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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. v.44 n.2 La Plata mar./jun. 2010

 

INMUNOLOGÍA

Ascaris lumbricoides: Mimetismo molecular por absorción de epitopes P1

Ascaris lumbricoides: Molecular mimicry by P1 epitope absorption

Patricia Ponce de León1 a, Patricia Foresto2 b, Juana Valverde2 b

1. Bioquímica.
2. Doctora en Ciencias Bioquímicas.

a Laboratorio de Parasitología. Fac. Cs. Bioq. y Farm. UNR. Rosario. Argentina.
b Laboratorio de Inmunohematología, Hemorrelogía e Inmunogenética. Fac. Cs. Bioq. y Farm. UNR. Rosario. Argentina.

Dedicado a la memoria de la Dra. Patricia Foresto

Resumen

El mimetismo molecular se ha asociado con la cronicidad de las infecciones parasitarias. Este mecanismo puede deberse a absorción de moléculas del hospedador o a síntesis de moléculas similares. P1 ha sido detectado en diversas especies parásitas. Experiencias previas han demostrado epitopes P1 en ejemplares adultos de Ascaris lumbricoides. El objetivo de este trabajo fue estudiar la absorción de estos epitopes por estadios larvales del nematodo, a los fines de determinar el mecanismo de expresión de estos antígenos sobre la cutícula parasitaria. Las larvas fueron eclosionadas a partir de heces con huevos de este helminto. Fueron cultivadas en medio RPMI con eritrocitos P1. Se realizó la Técnica de Inhibición de la Aglutinación Semicuantitativa usando cuatro anticuerpos monoclonales anti-P1. El sistema revelador fue una suspensión de eritrocitos frescos P1 en medio enzimático de bromelina. Se investigaron por la misma técnica productos de excreción-secreción símil P1 usando larvas cultivadas en medio RPMI en ausencia de eritrocitos P1. Las larvas cultivadas con glóbulos rojos inhibieron la aglutinación de todos los anticuerpos monoclonales con los eritrocitos P1. No se identificaron productos de excreción- secreción símil P1. Se ha demostrado que las larvas de A. lumbricoides absorben epitopes P1 del medio de cultivo. Se concluye que el parásito puede absorber este antígeno durante su ciclo de vida para usarlo en el mimetismo molecular.

Palabras clave: Ascaris lumbricoides; Absorción; Epitopes P1

Summary

Molecular mimicry has been associated with chronicity of parasitic infections. This mechanism can be due to absorption of the host's molecules or to synthesis of similar molecules. P1 has been detected in various parasite species. Previous experiences have shown P1 epitopes in Ascaris lumbricoides's adult parasites. The aim of this study was to analyse absoption of these epitopes by nematode larvae in order to determine the mechanism by which the parasite can express these antigens on their cuticle. Larvae were hatched from the faeces with helminth eggs. Larvae were cultivated in RPMI medium with P1 red cells. The Quantitative Inhibition Agglutination Test was performed using 4 anti- P1 monoclonal antibodies. P1 fresh red cells in bromelin enzymatic medium was used as revealing system. Simil P1 excretory-secretory products were investigated using larvae cultivated in RPMI medium without P1 erythrocytes by the same technique. The larvae which were cultivated with red cells inhibited the agglutination between all anti- P1 monoclonal antibodies and P1 erythrocytes. Simil P1 excretory-secretory products were not identified. It was demonstrated that A. lumbricoides larvae absorb P1 epitopes from the culture medium. It can be concluded that the parasite can absorb this antigen during its life cycle in order to use it in molecular mimicry.

Keywords: Ascaris lumbricoides; Absorption; P1 epitopes

Introducción

Todas las infecciones parasitarias que progresan tienen en común que los parásitos pueden evadir los efectos totales de la respuesta inmune del hospedador y sobrevivir en éste durante largos períodos. Existe, por lo tanto, la necesidad de entender los mecanismos de supervivencia parasitaria. Mucho se ha hablado de las estrategias de evasión puestas en juego por los parásitos, y en especial del mimetismo molecular como responsable del mecanismo de cronicidad (1).
La evolución paralela del hospedador y del parásito podría haber provocado una similitud antigénica entre las dos especies. De este modo, se minimizaría la disparidad en la expresión de epitopes y la inmunogenicidad, lo que permitiría a los parásitos causar infecciones crónicas. Se han identificado dos mecanismos distintos de mimetismo: uno implica la absorción de moléculas del hospedador sobre la superLcie tegumental, entre las que se incluyen moléculas de Grupo Sanguíneo y del Complejo Mayor de Histocompatibilidad, y el otro mecanismo consiste en la expresión sobre la superficie del parásito de productos génicos con similitud a moléculas del hospedador (1).
Experiencias previas han demostrado la presencia de antígenos de los Sistemas de Grupo Sanguíneo ABO, P y Glob en Ascaris lumbricoides, los cuales han sido coincidentes con los epitopes expresados por sus hospederos, sugiriendo su participación en el fenómeno de mimetismo molecular (2-10).
Según la última nomenclatura de los Sistemas de Grupo Sanguíneo comunicada por la Sociedad Internacional de Transfusión Sanguínea, P1 es el único antígeno del Sistema P. La existencia de este único antígeno determina para este Sistema dos fenotipos: fenotipo 1, que presenta el antígeno P1 y fenotipo 2 en el que este antígeno se encuentra ausente (11). El fenotipo 1 se expresa en el 80% de los individuos de raza blanca, y el antígeno se encuentra en eritrocitos, linfocitos, granulocitos, monocitos y plaquetas. Este epitope ha sido identiLcado en especies parásitas (Ascaris suum, Fasciola gigantica, Paragonimus westermani, Echinococcus sp. y Dicrocelium dendriticum) y su forma soluble ha sido detectada en el líquido hidatídico (12).
Recientemente se ha determinado que el mimetismo molecular que involucra a los antígenos del Sistema ABO en A. lumbricoides es debido a un mecanismo de absorción (13). El objetivo de este trabajo fue estudiar la absorción de epitopes P1 por estadios larvales del parásito, a los fines de determinar el mecanismo de expresión de este antígeno sobre la cutícula del nematode.

Materiales y Métodos

Se trabajó con huevos de este helminto obtenidos de pacientes con ascariosis y concentrados por el método de Motación de salmuera (14). Los huevos se colocaron en SO4H2 0,1 N durante 24 días a 30 ºC hasta la observación microscópica de huevos larvados (15). Se removió la cubierta de los huevos con hipoclorito de sodio 1% (atmósfera de 5% CO2) por 30 min a 30 ºC. A continuación los huevos fueron colocados en el medio de eclosión hasta la completa liberación de las larvas.

MEDIO DE ECLOSIÓN

Por cada 0,5 mL de suspensión de huevos, se adicionó: 1 mL de bisulfito de sodio 0,1 M y 1 mL de cloruro de sodio 0,25 M (pre-gaseado conteniendo 0,0025% de Tween 80 y 0,1 M de bicarbonato de sodio) (15).
Las larvas fueron recolectadas en medio RPMI por el método de Baermann-Moraes (16). Se centrifugaron y se determinó por recuento la cantidad de 1100-1200 larvas/mL.
Se prepararon 2 tubos (Tubos 1 y 2) con 10 mL y uno con 3 mL (Tubo 3) de medio RPMI. A todos los tubos se les adicionó 1 mL de suspensión de larvas. Inmediatamente se agregaron 100 μL de sedimento de eritrocitos frescos P1 al Tubo 1. Los eritrocitos fueron tipificados con 4 anticuerpos monoclonales anti-P1 (2-89: IgA Clase, ≤0,5 μg/mL Concentración; 2-90: h IgM Clase, 5,51 μg/mL Concentración; 2-91: h IgM Clase, 87,2 μg/mL Concentración; 2-92: IgM Clase, ≤0,5 μg/mL Concentración) previo a su adición al medio de cultivo.
Los eritrocitos expresaban epitopes dirigidos hacia la totalidad de los anticuerpos monoclonales anti-P1 con los que se los tipificó. Los Tubos 2 y 3 (sin glóbulos rojos) fueron utilizados como control negativo y para investigar productos de excreción-secreción larvarios símil P1.
Todos los tubos se cultivaron durante 10 días a 30 ºC (atmósfera N2-CO2-O2). Una vez concluido el tiempo de cultivo, las larvas del Tubo 1 fueron separadas por el Método de Baermann-Moraes. Se lavaron en agua destilada 3 veces y se realizó un nuevo recuento que determinó la cantidad de 200-300 larvas/mL (Concentrado larval: [CL] 1).
En los Tubos 2 y 3 se separó el medio RPMI por centrifugación durante 10 min (2500-3000 rpm). Las larvas de estos dos tubos fueron lavadas 3 veces en agua destilada y concentradas por centrifugación. El recuento determinó 200-300 larvas/mL en el Tubo 2 ([CL] 2) y 600 larvas/mL en el Tubo 3 ([CL] 3).
Se realizó la técnica de Inhibición de la Aglutinación Semicuantitativa (IAS) (17) enfrentando el [CL] 1 contra los 4 anticuerpos monoclonales anti P1. Se usó como testigo negativo de la prueba el sedimento larval del Tubo 2 ([CL] 2) de similar concentración.
Para la realización de IAS se prepararon tres series de diluciones seriadas al medio de cada anticuerpo monoclonal (Puro, 1/2, 1/4, 1/8......1/1024), siendo el volumen final de cada dilución 20 μL. A todos los tubos de la primera serie se les agregaron 20 μL de solución fisiológica, a los de la segunda serie igual volumen de [CL] 1 y en la tercera serie (testigo negativo) se adicionaron 20 μL del concentrado de larvas del Tubo 2 ([CL] 2). Los tubos de las tres series se colocaron 30 min a 4 ºC para permitir la unión del anticuerpo monoclonal con el antígeno. El sistema revelador fue una suspensión de eritrocitos frescos P1 en medio enzimático de bromelina (17) y fue agregado a todos los tubos de las 3 series (20 μL en c/u). Se determinaron los títulos de los anticuerpos monoclonales por lecturas microscópicas (18) después de un tiempo de 12 horas a 4 ºC. Se consideró significativa una diferencia de título de dos o más diluciones entre la serie 1 con respecto a las series 2 y 3.
IAS fue realizada también, de manera similar a la descrita, en el medio RPMI de los Tubos 2 y 3 para investigar posibles productos de excreción-secreción símil P1 de las larvas. En la primera serie se adicionó solución fisiológica, en la segunda medio RPMI de los Tubos 2/3 y en la tercera serie (control negativo) medio RPMI (sin larvas).

Resultados

Los resultados mostraron que [CL]1 inhibió la aglutinación de los 4 anticuerpos monoclonales anti-P1 con los eritrocitos P1. Para todos los anticuerpos monoclonales se observó una diferencia de título de dos diluciones entre la primera serie (donde se agregó solución fisiológica) y la segunda donde se adicionó [CL]1. En la tercera serie (Control negativo), donde se agregó [CL]2 que había sido cultivado en ausencia de eritrocitos P1, los títulos de los anticuerpos monoclonales fueron iguales a los títulos obtenidos en la primera serie, a excepción del título del anticuerpo 2-91, que varió no significativamente en una dilución. Los resultados se muestran en la Tabla I.

Tabla I. Resultados de la inhibición de la aglutinación semicuantitativa para investigar la expresión de epitopes P1 en [CL]1 (Tubo 1).

No se identificaron productos de excreción-secreción símil P1 en el medio RPMI de los Tubos 2 y 3, ya que no hubo diferencias significativas de los títulos de los anticuerpos monoclonales entre la primera y segunda series, así como tampoco con respecto a la tercera (control negativo). Los resultados se muestran en la Tabla II.

Tabla II. Resultados de la inhibición de la aglutinación semicuantitativa para investigar productos de excreción-secreción simil P1 (Tubos 2 y 3).

Discusión y Conclusiones

La experiencia realizada demostró que las larvas de A. lumbricoides absorben epitopes P1 de los eritrocitos agregados al medio de cultivo. La coincidencia entre los títulos de los anticuerpos monoclonales de la primera serie y de la tercera (control negativo), permitió observar que las larvas no presentan epitopes P1 cuando no están en contacto con eritrocitos.
Por aplicación de la técnica de IAS se comprobó que el mecanismo de mimetismo que involucra epitopes P1 se debe a absorción de antígenos y no a la expresión sobre la superficie del parásito de productos génicos similares. Si se considera que P1 es un antígeno de alta frecuencia poblacional en los individuos de raza blanca, y que se encuentra expresado no sólo en el eritrocito sino en muchas células sanguíneas, se puede suponer que es una de las moléculas comúnmente involucrada en el mimetismo molecular. Esto explicaría la presencia de este epitope en las membranas de muchas especies parásitas (12).
La adquisición de antígenos de Grupo Sanguíneo a partir de eritrocitos agregados a los medios de cultivo fue inicialmente comunicada para Schistosoma mansoni (19). Basado en esas experiencias se demostró que A. lumbricoides también puede absorber epitopes A, B, y H de medios de cultivo a los que se les haya adicionado glóbulos rojos que expresen esas determinantes antigénicas (13).
Entre las estrategias de evasión parasitaria descritas, se ha comunicado el mimetismo como una forma de evasión del reconocimiento específico. Los antígenos de superficie representan mecanismos importantes de evasión de la respuesta inmune en parásitos extracelulares. La respuesta inmunológica puede evitarse cuando el parásito comparte estructuras moleculares con las del hospedador, pues de esta forma no se induce la activación de los linfocitos T y/ o B o se hace en forma poco eficiente (20).
Los productos de excreción –secreción de los parásitos han sido estudiados por las posibilidades diagnósticas que representan (21-24), pero también para comprender su rol en la respuesta inmune. Se ha comunicado, por ejemplo, que los productos de excreción-secreción de Fasciola hepatica disminuyen la generación de células productoras de anticuerpos contra antígenos timodependientes (25), así como también que son potentes inductores de la respuesta inmune humoral (21). En los productos de excreción-secreción de Toxocara canis y A. lumbricoides se han identificado sustancias semejantes a los antígenos de Grupo Sanguíneo ABO (13)(26) que podrían ser responsables de la presencia de isoaglutininas anti-A y anti-B en el suero de los pacientes parasitados (27). La detección de sustancias símil ABO condujo la búsqueda de sustancias símil P1 en los productos de excreción- secreción de A. lumbricoides, pero en la experiencia realizada estas sustancias no fueron identificadas en ninguno de los dos Tubos donde se investigaron. Este hecho puede deberse a que no se han producido estas sustancias o bien a que el número de larvas presentes no generó una cantidad suficiente de este producto para ser detectada por el método.
Esta experiencia in vitro sugiere que el parásito en su ciclo de vida, durante la migración por el torrente circulatorio, puede absorber epitopes P1 de su hospedador a los fines de utilizarlo para la evasión de la respuesta inmune por mimetismo molecular.

CORRESPONDENCIA

DRA. PATRICIA PONCE DE LEÓN
Laboratorio de Parasitología. Dpto. de Microbiología
Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas
Suipacha 531, 2000 ROSARIO, Santa Fe, Argentina
E-mail: tefu1958@hotmail.com

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Aceptado para su publicación el 2 de febrero de 2010.