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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.44 no.4 La Plata oct./dic. 2010

 

BIOQUÍMICA CLÍNICA

Seguimiento del perfil proteico urinario en el trasplante renal

Follow-up of urine protein profile in renal transplant

María Laura Facio1 a, Leticia Madalena2 a, María del Carmen Bacqué3 b, Laura Idiarte3 b, Marcela Pandolfo1 a, Margarita Angerosa2 a, Mariel Alejandre1 a, Susana Fraind1 a, Pablo Bresciani1 a, Marco Pizzolato2 a

1 Bioquímico.
2 Doctor en Bioquímica.
3 Médico.

a Departamento de Bioquímica Clínica. Laboratorio de Proteínas. INFIBIOC. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. Argentina.
b Programa de Trasplante Renal. Hospital de Clínicas "José de San Martín". Universidad de Buenos Aires.

Resumen

La nefropatía crónica del trasplante (NCT) se caracteriza por fibrosis intersticial y atrofia tubular, pero su etiología es diversa. El objetivo del trabajo fue evaluar el seguimiento cualitativo de proteínas urinarias en pacientes con más de seis años de trasplante renal y compararlo con parámetros de laboratorio y con biopsia renal. Se evaluaron 17 pacientes durante un año, a través de creatinina sérica, proteinuria y fraccionamiento proteico por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) en una y dos dimensiones con coloración argéntica. Todos los pacientes con biopsias características de nefropatía crónica del trasplante presentaron un perfil tubular y aquellos con glomerulopatía del trasplante evidenciaron un perfil predominantemente glomerular. Los cambios en el perfil tubular se asociaron a infecciones urinarias, pulmonares e intestinales y a una respuesta inmunológica en el límite al rechazo (borderline), aún sin modificaciones evidentes en la creatinina sérica ni en la proteinuria. La electroforesis bidimensional permitió detectar claramente las proteínas orosomucoide y zinc alfa-2 glicoproteína, aparentemente asociadas a hialinosis arteriolar por toxicidad causada por ciclosporina. La electroforesis SDS-PAGE permitió identificar el sitio de lesión en el nefrón y cambios en la evolución, aún en presencia de vestigios de proteinuria. Las electroforesis SDS-PAGE mono y bidimensional se plantean como complemento para la evaluación de la condición clínica del paciente trasplantado renal crónico.

Palabras clave: Trasplante renal; Nefropatía crónica; Electroforesis en gel de poliacrilamida; Ciclosporina; Hialinosis arteriolar

Summary

Post-transplant chronic nephropathy is characterized by interstitial fibrosis and tubular atrophy. These alterations are non-specific, but the glomerular and vascular lesions help to differentiate the etiological causes. The aim of this study was to determine the qualitative follow-up study of urine proteins in patients, six years after receiving a renal transplant, and compare their relationship to laboratory parameters and renal biopsy. The evolution of 17 patients with renal transplant was studied for one year, through serum creatinine, proteinuria, and polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecylsulfate (SDS-PAGE) in one and two dimensions with silver staining. The patients with chronic nephropathy by renal biopsy presented a tubular profile of urinary proteins, and those who presented glomerulopathy showed a predominant glomerular profile. Changes in the tubular profiles during the follow-up study were associated to urinary tract, pulmonary, and intestinal infections, as well as borderline rejection, even without evident changes in either proteinuria or serum creatinine. The bidimensional electrophoresis clearly marked the orosomucoid proteins and zinc alpha-2 glycoprotein, generally associated to arterial hyalinosis due to ciclosporin toxicity. Even with traces of proteinuria, SDS-PAGE with silver staining made it possible to identify the renal lesion location. It also enabled the detection of the stable profiles of urinary proteins and changes in the evolution, without modification of serum creatinine. SDS-PAGE in one and two dimensions is used as a complement in the evaluation of renal transplant patients' clinical condition.

Key words: Renal transplant; Chronic nephropathy; Polyacrylamide gel electrophoresis; Cyclosporine; Arterial hyalinosis

Introducción

La nefropatía crónica del trasplante (NCT), según la definición de la "Clasificación de Banff de patologías del trasplante renal", se caracteriza por la presencia de fibrosis intersticial y atrofia o pérdida tubular. Estas alteraciones son inespecíficas, no obstante, las lesiones glomerulares y vasculares ayudan en la diferenciación de los cuatro grupos que incluye el término de NCT: rechazo crónico, toxicidad por ciclosporina, enfermedad vascular hipertensiva, e infección crónica y/o reflujo (1). El engrosamiento de la íntima de la arteria por fibrosis así como también la glomerulopatía del trasplante, sugieren la presencia de rechazo crónico, pero esta última sólo ocurre en un 15% de los pacientes trasplantados (1)(2). La patogénesis de la nefropatía crónica por ciclosporina (CyA) se relaciona, entre otras causas, con la hipoperfusión que causa fibrosis intersticial medular en banda y atrofia tubular. La contracción severa y persistente de las células musculares arteriolares puede llevar a la pérdida de la contractilidad y de la viabilidad celular, con la consecuente lesión hialina arteriolar (3).
El daño tubular y/o glomerular puede detectarse en el laboratorio a través de la separación de proteínas por su peso molecular (PM) mediante el uso de la electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). La variante de SDS-PAGE en dos dimensiones (2D), que consta de un primer paso de separación electroforética por carga y un segundo paso de separación por PM, permite un mayor espectro de visualización de los distintos perfiles proteicos urinarios (4). Son métodos ampliamente difundidos en la investigación clínica pero no se utilizan habitualmente en la práctica asistencial (5-9). La SDS-PAGE en una dimensión fue comparada con el uroproteinograma electroforético en acetato de celulosa, resultando la primera una técnica de mayor sensibilidad para la detección del daño tubular (10)(11). El objetivo del presente trabajo fue realizar el seguimiento del perfil proteico urinario por SDS-PAGE en pacientes trasplantados renales con más de 6 años de evolución, y correlacionarlo con la clínica del paciente y/o con la histopatología de la biopsia renal, con el fin de detectar cambios en el mismo que pudieran orientar hacia la etiología de la nefropatía crónica del trasplante.

Materiales y Métodos

El trabajo se realizó entre los años 2006 y 2008. Se siguió la evolución de cada paciente con trasplante renal durante un año. Se estudiaron 17 pacientes (7 varones, 10 mujeres) provenientes del Programa de Trasplante del Hospital de Clínicas. Tiempo post-trasplante: 6-26 años; inmunosupresión: 9 = MP (melfalan) + MMF (mycofenolato mofetil) + CyA (ciclosporina); 7 = MP + MMF/AZA (azatioprina) + SRL (sirolimus); 1 = MP + MMF y 1 = MP + AZA. Los pacientes que recibieron SRL fueron previamente tratados con CyA. Ninguno de los pacientes era diabético. Se determinaron los parámetros clásicos: proteinuria (PT) con el reactivo de Exton, creatinina sérica por el método de Jaffé cinético y biopsia renal en alguno de ellos. Los parámetros a evaluar fueron: estudio del perfil proteico urinario (PPU) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) con coloración argéntica (12) en una y dos dimensiones (2D) (4).
Las muestras de orina de 24 horas se fraccionaron en alícuotas y se almacenaron a -20 ºC después del agregado de azida sódica a una concentración final de 0,1 g/L
hasta la corrida electroforética en SDS-PAGE al 12,5% de concentración final. La orina de cada paciente se corrieron en el mismo gel junto con un control interno de coloración. Dicho control es una orina tubular que contiene beta 2 microglobulina, cuando ésta se visualiza se frena la coloración.
Para realizar SDS-PAGE en 2D se realizó previamente la corrida electroforética de la orina por duplicado en acetato de celulosa gelatinizado con buffer para electroforesis (Britania) a 200 V durante 30 min. Una de las corridas se coloreó con tinción argéntica y la otra se introdujo conjuntamente con el gel de apilamiento; cuando éste gelificó se inició la corrida a 200 V durante 45 min en poliacrilamida al 12,5%.
Para la identificación de la proteína orosomucoide (Oroso) y zinc-alfa-2 glicoproteina (ZAG) se realizó previamente SDS-PAGE 2D, con posterior immunoblotting con antisueros específicos anti-orosomucoide (Dako) y anti-IgG de conejo (Sigma) marcado con peroxidasa como segundo anticuerpo; y para la proteína ZAG se realizó espectrometría de masas (ESI-TRAP MS/MS) y comparación con base de datos Sequest y Mascot.
Los criterios para definir los PPU mediante SDS-PAGE fueron: para el tipo glomerular, la presencia de albúmina (Alb) y proteínas de PM mayor a 67 kDa, y para el tipo tubular, la presencia de Alb, alfa 1-microglobulina (30 kDa) y cualquier otra proteína de PM menor a 30 kDa (11).
Las biopsias fueron caracterizadas según la clasificación de Banff de 1993 (1).

Resultados

En la Tabla I se registran resultados del seguimiento de los 17 pacientes, de los cuales 11 poseían estudio de biopsia renal. Los valores de creatinina sérica y proteinuria se expresan en rangos, los cuales muestran el mínimo y máximo valor alcanzado en ese período.

Tabla I. Resultados del seguimiento de los 17 pacientes con trasplante renal.

Las 11 biopsias mostraron alteraciones compatibles con toxicidad por ciclosporina, y todos los perfiles en SDS-PAGE evidenciaron un compromiso tubular. Dos de ellas muestran glomerulopatía del trasplante y en el perfil de SDS-PAGE se observaron alteraciones predominantemente glomerulares, mientras que en el resto de los pacientes las alteraciones fueron predominantemente tubulares, compatibles con la NCT. Ninguno de los pacientes con menos de 10 años de realizado el trasplante renal, presentó glomerulopatía asociada.
De las 11 biopsias estudiadas, sólo 4 coincidieron cronológicamente con el estudio proteico urinario. El único paciente con dos biopsias fue el número 11, con tres años de diferencia entre ambas y no se evidenciaron cambios histológicos significativos entre las mismas.
El paciente 1 presentó todos sus valores dentro de la normalidad. La Figura 1 muestra el perfil fisiológico de SDS-PAGE. No se le realizó biopsia renal y fue tratado con ciclosporina.


Figura 1. Paciente 1. Muestras de orina correspondiente a las siguientes fechas: 1) 23-10-06; 2) 27-03-07; 3) 25-07-07

El paciente 8 presentó, durante toda la evolución, vestigios de proteinuria con un uroproteinograma fisiológico. Sin embargo, la SDS-PAGE por su sensibilidad permitió reclasificar la proteinuria como de origen tubular. Este paciente evidenció, a lo largo del año de seguimiento, 3 intercurrencias. Una, en la cual se observa un incremento de las proteínas tubulares, fue considerada en el límite del rechazo (borderline), luego recibió tres pulsos de metilprednisolona y se observó disminución de las mismas. En enero del 2007 se internó por infección urinaria, fiebre, aumento de la creatinina sérica y se visualizó un incremento en las proteínas de origen tubular. En julio de 2007 tuvo otra internación con dolores abdominales tipo cólico donde se intensificaron las bandas proteicas y se interpretó como insuficiencia renal crónica reagudizada de causa pre-renal, asociada a episodios de diarrea (Fig. 2).


Figura 2. Paciente 8. Muestras de orina correspondiente a las siguientes fechas: 1)10-10-06; 2) 07-11-06; 3) 27-11-06; 4) 11-12-06; 5) 18-12-06; 6) 10-01-07; 7) 17-01-07; 8) 22-01-07; 9) 29-01-07; 10) 06-03-07; 11) 24-04-07; 12) 19-07-07; 13) 06-08-07

El paciente 16 presentó en la biopsia renal del año 2003 una glomerulopatía del trasplante y hialinosis arteriolar moderada, y el PPU por SDS-PAGE reveló una alteración predominantemente glomerular (Fig. 3).


Figura 3. Paciente 16. Muestras de orina correspondiente a las siguientes fechas: 1) 13-10-06; 2) 24-10-06; 3) 04-01-07; 4) 19-03-07; 5) 17-05-07; 6) 29-06-07; 7) 13-09-07

El paciente 4 no tuvo indicación de biopsia, y en el gel de SDS-PAGE se observó un cambio en la evolución desde un perfil tubular a un perfil mixto (glomérulotubular) a partir de una intercurrencia que comenzó con tos y expectoraciones, seguido de su internación. No presentó cambios en el valor de la proteinuria ni en el de creatinina sérica (Fig. 4).


Figura 4. Paciente 4. Muestras de orina correspondiente a las siguientes fechas: 1) 23-10-06; 2) 19-12-06; 3) 09-04-07; 4) 11-06-07; 5) 13-08-07

Los perfiles característicos de SDS-PAGE en una dimensión fueron confirmados por electroforesis en 2D. Mediante esta última pudo observarse un grupo de proteínas con movilidad electroforética entre alfa-1 y alfa-2 globulinas y un PM entre 40 y 60 kDa (Fig. 5). Estas proteínas aniónicas son: orosomucoide (Oroso) o alfa-1 glicoproteína ácida de 41 kDa, la proteína que une la vitamina D o Gc globulina (DBP) con un PM comprendido entre 50-58 kDa, glicoproteína alfa-2 que precipita con sales de zinc (ZAG) (PM 41 kDa) y alfa-1 antitripsina (A1AT) (PM 45 kDa).


Figura 5. Electroforesis bidimensional. Paciente 4 trasplantado renal proteinuria mixta.
A1AT: alfa 1-antitripsina, Oroso: orosomucoide; GC o DBP: proteína que une a la vitamina D; ZAG: zinc alfa 2-glicoproteína
Orosomucoide identificada por "immunoblotting"
ZAG identificada por espectrometría de masas

En la Figura 6 se muestra la electroforesis 2D de la orina correspondiente al día de la biopsia del paciente 15 con diagnóstico de severa toxicidad por CyA, la cual presentó las proteínas Oroso y ZAG, principalmente. En el transcurso del año se observa un cambio del PPU desde glomerular a mixto.


Figura 6. Paciente 15. Muestras de orina correspondiente a las siguientes fechas: 1) 11-05-2007, 2) 13-09-2007, 3) 11-02-2008, 4) 12-03-2008, 5) 25-09-2008.
Fecha de la biopsia renal (PBR): 13-09-2007: Severa lesión vascular por CyA.

El paciente 13 es el único paciente biopsiado que no presentó hialinosis arteriolar en la histología, mientras que se observaron otras manifestaciones de toxicidad por CyA, como la vacuolización isométrica en las células tubulares. En este paciente se detectó una proteinuria mixta, pero en la electroforesis 2D no presentó ninguna de las proteínas antes mencionadas.
Hubo dos pacientes que nunca recibieron CyA, el paciente 17 que presentó hialinosis arteriolar en la biopsia y las proteínas aniónicas en la electroforesis 2D; y el paciente 5, al que no se le realizó biopsia y en el que dichas proteínas estuvieron ausentes.

Discusión y Conclusiones

Se evaluó el seguimiento del perfil proteico urinario durante un año de 17 pacientes con más de 6 años de realizado el trasplante renal, con el fin de detectar diferencias en el mismo con respecto a las diversas etiologías de la NCT, según la clasificación histopatológica de Banff en la Conferencia de 1993.
La proteinuria tubular detectada por SDS-PAGE reflejó la NCT, la cual se caracteriza por fibrosis intersticial y atrofia tubular. Según la severidad de las mismas, se las clasifica por grados desde I a III (1). En el presente estudio no se han podido relacionar los grados de severidad del daño tubulointersticial con los distintos perfiles proteicos tubulares debido a que sólo cuatro biopsias coincidieron cronológicamente con el tiempo de seguimiento, no obstante se asume que los daños son irreversibles (1)(2).
Se han evidenciado cambios en el perfil tubular durante el seguimiento por SDS-PAGE cuando el paciente presentó intercurrencias consideradas como en el límite al rechazo, infección urinaria, respuesta al tratamiento con metilprednisolona, causas post-renales asociadas con episodios de diarrea o de tos y expectoraciones. Alguno de ellos no mostraron cambios en el valor de la proteinuria ni de la creatinina sérica. Por lo tanto, en este grupo de pacientes trasplantados renales, el perfil de SDS-PAGE permitió identificar el sitio de lesión con vestigios de proteinuria, detectar perfiles estables y cambios en la evolución.
Las lesiones tubulointersticiales no son específicas, por sí mismas no pueden diagnosticar un rechazo crónico o toxicidad crónica por CyA; sin embargo, en casos de lesiones extensas de arteriopatía del trasplante, la microangiopatía por CyA o la glomerulonefritis, permiten descubrir la causa de la atrofia y fibrosis intersticial.
Es así que las lesiones arteriales como coagulación in
travascular, necrosis, infiltración celular, proliferación y esclerosis son los sellos del rechazo vascular, mientras que lesiones arteriolares con depósitos proteicos de tipo circular, focal o nodular en la media lo son de la toxicidad por CyA (3).
Al realizar la electroforesis 2D se abre el espectro proteico permitiendo visualizar un grupo de proteínas, similares en carga y peso molecular, que no parecen responder a un patrón estrictamente glomerular o tubular. Dichas proteínas son orosomucoide, Zinc alfa-2 glicoproteína, alfa-1 antitripsina y la proteína Gc o transportadora de la vitamina D (DBP).
El paciente 15, con severa toxicidad por CyA presentó, principalmente, las proteínas orosomucoide y ZAG. El cambio de PPU desde un daño glomerular a mixto con el continuo tratamiento con CyA provocó injuria progresiva de microvasos renales, la cual es raramente reversible, y tiene el potencial de avanzar a la falla renal final. La arteriola aferente es el vaso más susceptible a la resistencia vascular por los efectos constrictores de la CyA (13).
En las orinas de los pacientes trasplantados suelen observarse todas o sólo alguna de esas proteínas, las cuales, a excepción de la ZAG, ejercen funciones inmunomoduladoras y protectoras durante el proceso inflamatorio (14-17).
De las 11 biopsias con toxicidad por CyA, sólo una muestra de orina no presentó ninguna de las proteínas de dicho grupo, de manera coincidente con la ausencia de hialinosis arteriolar en la biopsia renal.
Por otro lado, la proteína Oroso no sólo es sintetizada por el hígado sino que también puede ser sintetizada por otros tejidos o células, como el endotelio vascular (18). Interviene, aparentemente, en la permoselectividad de la barrera glomerular aportando cargas negativas al glicocálix del endotelio (19). Además, el Oroso en orina se ha descripto como un poderoso marcador de mortalidad cardiovascular en pacientes normoalbuminúricos con diabetes tipo 2 (20).
Recientemente, en un estudio en ratas tratadas con altas dosis de ciclosporina, se evidenció un cambio del perfil proteico plasmático con aumento en la expresión de orosomucoide (21).
En el grupo de pacientes trasplantados renales estudiados en el presente trabajo, el perfil de excreción por SDS-PAGE evidenció el daño tubular y glomerular confirmado en la histología renal, aún con vestigios de proteinuria. El seguimiento del perfil proteico tubular acompañó los cambios clínicos debidos a infecciones urinarias, pulmonares e intestinales y a rechazo borderline. Si bien las distintas causas de nefropatía crónica del trasplante no se han podido diferenciar por el perfil proteico, el grupo de proteínas que incluye al orosomucoide podría sugerir toxicidad crónica por CyA debido al daño arteriolar que evidencia la hialinosis arteriolar. Hasta el momento, en el estudio proteico urinario por SDS-PAGE de pacientes trasplantados de más de 6 años, se podría inferir la tubulopatía observada con la nefropatía crónica del trasplante, y la glomerulopatía con la glomerulopatía del trasplante según la respectiva biopsia renal.
La SDS-PAGE mono y bidimensional se plantea como complemento en la evaluación de la condición clínica del paciente trasplantado renal crónico.

CORRESPONDENCIA

DRA. MARÍA LAURA FACIO
Departamento de Bioquímica Clínica
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Hospital de Clínicas José de San Martín
Junín 956
1113 - CIUDAD DE BUENOS AIRES, Argentina
E-mail: mlfacio@hotmail.com

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Aceptado para su publicación el 21 de septiembre de 2010