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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. v.44 n.2 La Plata mar./jun. 2010

 

BIOQUÍMICA CLÍNICA

Hidrólisis de acilcarnitinas durante el análisis en sangre y plasma por espectrometría de masas en tandem

Hydrolysis of acylcarnitines during measurement in blood and plasma by tandem mass spectrometry

José Henry Osório1, Morteza Pourfarzam2

1. PhD. Universidad de Caldas, Laboratorio de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Manizales, Colombia.
2. PhD. Spence Biochemical Genetics Unit, Royal Victoria Infirmary. Newcastle upon Tyne. Inglaterra. Reino Unido.

Resumen

La determinación de acilcarnitinas en sangre es una herramienta importante para el diagnóstico de algunas enfermedades hereditarias, así como deficiencias metabólicas secundarias. Bajo las condiciones acídicas y la alta temperatura utilizadas durante el proceso de derivatización, es posible que pueda ocurrir algún grado de hidrólisis de acilcarnitinas, lo cual puede potencialmente interferir con las determinaciones de la carnitina libre. El objetivo del presente estudio fue investigar la hidrólisis de las acilcarnitinas (de cadena corta, media y larga) durante el proceso de derivatización y analizar su efecto sobre la determinación de carnitina libre. El porcentaje de hidrólisis fue de 27% para acilcarnitinas de cadena corta, 17% para acilcarnitinas de cadena media y 5% para acilcarnitinas de cadena larga. Estos resultados pueden ocasionar un incremento en los niveles de carnitina libre de las muestras analizadas.

Palabras clave: Carnitina; Acilcarnitinas; Espectrometría de masas en tandem

Summary

The measurement of acylcarnitines in blood is an important tool for diagnosis of some inherited metabolic diseases and secondary metabolic deficiencies. Under the acidic conditions and the high temperature used for the derivatisation process, it is feasible that some degree of hydrolysis of acylcarnitines to free carnitine may occur and therefore potentially interfere with free carnitine measurements. The objective of the present study was to investigate the hydrolysis of acylcarnitines (short-chain-, medium-chain, and long chain acylcarnitines) during derivatisation process and to analyse its effect on free carnitine measurement. The average percentage of hydrolysis was 27% for short-chain acylcarnitines, 17% for medium-chain acylcarnitines, and 5% for long-chain acylcarnitines. These results can increase the free carnitine levels in the analysed samples.

Key words: Carnitine; Acylcarnitines; Tandem mass spectrometry

Introducción

La espectrometría de masas en tandem es una técnica mediante la cual pueden detectarse más de treinta alteraciones del metabolismo; se utiliza incluso para el cribado básico y para la confirmación posterior de dichas alteraciones, así como para el control de los tratamientos instaurados (1). Esta técnica tiene como ventajas la rapidez de preparación y análisis y la alta sensibilidad (2). Las bases del análisis por espectrometría de masas en tandem son la producción de especies moleculares intactas a partir de una mezcla compleja, a través de una técnica de ionización suave, seguida por la identificación de fragmentos moleculares de componentes específicos inducidos con moléculas neutras de argón o nitrógeno. El uso de dos espectrómetros de masas unidos en tandem y separados por una celda de colisión, en la cual tiene lugar la fragmentación secundaria, permite el análisis altamente selectivo y específico de varios aminoácidos y acilcarnitinas (3). Las separaciones cromatográficas son innecesarias porque la separación y el análisis tienen lugar simultánea y completamente dentro del equipo. Esta tecnología, además, permite la reducción en el límite de detección a 1 nM/mL de sangre, y hace posible el uso de especímenes secos en papel de filtro (4). La versatilidad de este método, además, permite el análisis de una gran variedad de compuestos químicos, incluidos grupos de α-aminoácidos y aminoácidos básicos, simplemente mediante un cambio en los parámetros de control (5).
Sin embargo, se hace necesario analizar la estabilidad de los aminoácidos y acilcarnitinas sometidos a diferentes condiciones experimentales. El presente estudio busca información relacionada con la estabilidad de las acilcarnitinas cuando son sometidas al proceso de derivatización (incubación de las muestras a 60 °C durante 15 min, en presencia de 50 μL de HCl butanólico) y su influencia sobre los niveles de carnitina libre en las muestras analizadas.

Materiales y Métodos

El presente estudio es de tipo experimental. La sangre utilizada fue obtenida de un voluntario aparentemente sano, el cual firmó consentimiento escrito para la realización del trabajo. Todos los reactivos usados fueron grado analítico. L-carnitina, acetilcarnitina (C2Cn), octanoilcarnitina (C8Cn), hexadecanoilcarnitina (C16Cn), cartinina deuterada en C3 ([d3]Cn), cartinina deuterada en C9 ([d9]Cn), acetilcarnitina deuterada ([d9]C2Cn), octanoilcarnitina deuterada ([d3]C8Cn) y hexadecanoilcarnitina deuterada ([d3]C16Cn) fueron obtenidos de Cambridge Isotopes Laboratories, (Andover, MA, EEUU). El HCl butanólico fue preparado haciendo pasar gas HCl a través de n-butanol anhidro (Sigma-Aldrich Company, Ltd., Poole, RU) durante 30 min.
El primer experimento consistió en analizar la posible hidrólisis de acilcarnitinas, para lo cual se utilizaron carnitinas deuteradas adicionadas a muestras de sangre. El análisis cuantitativo se basó en el método del estándar interno. Se prepararon curvas de calibración para [d9]Cn en un rango de 0-10 μM; [d9]C2Cn en un rango de 0 a 50 μM; [d3]C8Cn en un rango de 0 a 10 μM; y [d3]C16Cn en un rango de 0 a 10 μM, (p< 0,00001 para cada curva de calibración). Las muestras de sangre utilizadas para la preparación de las tarjetas de papel de filtro contenían las siguientes concentraciones finales: [d9]C2Cn desde 0 hasta 50 μM (0, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, y 50 μM), [d3]C8Cn desde 0 hasta 10 μM (0, 1, 2 ,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 μM ) y [d3]C16Cn desde 0 hasta 10 μM (0, 1, 2 ,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 μM ), y todas las muestras contenían 10 μM de [d9]Cn como estándar interno. La sangre fue preparada en tubos que contenían EDTA (23,5 μmol/tubo). El segundo experimento consistió en analizar la posible formación de carnitina libre a partir de acilcarnitinas hidrolizadas. Para ello fue utilizado plasma sin contenido alguno de carnitina o acilcarnitinas, el cual fue preparado mediante diálisis de la siguiente manera: alícuotas de especímenes de plasma sanguíneo (1 mL) fueron colocadas en membranas de diálisis y sumergidas en una solución de PBS a pH 7,4 (NaCl 136,9 mM, KCl 2,8 mM, KH2PO4 1,47 mM, Na2PO4 8,1 mM), (1 mL sangre/250 mL PBS) a 4 °C, con agitación suave durante 48 h. Fueron tomadas muestras de las alícuotas para análisis de acilcarnitinas y carnitina libre a las 0, 6, 12, y 48 h respectivamente, la solución de PBS fue reemplazada cada 3 h. El análisis cuantitativo se basó en el método del estándar interno. Se prepararon curvas de calibración para [d3]Cn en un rango de 0-10 μM, C2Cn en un rango de 0 a 50 μM, C8Cn en un rango de 0 a 10 μM, y C16Cn en un rango de 0 a 10 μM, (p< 0,00001 para cada curva de calibración). Las muestras de plasma utilizadas para la preparación de las tarjetas de papel de filtro contenían las siguientes concentraciones finales: C2Cn desde 0 hasta 50 μM (0, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, y 50 μM), C8Cn desde 0 hasta 10 μM (0, 1, 2 ,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 μM ) y C16Cn desde 0 hasta 10 μM (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 μM ), y todas las muestras contenían [d3]Cn 300 mM como estándar interno, a una relación de 10 μL/90μL de plasma. Para la preparación de tarjetas, alícuotas de 20 μL de sangre o plasma se dejaron caer sobre papel de filtro (No. 903, 1,88 mm Schleicher & Schuell). Las muestras se dejaron secar a temperatura ambiente durante la noche y fueron empacadas al vacío y selladas, para ser guardadas a –80 °C hasta el momento del análisis. La determinación de acilcarnitinas y carnitina libre en sangre por espectrometría de masas en tandem mediante la utilización de bandejas de 96 pozos (microtitre plates), fue realizada de la siguiente manera: las manchas de sangre o plasma fueron recortadas del papel de filtro en círculos (6,35 mm ó 0,25 pulgadas de diámetro para cada uno,
que corresponden a 12 μL de muestra) y se depositó un círculo en cada pozo. A cada uno fueron adicionados 500 μL de metanol puro. Las bandejas fueron colocadas en agitador orbital (750 rpm) durante 30 min y luego en baño de ultrasonido durante 15 min. A continuación fueron agitadas nuevamente durante dos horas. Se colocaron en el baño de ultrasonido por 30 min y el papel de filtro fue removido de cada pozo. El sobrenadante resultante fue evaporado bajo gas nitrógeno a 45 °C hasta secarse y 50 μL de HCl butanólico 1 mol/L fueron adicionados a cada muestra (cada pozo) e incubados a 60 °C durante 15 min (derivatización). Las muestras fueron evaporadas inmediatamente bajo nitrógeno y redisueltas en 100 μL (cada una) de acetonitrilo al 70% en agua para ser inyectadas al espectrómetro de masas. El estándar interno fue usado para la cuantificación de L-carnitina y acilcarnitinas al analizar la relación entre las señales. Los análisis de carnitina libre y acilcarnitinas fueron desarrollados utilizando las siguientes funciones de barrido: precursores de m/z 85, rango de barrido 200-500 (m/z), energía de colisión 25 eV, voltaje del cono 30 V, tiempo de barrido 2,0 segundos, tiempo de interbarrido 0,1 s, gas de colisión argón, presión de colisión gaseosa 1,6-2 x 10-3 mBar. Todos los análisis fueron realizados en un equipo Quattro II, espectrómetro de masa tandem de triple cuadrupolo (Micromass, RU), equipado con una fuente de ionización en electrospray (ESI), y sistema de análisis datos micro mass MassLynx. La introducción de las muestras a la fuente se hizo mediante el dispositivo automático Jasco AS980 acoplado a una bomba Jasco PU980 HPLC. Para obtener las concentraciones de carnitina y acilcarnitinas se realizó un registro de precursores m/z 85 (PAR 85). Todas las muestras fueron procesadas 10 veces. La prueba t de Student fue utilizada para establecer las posibles diferencias. Las comparaciones estadísticas se hicieron utilizando ANOVA de una via (SigmaStat version 3.1 statistical software) seguida de la prueba de Dunnett. P<0,05 fue considerada significativa. El trabajo fue aprobado por el respectivo comité de ética.

Resultados

El porcentaje promedio de hidrólisis para acetilcarnitina, octanoilcarnitina y hexadecanoilcarnitina fue de 27%, 17% y 5% respectivamente (Tablas I, II, III). El porcentaje de carnitina libre producida mediante hidrólisis de acilcarnitinas es presentado en las Tablas IV, V y VI. Se encontró diferencia significativa (p<0,05) entre la cantidad de acilcarnitinas adicionadas a las muestras de sangre y las obtenidas en el análisis por espectrometría de masas después de derivatizar, asimismo entre los niveles de carnitina libre de las muestras de plasma a las que se adicionaron acilcarnitinas al compararlas con aquellas a las que no se les adicionó.

Tabla I. Hidrólisis de acetilcarnitina durante el proceso de derivatización

Tabla II. Hidrólisis de octanoilcarnitina durante el proceso de derivatización

Tabla III. Hidrólisis de hexadecanoilcarnitina durante el proceso de derivatización

Tabla IV. Producción de carnitina libre en muestras de plasma mediante hidrólisis de acetilcarnitina durante el proceso de derivatización

Tabla V. Producción de carnitina libre en muestras de plasma mediante hidrólisis de octanoililcarnitina durante el proceso de derivatización

Tabla VI. Producción de carnitina libre en muestras de plasma mediante hidrólisis de hexadecanoilcarnitina durante el proceso de derivatización

Discusión y Conclusiones

La aplicación de la espectrometría de masas en tándem en el diagnóstico de los EIM se relaciona principalmente con el tamizaje de la oxidación mitocondrial de ácidos grasos, acidurias orgánicas y aminoacidopatías (6). La L-carnitina y las acilcarnitinas contienen un grupo funcional de amonio cuaternario, que hace que se comporten como iones positivos preformados (cationes) polares y no volátiles. Los butilésteres derivados y no derivados de la carnitina y las acilcarnitinas muestran un producto iónico común con una masa de 85 Da, lo cual permite identiVcarlos (7).
Holub et al (8) postularon que los niveles de carnitina libre y algunas acilcarnitinas de cadena larga (C16, C18, C18:1, C18:2), así como algunas de cadena media y corta (C2, C3, C4, C4DC, C5OH), se correlacionan con los valores de hematocrito de las muestras, mientras que para otras (C6, C8, C10, C12, C14), no existe correlación. Esto ha hecho pensar a varios investigadores que, además, las condiciones experimentales a las cuales son sometidas las muestras tienen influencia sobre algunos resultados, incluso desde el momento mismo de la recolección de las muestras; por eso ha sido aceptado de manera general que la correcta cuantificación de carnitina libre y acilcarnitinas en plasma depende de la rápida centrifugación de la sangre después de la recolección, o el almacenamiento en hielo y su centrifugación dentro de una hora como máximo antes del análisis, o el plasma resultante debe conservarse a −20 °C o −80 °C, durante un almacenamiento corto o largo respectivamente, lo mismo que las tarjetas de papel de filtro (9).
La temperatura y posiblemente las condiciones de pH también pueden ser factores que tengan cierta influencia en el procesamiento de las muestras. Mancinelli et al (10) mostraron que los niveles de carnitina libre y de acilcarnitinas de cadena corta y media no cambiaban por efecto de la hidrólisis cuando se incubaba sangre durante 3 h a diferentes temperaturas entre 0 y 50 °C pero sí afectaban los niveles de acilcarnitinas de cadena larga (C14, C16, C18). El presente estudio muestra que existe hidrólisis de acilcarnitinas bajo estas condiciones y que la hidrólisis depende de la longitud de la cadena de carbonos de las acilcarnitinas, incrementándose a medida que la longitud de la cadena disminuye y viceversa, contrario a lo observado por otros autores (10), posiblemente porque en este estudio la temperatura empleada fue mayor. Los niveles promedio de hidrólisis para acilcarnitinas de cadena corta, media y larga fueron de 27%, 17% y 5% respectivamente. Estos valores concuerdan con el incremento en la formación de carnitina libre en condiciones experimentales encontradas en el presente estudio (Tablas IV, V y VI).
Como conclusión, se puede señalar que el proceso de derivatización al cual se someten las muestras para el análisis de carnitina libre y acilcarnitinas por espectrometría de masas en tandem produce hidrólisis de acilcarnitinas, con formación de carnitina libre, lo que debe tenerse en cuenta al realizar el análisis de los niveles de estos metabolitos en situaciones como los errores innatos del metabolismo, donde los mismos se encuentran alterados.

CORRESPONDENCIA

PHD JOSÉ HENRY OSÓRIO
Universidad de Caldas
Departamento de Ciencias Básicas de la Salud
Calle 65 N0. 26-10
MANIZALES, Colombia.
E-mail: jose.Osorio_O@ucaldas.edu.co

Referencias bibliográficas

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Aceptado para su publicación el 12 de febrero de 2010

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