PARASITOLOGÍA

Acanthamoeba spp. en piscinas cubiertas de la ciudad de Bahía Blanca, provincia de Buenos Aires, Argentina

Acanthamoeba spp. in indoor swimming pools in Bahía Blanca city, Buenos Aires province, Argentina

María Laura Gertiser¹, Elena Visciarelli², Norma Basabe¹, María José Perez¹, Sixto Raúl Costamagna²

1. Bioquímica.
2. Doctor en Bioquímica.

* Cátedra de Parasitología Clínica. Dpto. de Biología, Bioquímica y Farmacia. Universidad Nacional del Sur. San Juan 670 (8000) Bahía Blanca. Buenos Aires. Argentina. Tel.: 0291- 4595100 int.: 2421.

Resumen

Acanthamoeba ha sido aislada de numerosos hábitats incluyendo piletas de natación. Estudiar su distribución es importante ya que algunas especies causan enfermedad en el hombre. El objetivo del presente trabajo fue la búsqueda, aislamiento y caracterización de protozoos del género Acanthamoeba en piscinas cubiertas de la ciudad de Bahía Blanca, Argentina, en las cuatro estaciones del año durante 2007-2008. Se estudiaron 7 piscinas y en cada una se tomaron cuatro muestras: fondo, superficie, raspado de pared y para análisis bacteriológico. Las muestras se analizaron por observación directa y por cultivo en agar no nutritivo a 37 °C y a 42 °C. La identificación genérica se realizó de acuerdo con las características morfológicas de quistes y trofozoítos y para identificar Naegleria se realizó la prueba de transformación ameboflagelar. En 5 de las 7 piscinas se aislaron amebas de vida libre al menos en una época del año. La prueba de transformación ameboflagelar resultó negativa, descartando al género Naegleria. Todos los aislamientos correspondieron al género Acanthamoeba Grupos II y III de Pussard y Pons. Si bien la eliminación de Acanthamoeba en las aguas de natatorios resulta muy difícil por tratarse de un protozoario ubicuo y sumamente resistente a los desinfectantes comúnmente utilizados, se recomienda una limpieza profunda de las piscinas que minimice los riesgos de infección.

Palabras clave: Acanthamoeba; Amebas de vida libre; Piscinas; Protozoos; Aguas; Bahía Blanca

Summary

Acanthamoeba spp. has been isolated from many habitats, including swimming pools. Investigations on its distribution are relevant because many of its species cause human diseases. The aim of the present work was to investigate, isolate and characterize protozoan of the genus Acanthamoeba from indoor swimming pools in Bahía Blanca, Argentina, in the four seasons, during the 2007-2008 period. Seven pools were studied and samples were collected from the bottom, surface and wall by scraping them. Besides, samples for bacteriological analysis were taken from each pool. The samples were analyzed by direct observation and by culturing on non nutritive agar at 37 °C and at 42 °C. The generic identification was performed according to the morphologic characteristics of cysts and trofozoites, while the amoebo-flagellate transformation test was carried out to identify Naegleria. Free-living amoebas were isolated from five of the seven swimming pools examinated, in at least one season. Naegleria genus was not found as the amoebo-flagellate transformation tests were negative in all samples. All the isolations corresponded to the genus Acanthamoeba belonging to Pussard & Pons morphological Groups II and III. Although elimination of Acanthamoeba from the water is difficult because it is a ubiquitous protozoan. which is highly resistant to the commonly used disinfectants, a thorough cleaning of the pools to minimize the risks of infection is recommended.

Key words: Acanthamoeba; Free-living amoeba; Swimming pool; Protozoan; Water; Bahía Blanca

Introducción

Acanthamoeba es un protozoo anfizoico de amplia distribución ambiental. Ha sido aislada del suelo, polvo, aire, agua natural y tratada, agua de mar, sedimento oceánico, de piscinas, aguas residuales, lagos, lagunas y acuarios (1). La información sobre su ecología y distribución es sumamente importante ya que en este género se encuentran especies que son potencialmente patógenas para el hombre tales como A. castellanii, A. culbertsoni, A. hatchetti, A. healyi, A. polyphaga, A. rhysodes, A. astronyxis y A. divionensis (2).
Acanthamoeba spp. puede ocasionar: Queratitis Acanthamoebiana (QA) una infección crónica de la córnea con compromiso serio de la visión, principalmente en usuarios de lentes de contacto; Encefalitis Granulomatosa Amebiana (EGA) que afecta el sistema nervioso central y desencadena la muerte del paciente en pocos días; Acanthamoebosis Cutánea (AC) caracterizada por lesiones ulcerosas supurativas en la piel y sinusitis. Las tres últimas patologías sólo se presentan en individuos inmunocomprometidos (3-5).
En su ciclo de vida Acanthamoeba alterna entre los estadios de trofozoíto y quiste, dependiendo de las condiciones de crecimiento (2)(6). Los trofozoítos son la forma infectiva, con capacidad replicativa e invasiva. Los quistes representan el elemento de resistencia y diseminación, pudiendo permanecer viables por más de 20 años (7)(8).
Acanthamoeba posee características morfológicas propias. En los trofozoítos se destacan proyecciones citoplasmáticas espinosas sobre su superficie, denominadas acantópodos, que le dan nombre al género, núcleo único con nucléolo central esférico y refringente, y vacuolas de exclusión de agua (9-11). Los quistes se caracterizan por presentar una doble pared, endo y exoquiste, rodeando a una estructura estrellada o poliédrica. Estos caracteres fueron definidos por Page (11) como criterio suficiente para la clasificación a nivel de género.
Posteriormente, Pussard y Pons (12) dividieron a las especies de Acanthamoeba en tres Grupos según el tamaño y las características morfológicas de sus quistes. Grupo I caracterizado por quistes grandes (>18 μm) con endoquiste estrellado y ectoquiste esférico (A. astronyxis, A. comandoni, A. echinulata, y A. tubiashi). Grupo II, quistes más pequeños (<18 μm), endoquiste poligonal y ectoquiste arrugado (A. castellanii, A. polyphaga, A. rhysodes, A. mauritaniensis, A. divionensis, A. griffini, A. lugdunensis, A. quina, A. hatchetti, y A. triangularis) y Grupo III, con quistes pequeños (<18 μm), endoquiste redondo o suavemente angular y ectoquiste ligeramente arrugado (A. culbertsoni, A. lenticulata, A. palestinensis, A. pustulosa, y A. royreba).
En la actualidad la clasificación puede hacerse en base a la secuenciación del 18s rARN, siendo posible distinguir 15 genotipos diferentes, T1 a T15 (1)(13-18).
Teniendo en cuenta que el agua es una de las principales vías de transmisión de este microorganismo (19), el objetivo de este trabajo fue la búsqueda, aislamiento y caracterización de Acanthamoeba en piscinas cubiertas de la ciudad de Bahía Blanca, Argentina, en las cuatro estaciones del año durante 2007-2008.

Materiales y Métodos

Se estudiaron 7 piscinas cubiertas de la ciudad de Bahía Blanca, provincia de Buenos Aires, Argentina durante la primavera de 2007 y verano, otoño e invierno de 2008. En cada pileta se tomaron, por estación, cuatro muestras en frascos de vidrio estériles de 470 mL de capacidad, tres para la búsqueda de Acanthamoeba: una del fondo, una de la superficie y una de raspado de pared; la cuarta se destinó al análisis bacteriológico. Se recolectaron 84 muestras para investigar la presencia de amebas de vida libre (AVL). En cada establecimiento se registraron datos de la temperatura ambiental, temperatura del agua, pH y concentración de cloro.
Las muestras se dejaron decantar en el laboratorio durante 24 horas, luego se desechó el sobrenadante reteniendo un volumen de aproximadamente 40 mL, que fue centrifugado a 1500 rpm durante 10 min. Del sedimento se realizaron dos preparados entre porta y cubreobjetos para observación microscópica directa y se obtuvieron los inóculos para los cultivos. Se sembraron 100 μL del sedimento en dos placas de Petri con agar no nutritivo (ANN) cubierto con una película de Escherichia coli, "Medio de Page" (20). Una placa fue incubada a 37 °C; la otra a 42 °C con el fin de aislar cepas termotolerantes. Estas placas se mantuvieron durante 15 días, examinándolas cada 24 horas bajo microscopio. Las muestras fueron consideradas negativas cuando no hubo crecimiento después de 15 días de incubación. Cuando existió desarrollo se procedió a estudiar las características morfológicas de trofozoítos y quistes. De cada aislamiento se midieron, con ocular micrométrico, 30 trofozoítos y 30 quistes. La identificación genérica se realizó según Page (20) y para identificar Naegleria se procedió a la prueba de transformación ameboflagelar (21).
Los quistes de Acanthamoeba aislados fueron observados en fresco al microscopio óptico, registrándose el número de brazos y las características de la pared quística. Según esas observaciones se los agrupó de acuerdo a la clasificación de Pussard y Pons (12).
Para determinar la calidad bacteriológica del agua de las piscinas muestreadas se realizó la prueba de Recuento de heterótrofas en Placa (RHP). Un mL de la muestra original y de las diluciones seriadas hasta 1/100, se sembró por la técnica de agar volcado en cajas de Petri con agar Plate Count. Se incubaron en estufa a 32 °C durante 48 horas y se realizó el recuento de colonias desarrolladas como Unidades Formadoras de Colonia (UFC)/ mL.

Resultados

Los datos de temperatura ambiental, temperatura del agua, pH, concentración de cloro y RHP se muestran en la Tabla I. La concentración de cloro permitida por reglamento municipal es de hasta 2 ppm.

Tabla I. Datos fisicoquímicos y biológicos obtenidos durante el muestreo estacional y aislamientos de Amebas de Vida Libre en piscinas cubiertas de Bahía Blanca en el período 2007/08.

En 5 de las 7 piscinas (71%) se aislaron AVL en las placas incubadas a 37 ºC al menos en una época del año (Tabla I). Del total de muestras (n: 84) donde se investigó la presencia de AVL, 22 (26%) fueron positivas para Acanthamoeba. El examen directo de todas las muestras fue negativo. Los 22 aislamientos de Acanthamoeba se repartieron de la siguiente forma: 6 (27%) del fondo de las piscinas; 8 (36,5%) de superficie y 8 (36,5%) de las recolectadas por raspado de pared (Fig. 1).

Figura 1. Porcentaje de muestras positivas por sitios de muestreo.

La positividad por estación se muestra en la Figura 2 con 57% de muestras positivas en invierno y primavera y 29% en otoño y verano.

Figura 2. Porcentaje de positividad de las muestras por estación.

A los aislamientos se los agrupó por piscina y por estación, ya que las amebas aisladas en cada uno de ellos presentaban las mismas características morfológicas, reduciéndose el número a 12 (Tabla II). En todos los casos las especies halladas se correspondieron morfológicamente con el género Acanthamoeba. En la observación microscópica los trofozoítos mostraron un movimiento lento típicamente ameboide, por emisión de seudópodos y finas proyecciones citoplásmicas, los característicos acantópodos; un tamaño variable entre 13,5 μm y 25,5 μm, núcleo refringente y vacuolas de exclusión de agua muy visibles que se contraían y desaparecían intermitentemente (Fig. 3). Los quistes presentaron un tamaño entre 6,3 μm y 13,4 μm y doble pared: una externa, irregular o lisa y gruesa (exoquiste), y otra interna (endoquiste) más fina y lisa, poliédrica o esférica, criterio utilizado para la clasificación del género Acanthamoeba en Grupos de Pussard y Pons (12) (Figs. 4 y 5). Los aislamientos correspondieron, 8 al Grupo II y 4 al Grupo III (Tabla II).

Tabla II. Aspectos morfológicos de quistes y trofozoítos de los aislamientos obtenidos de piscinas cubiertas.

Figura 3. Trofozoítos de Acanthamoeba spp. en fresco con las características propias del género. * acantópodos, Gechas negras: vacuolas de exclusión de agua, Gechas blancas: núcleos.

Figura 4. Quistes de Acanthamoeba spp. Grupo II. Flecha negra: exoquiste; Gecha blanca: endoquiste; * Brazos.

Figura 5. Quistes de Acanthamoeba spp. Grupo III

La prueba de transformación ameboflagelar resultó negativa para todos los casos (Tabla I). Los cultivos incubados a 42 °C no mostraron desarrollo.

Discusión y Conclusiones

En este trabajo, las observaciones microscópicas directas de todas las muestras resultaron negativas, incluso las de aquellas que luego se positivizaron en el cultivo. Este hecho resalta la importancia del cultivo en ANN, que brinda las condiciones necesarias para aumentar la sensibilidad del estudio. Otros autores (22)(23) hallaron mayor correlación entre las observaciones directas y los cultivos pero con muestras de agua expuestas al aire libre (piscinas descubiertas, arroyos y ríos).
Según lo publicado, la incubación de las muestras a 42 °C permitiría el crecimiento selectivo de amebas pertenecientes al género Nagleria, suprimiendo o impidiendo el desarrollo de otras especies presentes en la muestra (24). El hecho de que no hubiera desarrollo en ningunas de las muestras incubadas a esta temperatura y que las pruebas de transformación amebofalgelar resultaran negativas, permitiría descartar la presencia de este género en las muestras estudiadas.
El crecimiento de Acanthamoeba a 37 °C facilitaría su comportamiento como patógeno potencial, ya que demuestra la capacidad de crecimiento a la temperatura corporal humana (25). Sin embargo, para demostrar la virulencia de un aislamiento de Acanthamoeba, es necesario realizar cultivos celulares y/o inoculación en animales de experimentación.
Del total de piscinas estudiadas sólo dos resultaron negativas. En ambas se observaron condiciones distintivas respecto del resto, que eran más antiguas y en las que se realizaba cloración y filtración de agua tradicionales. Una de ellas (piscina 6) poseía un sistema robotizado de cloración y limpieza permanente de las paredes de la pileta, con lo cual se minimizaría el crecimiento de microorganismos que pudieran actuar como sustento para la proliferación de Acanthamoeba; además, el agua que abastecía la piscina era tratada por un sistema compuesto por varios filtros ubicados consecutivamente. La otra (piscina 7) había sido refaccionada previo al inicio del muestreo reemplazándose todo el interior de la misma. El material nuevo reduciría la formación de biofilms y consecuentemente la proliferación de amebas, ya que, según algunos estudios, la formación de biofilms sobre la superficie de las lentes de contacto aumentaría la afinidad de unión y favorecería el crecimiento de Acanthamoeba (26-28). Si se trasladan estas observaciones a la formación de biofilms sobre las paredes de las piscinas se podría inferir que tienen el mismo efecto. En concordancia con otros autores (29) no se halló correlación entre la calidad bacteriológica del agua y el aislamiento de Acanthamoeba.
Los quistes de Acanthamoeba spp pueden llegar a las piscinas por el aire (30), por el agua que se utiliza para su llenado (31)(32) o ser transportados por los bañistas (33). Todas estas fuentes son difíciles de controlar, de manera que investigar la presencia de Acanthamoeba y determinar las especies presentes es relevante para tomar medidas profilácticas tendientes a disminuir los riesgos de infección en los usuarios de piscinas.
La distribución de las AVL en las piscinas no es homogénea dependiendo de numerosos factores tales como la biología del parásito, tipo de recirculación del agua, material utilizado en su construcción, tipos de filtración del agua, métodos de desinfección, frecuencia de bañistas, el tiempo de uso de la piscina, y acúmulo de sustancias orgánicas (34). Como se muestra en la Figura 1, el mayor número de muestras positivas correspondió a la superficie del agua y al raspado de pared. Esto podría deberse a una mayor exposición de la superficie del agua al aire, una de las fuentes de provisión de quistes, y a la formación sobre la pared de biofilms, que sustentarían la adhesión y el crecimiento de Acanthamoeba y otros microorganismos (29).
La distribución estacional (Figura 2) muestra que el mayor número de aislamientos positivos se registró en las estaciones de invierno y primavera, lo que coincide, según comunicación de los propietarios de piscinas, con los meses en que concurren la mayor cantidad de bañistas a las mismas. Esto estaría en concordancia con que las personas también son fuente de contaminación de las aguas, ya que es posible que transporten AVL sobre su cuerpo adquiridas por el polvo ambiental (33).
Todos los aislamientos correspondieron a amebas pertenecientes al género Acanthamoeba, un protozoario que presenta una forma quística altamente resistente a la desecación y a las condiciones climáticas extremas. El clima de Bahía Blanca es templado, subhúmedo, con temperaturas moderadas y alta variabilidad. La ciudad se caracteriza por ser ventosa con flujo predominante de los sectores norte y noroeste y velocidades medias de 24 km/h. Este hecho provoca nubes de polvo en suspensión que cubren el centro urbano (35). Con estas características meteorológicas, Bahía Blanca ofrece condiciones ecoepidemiológicas ideales para la dispersión de Acanthamoeba. Aunque este estudio se realizó en piscinas cubiertas, en todos los establecimientos se observaron ventilaciones que daban directamente al ambiente exterior, y que permanecían abiertas gran parte de la jornada para eliminar los vapores concentrados sobre las piscinas.
Los aislamientos de Acanthamoeba se correspondieron mayoritariamente con el Grupo II (12). Este grupo es el que se encuentra con mayor frecuencia en el ambiente y en las muestras clínicas (13) y dentro del mismo es posible ubicar especies pertenecientes al genotipo T4 (36) que incluye los agentes más comunes responsables de QA y EGA (17). Esto representa un riesgo potencial para los bañistas, principalmente para los usuarios de lentes de contacto o aquellos que presenten una condición inmunodebilitante.
En comparación con otras enfermedades causadas por protozoos, las infecciones ocasionadas por AVL se destacan por su amplia distribución, extrema virulencia, difícil diagnóstico diferencial en los comienzos de la infección y falta de tratamiento efectivo. La importancia epidemiológica de las piscinas como fuente no natural de Acanthamoeba, consiste en el riesgo potencial de actuar como vehículos para su transmisión al hombre. Debido a la presencia de Acanthamoeba spp. en natatorios y considerando que algunas especies pueden ser patógenas para el hombre, se recomienda una limpieza profunda de los mismos, evitando la acumulación de materia orgánica en las paredes, para minimizar los riesgos de infección.
Si bien la eliminación de Acanthamoeba en las aguas recreacionales resulta muy difícil por tratarse de un microorganismo ubicuo y sumamente resistente a los desinfectantes utilizados comúnmente en el tratamiento de las aguas, se considera oportuno informar a las personas en riesgo y a las autoridades sanitarias de la ciudad y zona, de los peligros que representa la exposición a aguas potencialmente contaminadas.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Secretaría de Ciencia y Tecnología de la Universidad Nacional del Sur y a la Fundación Alberto J. Roemmers, por subvencionar el presente estudio. A la Dra. Alejandra Díaz por la realización de los primeros estudios bacteriológicos de las muestras de agua.

CORRESPONDENCIA

SIXTO RAÚL COSTAMAGNA
E-mail: marialaura.gertiser@uns.edu.ar

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Aceptado para su publicación el 22 de junio de 2010