MICROBIOLOGÍA

Evaluación de un sistema automatizado para la identificación de especies de enterococos*

Evaluation of an automated system for identifying enterococcal species

María Alejandra Blanco¹, María Belén Mónaco¹, Horacio Angel Lopardo^{2 *}

1. Bioquímica.
2. Doctor en Ciencias Bioquímicas.

* Servicio de Microbiología. Hospital de Pediatría "Prof. Dr. Juan P. Garrahan". Combate de los Pozos 1881. 1245 Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

Resumen

El sistema Vitek ha demostrado una buena correlación con los métodos convencionales en la identificación de enterococos aislados de materiales clínicos. Sin embargo, su eficacia ha sido cuestionada especialmente en la identificación de especies menos frecuentes. El objetivo de este trabajo fue verificar la identificación de aislamientos seleccionados de distintas especies de enterococos a través de este sistema. Se estudiaron 100 aislamientos de enterococos: Enterococcus faecalis (25), Enterococcus faecium (25), Enterococcus gallinarum (21), Enterococcus casseliflavus (2), Enterococcus raffinosus (16), Enterococcus durans (4), Enterococcus hirae (2), Enterococcus mundtii (1) y Enterococcus avium (4). El criterio empleado fue considerar como correcta una identificación que proveyera más del 90% de confiabilidad. Los casos en que se obtuvieron porcentajes menores fueron corregidos (a) por lectura de las pruebas impresas por Vitek, (b) por lectura ocular en el punto final y/o (c) con el agregado de pruebas adicionales (movilidad y alfa-metil-D-glucopiranósido). La identificación correcta se logró en el 56% de los aislamientos y con las correcciones derivadas de a, b y c aumentó al 85%. Se concluye que el sistema Vitek versión VTK-R 9.01 no resulta confiable en la identificación de enterococos si no se efectúan los análisis adecuados según la metodología expuesta en este trabajo.

Palabras clave: Vitek; Enterococo; Identificación

Summary

It has been demonstrated that the Vitek system is almost equivalent to conventional biochemical tests for identifying clinical isolates of Enterococcus spp. to the species level. However its performance is uncertain when less frequently found species are being identified. In the present study the ability of a commercial system (Vitek system) to identify enterococcal species was evaluated and compared to the conventional scheme. A total of 100 isolates of Enterococcus were tested: Enterococcus faecalis (25), Enterococcus faecium (25), Enterococcus gallinarum (21), Enterococcus casseliflavus (2), Enterococcus raffinosus (16), Enterococcus durans (4), Enterococcus hirae (2), Enterococcus mundtii (1) and Enterococcus avium (4). It is considered that one isolate was correctly identified when the percentage of the first choice was over 90% by the Vitek system. When this percentage was lower: (a) database test, (b) final point test, and/or (c) additional tests (alpha-methyl-D-glucopyranoside and motility) were analyzed. Of the 100 tested isolates, 56 were correctly identified using no additional tests. Using a corrective action a, b and c, the percentage increased to 85%. In conclusion, the use of Vitek version VTK-R 9.01 is not a reliable method for identification of enterococci unless the method described in this study be applied.

Key words: Vitek; Enterococcus; Identification

Introducción

El sistema Vitek software versión VTK- R 9.01 (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia) es un sistema automatizado de identificación bacteriana que ha demostrado una alta correlación con métodos convencionales en la identificación de enterococos aislados de materiales clínicos. Sin embargo, su eficacia ha sido cuestionada especialmente en la identificación de especies menos frecuentes. Esta diferencia se debe fundamentalmente a que Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium dan cuenta de más del 90% de los aislamientos clínicos y éstas son más fácilmente identificables que otras especies (1). El objetivo de este trabajo fue verificar la identificación por Vitek de aislamientos seleccionados de distintas especies de enterococos.

Materiales y Métodos

MICROORGANISMOS

Se estudiaron 100 aislamientos de enterococos: 7 cepas de colección y 93 obtenidos de materiales clínicos: Enterococcus faecalis (25), Enterococcus faecium (25), Enterococcus gallinarum (21), Enterococcus casseliflavus (2), Enterococcus. raffinosus (16), Enterococcus durans (4), Enterococcus hirae (2), Enterococcus mundtii (1) y Enterococcus avium (4).
DISEÑO
Se empleó el sistema Vitek versión VTK-R 9.01 (bioMérieux, Marcy l´Etoile, Francia) según las recomendaciones de su fabricante. Simultáneamente, con el mismo inóculo, se utilizó el esquema de identificación bioquímica propuesto por Texeira y Facklam, como método de referencia (2). Todos los aislamientos fueron procesados por ambos métodos por distintos operadores y en forma ciega.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

El criterio empleado fue considerar como correcta una identificación que proveyera más del 90% de confiabilidad. Los casos en que se obtuvieron porcentajes menores fueron corregidos por distintos métodos:

(a) Por lectura de las pruebas impresas por Vitek: se tomaron en cuenta aquellas pruebas consideradas "clave" para la identificación de ciertas especies (p. ej. fermentación de la rafinosa para E. raffinosus).
(b) Por lectura ocular de la tarjeta en el punto final: se registraron cambios de color en los pocillos de las tarjetas en el punto final de lectura (Fig. 1) y se corrigió la identificación en base a pruebas que habían sido mal evaluadas por el aparato como negativas. Cabe destacar que el aparato efectúa una lectura cinética de la reacción.
(c) Con el agregado de pruebas manuales adicionales: movilidad y fermentación del alfa-metil-D-glucopiranósido (MGP).

Figura 1. Lectura de la tarjeta Vitek en el punto final. En A) y B) el informe del Vitek dio el mismo resultado: E. avium. A) Prueba de la rafinosa positiva, permitió identificar correctamente al microorganismo como E. raffinosus. B) Prueba de la rafinosa negativa, permitió asegurar que la identificación de E. avium había sido correcta.

Resultados

La identificación correcta se logró en el 56%de los aislamientos: E. faecalis 24/25 (96%), E.faecium 19/25 (76%) y otras especies 13/50 (26%) (Tabla I). Los errores se observaron en una cepa de E. faecalis mal identificada como E. faecium, una cepa de E. faecium mal identificada como E. durans, dos de E. gallinarum mal identificadas como E. faecium, una de E. durans mal identificada como Streptococcus uberis y una de E. mundtii mal identificada como E. faecium. Cabe destacar que E. raffinosus no figura en la base de datos y que 9 aislamientos de esta especie fueron identificados como E. avium y los 7 restantes como E. avium / E. gallinarum. En los casos en que se obtuvieron resultados de buena concordancia pero difícil diferenciación entre dos especies distintas, el análisis de las pruebas impresas permitió identificar correctamente 3 aislamientos: un caso de E. gallinarum / E. faecium (la prueba de sorbitol positiva permitió descartar E. gallinarum), un caso de E. faecium / E. durans (la prueba de arabinosa positiva permitió descartar E. durans) y un caso de E. raffinosus que fue identificado como E. avium / E. gallinarum (la prueba de rafinosa positiva permitió descartar E. avium y la prueba de sorbitol positiva permitió descartar E. gallinarum). Teniendo en cuenta otras pruebas que provee el informe del sistema Vitek (arginina, manitol, arabinosa), se logró la identificación correcta final de estos microorganismos. Con la lectura en el punto final (Fig. 1) se logró identificar otros 10 aislamientos: dos casos de E. faecium / E. gallinarum (la prueba de sorbitol positiva permitió descartar E. gallinarum); un caso de E. faecium / E. durans (tanto manitol como arabinosa positivas permitieron descartar E. durans) y un caso de E. faecium / E. gallinarum (la inulina positiva permitió descartar E. faecium). En 6 casos de E. raffinosus los informes de Vitek fueron E. avium / E. gallinarum aunque las pruebas impresas de rafinosa y sorbitol fueran positivas. La rafinosa positiva permitió descartar E. avium y la prueba de sorbitol positva permitió descartar E. gallinarum. Con pruebas manuales adicionales recomendadas por el boletín técnico del sistema Vitek (MGP y movilidad positivas) se identificaron 16 aislamientos como E. gallinarum. Con las correcciones descritas, el porcentaje de identificación aumentó al 85%.

Tabla I. Resultados obtenidos con el sistema Vitek versión VTK-R 9.01 al emplear distintos aislamientos de Enterococcus spp.comparados con el método manual de referencia (6).

Discusión y Conclusiones

Las distintas publicaciones en las que el porcentaje de identificación correcta de enterococos a nivel de especie con esta versión del sistema Vitek fue aceptable incluyeron principalmente las dos especies más frecuentemente aisladas de materiales clínicos (E. faecium y E. faecalis). Tanto Jordá Vargas et al. (3) como Visser et al. (4) encontraron que todos los enterococos ensayados fueron identificados correctamente a nivel de especie con este sistema. Los primeros ensayaron 22 aislamientos de enterococos, 14 fueron E. faecalis, 5 E. faecium, y 3 E. avium, mientras que Visser et al. ensayaron 12 aislamientos de E. faecalis. Los trabajos que incluyeron especies menos frecuentes obtuvieron menores porcentajes de identificación correcta. Sader et al. (1) ensayaron un total de 369 aislamientos de enterococos, de los cuales 125 fueron E. faecalis, 215 E. faecium, 12 E. gallinarum, 7 E. avium, 4 E. casseliflavus, 3 E. hirae, 2 E. raffinosus y 1 E. solitarius, actualmente reclasificado como Tetragenococcus solitarius (5). Estos investigadores encontraron que los porcentajes de identificación correcta fueron 98,4%, 98,5% y 89,3% para E. faecalis, E. faecium y especies distintas de E. faecalis y E. faecium respectivamente. Cabe destacar que en este estudio sólo 29 enterococos pertenecían a este último grupo y que no se utilizó elmétodo de referencia para el total de los aislamientos. Sólo se evaluaron las discordancias entre API y Vitek, a pesar que es conocido que ambas bases de datos adolecen de defectos similares. D' Azevedo et al. (6) ensayaron 40 aislamientos de E. faecalis, 14 de E. faecium y 25 de otras especies y encontraron que los porcentajes de identificación correcta fueron 87,5% para E. faecails, 85,7% para E. faecium y 76,9% para especies distintas de E. faecalis y E. faecium. Bryce et al. (7) ensayaron 118 aislamientos de E. faecails, 19 de E. faecium y 3 de E. casseliflavus. Los porcentajes de identificación correcta fueron 89,5%y 98,3%para las especies E. faecium y E. faecalis respectivamente, mientras que los tres aislamientos de E. casseliflavus fueron erróneamente identificados como E. faecium. Wilke et al. (8) publicaron el primer caso de E. raffinosus resistente a vancomicina que fue mal identificado por Vitek como E. avium. Ligozzi et al. (9) ensayaron 55 aislamientos de E. faecalis, 28 de E. faecium y 6 de otras especies y encontraron que los porcentajes de identificación correcta fueron 92,7%, 71,4%, y 50%respectivamente. Abele et al. (10) evaluaron la capacidad de identificación de un sistema mejorado (Vitek 2, software 4.01) y concluyeron que era necesario agregar pruebas adicionales, (MGP y movilidad) para resolver algunos casos en que dicho sistema no lograba discriminar entre las especies E. faecium, E. gallinarum y E. casseliflavus. Los resultados de este trabajo mostraron que los puntos débiles encontrados en la identificación de enterococos eran fundamentalmente dos: (a) el sistema no fue capaz de discriminar entre las especies E. faecium, E. gallinarum y E. casseliflavus y (b) se identificó erróneamente como E. avium a las bacterias de la especie E. raffinosus, dado que ésta no figura en la base de datos.
Concluyendo, el sistema Vitek versión VTK-R 9.01 no resulta confiable para la identificación de enterococos si no se efectúan los análisis adecuados según la metodología expuesta en este trabajo. Probablemente con los nuevos modelos de Vitek y/o ajustes en las bases de datos puedan obtenerse resultados más alentadores.

CORRESPONDENCIA

PROF. DR. HORACIO A. LOPARDO
Servicio de Microbiología
Hospital de Pediatría "Prof. Dr. Juan P. Garrahan"
Combate de los Pozos 1881.
1245. CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES, Argentina
E-mail: hlopardo@garrahan.gov.ar

Referencias bibliográficas

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Aceptado para su publicación el 30 de abril de 2010