detección de las catecolaminas o componentes mayoritarios haciendo menos sensibles a los metabolitos o componentes minoritarios (28). En cualquiera de los casos, separar los metabolitos como el Dopac y HVA de las catecolaminas por EFS empleando una resina tipo WCX, puede ser una alternativa para evitar los problemas inherentes al análisis simultáneo de catecolaminas y metabolitos de una manera sencilla y de bajo costo.
Las modificaciones realizadas en este artículo al método de extracción en fase sólida para el análisis de catecolaminas propuesto por Wagner et al. (6) consistieron en seguir el mismo procedimiento de preparación de la muestra, pero sustituyendo en primer lugar la alúmina como adsorbente por una resina de intercambio catiónico débil (WCX) a un pH adecuado. Esta modificación mejoró un 18% la adsorción total de las catecolaminas y Dopac; en segundo lugar, realizar una primera extracción con tolueno, que separa selectivamente los metabolitos ácidos Dopac, 5-HIAA y HVA de la muestra antes de eluir todos los compuestos con ácido perclórico para recuperar las catecolaminas. Con estas modificaciones se pueden analizar las catecolaminas y los metabolitos Dopac, 5-HIAA y HVA separadamente para estimar índices de recambio metabólico o de actividad dopaminérgica central. Este protocolo de extracción fue aplicado en sobrenadantes de homogenatos de tejido cerebral en animales de experimentación, pero puede ser empleado sin mayores contratiempos en muestras de LCR de animales vivos o de pacientes con trastornos neurológicos.

Conclusiones

Los metabolitos ácidos como Dopac, 5-HIAA y HVA son coadsorbidos sobre una monocapa de catecolaminas en la fase sólida WCX a pH 4,0 y estos son extraídos selectivamente con tolueno sin afectar la adsorción de las catecolaminas. Posteriormente las catecolaminas pueden ser extraídas con HClO₄ para su recuperación y análisis. Esta extracción adicional con tolueno puede ayudar a eliminar la coelución entre los picos cromatográficos de los metabolitos ácidos y las catecolaminas que son frecuentes en el análisis simultáneo de muestras biológicas tratadas con HClO₄.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Profesor Dr. José Bubis por la revisión del manuscrito y sus recomendaciones y al T.S.U. Danny Sicat por su apoyo durante la elaboración de este artículo.

CORRESPONDENCIA

MAGÍSTER NELSON ARAUJO
Calle uno, Urbanización el Cigarral,
Residencias Club Cigarral Torre-D Apartamento 15-D,
Municipio el Hatillo, CARACAS -Venezuela.
Email: nelsonaaa@gmail.com

Referencias bibliográficas

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Aceptado para su publicación el 29 de enero de 2010.