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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.45 no.2 La Plata abr./jun. 2011

 

QUÍMICA ORGÁNICA

Contenido orgánico de extractos parcialmente purificados de pulpa dental humana y bovina

Organic content of human and bovine dental pulp partially purified extracts

Conteúdo orgânico de extratos parcialmente purificado de polpa dentária humana e bovina

 

María Mercedes Salas1a, María Luisa de la Casa2b, María Elena López3a

1 Bioquímica
2 Doctora en Odontología
3 Doctora en Bioquímica

a Cátedra de Química Biológica, Facultad de Odontología, Universidad Nacional de Tucumán. Argentina.
b Cátedra de Endodoncia, Facultad de Odontología, Universidad Nacional de Tucumán. Argentina.

 


Resumen

La pulpa dental contiene tejido conectivo rico en proteínas, mayormente colágeno. El objetivo de este trabajo fue describir un método de purificación de componentes orgánicos pulpares humanos y bovinos, vital y necrótico para validar el modelo experimental bovino. Se prepararon extractos con 50 mg de fracción media de pulpas unirradiculares, 20 humanas o 1 bovina, en 500 μL de Tris-HCl 50 mM pH 7,4, floruro de fenil metil sulfonilo 1mM e hidrocloruro de benzamidina 5 mM frío. Se homogeneizó y centrifugó a 10000 rpm. Los sobrenadantes fueron parcialmente purificados con sulfato de protamina 1%, los sedimentos resuspendidos y dializados 2 horas con recambio en acetato de sodio 500 mM pH 6. Se determinaron proteínas, hidroxiprolina e hidratos de carbono, y se calculó el rendimiento según el contenido de hidroxiprolina. Se aplicó electroforesis en geles de poliacrilamida. Se encontró mayor contenido orgánico en tejido humano que en bovino, y en vital que en necrótico. Por hidroxiprolina/proteínas y rendimiento, el extracto bovino contendría mayor proporción de colágeno. En pulpas humanas se obtuvieron bandas a 78 y 80 kDa, y en bovinas a 74 y 76 kDa. No hubo diferencias entre tejido vital y necrótico. Las evidencias cuali y cuantitativas expresadas validarían al modelo bovino en investigaciones endodónticas.

Palabras clave: Pulpa dental humana; Pulpa dental bovina; Proteínas; Hidroxiprolina; Hidratos de carbono

Summary

The dental pulp contains connective tissue and is rich in proteins, mainly collagen. The aim of this study was to describe a purification method for organic compounds of human and bovine pulp tissues, either vital as necrotic, in order to validate the experimental bovine model. Extracts of 50 mg of the middle fraction of one root pulp teeth, 20 humans or 1 bovine, in 500 μL of cold 50 mM Tris - HCl pH 7.4, 1 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride and 5 mM benzamidine hydrochloride were prepared. Extracts were homogenized and centrifuged at 10000 rpm. Supernatants were partially purified with 1% protamine sulphate, sediments re-suspended and dialyzed during 2 hours with a spare in 500 mM sodium acetate pH 6. Proteins, hydroxiproline and carbohydrates were determined, and the yield of the process was calculated according to the hydroxiproline content. Poliacrylamide gel electrophoresis was applied. A greater organic content was found in human than in bovine tissue, and in vital rather than in the necrotic one. Hydroxyproline/ proteins and yield evidenced that bovine extract would contain a larger proportion of collagen. Bands at 78 and 80 kDa in human pulp and at 74 and 76 kDa in the bovine tissue were observed. There was no difference between vital and necrotic tissues. The qualitative and quantitative evidences expressed in this work would validate the bovine research endodontic model.

Key words: Dental human pulp; Dental bovine pulp; Proteins; Hydroxyproline; Carbohydrates

Resumo

A polpa dentária contém tecido conectivo rico em proteínas, na sua maioria colágeno. O objetivo deste trabalho foi descrever um método de puriIcação de componentes orgânicos da polpa dos humanos e bovinos, vitales e necróticos para validar o modelo experimental bovino. Foram preparados extratos com 50 mg de fração média de polpas unirradiculares, 20 humanas ou 1 bovina em 500 μL de Tris-HCl 50 mM pH 7,4, fenil-metil-sulfonil Juoreto 1 mM e hidrocloreto de benzamidina 5 mM frio. Foi homogeneizado e centrifugado a 10.000 rpm. Os sobrenadantes foram parcialmente puriIcados com sulfatos de protamina 1%, os sedimentos ressuspensos e dialisados 2 horas com recâmbio em acetato de sódio 500 mM pH 6. Foram determinadas proteínas, hidroxiprolina e hidratos de carbono e se calculou o rendimento conforme o conteúdo de hidroxiprolina. Foi aplicada eletroforese em géis de poliacrilamida. Maior conteúdo orgânico foi encontrado em tecido humano que em bovino e em vital que em necrótico. Por hidroxiprolina/proteínas e rendimento, o extrato bovino conteria maior proporção de colágeno. Em polpas humanas foram obtidas faixas a 78 e 80 kDa e em bovinas a 74 e 76 kDa. Não houve diferenças entre tecido vital e necrótico. As evidências qualitativas e quantitativas expressas validariam o modelo bovino em pesquisas endodônticas.

Palavras chave: Polpa dentária humana; Polpa dentária bovina; Proteínas; Hidroxiprolina; Hidratos de carbono


 

Introducción

La preparación del conducto radicular implica la eliminación de restos orgánicos pulpares retenidos después de la instrumentación. Tejidos conectivos de otros orígenes, tales como bovino y porcino, son empleados para estudios endodónticos por la dificultad que representa el escaso tamaño de las pulpas humanas (1-4).
Van Amerogen et al (5) hallaron en pulpa de dientes humanos diferentes proporciones de colágeno medido por el contenido de hidroxiprolina. Encontraron, respecto del total de proteínas, 21% de colágeno en la región coronaria, 30,3% en la media, 27,5% en la apical y mayor contenido de proteínas no colágenas en las zonas coronaria (44,6%), media (43,7%) y apical (46%). También intentaron extraer colágeno con solución salina neutra y con ácido acético 0,5 M, pero obtuvieron bajo rendimiento. Previa digestión parcial con pepsina, encontraron 42,6% de colágeno tipo III del colágeno total en pulpas humanas, aunque advirtieron que la composición de las pulpas dentales de origen animal podría ser diferente. Por otro lado, en observaciones histológicas en pulpa de dientes bovinos de 1 año de edad, otros autores (6) encontraron bajo contenido de colágeno (16,8%) y altas concentraciones de glicoproteínas y mucopolisacáridos ácidos (5,9%) respecto de la materia orgánica. Se aisló mayor proporción de colágeno tipo I y tipo III en pulpa y dentina bovina de dientes embrionarios jóvenes y maduros, encontrándose que el de tipo III es constante en cada estadio en un 45% respecto del total (7). Con la madurez del diente erupcionado, el tipo III aumenta en pulpa y el tipo I en dentina. Otros investigadores (8) encontraron en tejido pulpar bovino joven, mayor proporción de colágeno tipo III respecto del tipo I y evidenciaron su disminución con la madurez del desarrollo tisular. Yamauchi et al (9) encontraron 41% de colágeno tipo III en pulpa bovina, proporción semejante a la hallada en pulpas humanas (5), además de 56% de colágeno tipo I y 2% del tipo V.
Entre las proteínas, el colágeno es la más estudiada en el tejido pulpar por su función, y actualmente se emplea en ingeniería tisular para regeneración endodóntica como proteína inductora de células pulpares en cultivos de células madre (10). También se estudiaron por expresión genética, proteínas defensinas, a fin de diferenciar pulpas dentales sanas e inflamadas (11).
En cuanto al contenido en hidratos de carbono, se estudiaron los glicosaminoglicanos en pulpas bovina y por
cina (6) aunque poco se ha mencionado en pulpa humana (12). En otro estudio en bovinos (13) se evidenciaron, por SDS PAGE, bandas entre 100 y 120 kDa, las que corresponden al colágeno tipo I. Además, por Western Blotting detectaron una banda de aproximadamente 46 kDa correspondiente al versican, glucoproteína que se ubica en la periferia de la pulpa uniendo a los odontoblastos. Otros autores (14) identificaron la fosfosforina, fosfoproteína de 156 kDa, sintetizada por los odontoblastos e involucrada en el proceso de mineralización de la matriz colágena de dentina bovina.
Si bien las pulpas de origen animal se emplean frecuentemente en investigación endodóntica, no existe en la literatura una descripción comparativa sobre los componentes bioquímicos de las mismas y los de la pulpa humana. Así, el objetivo de este trabajo fue describir un método de purificación de los componentes orgánicos pulpares y comparar entre aquéllos de origen humano y bovino, tanto vital como necrótico, a fin de contribuir con la validación del tejido bovino como modelo experimental.

Materiales y Métodos

TOMA DE MUESTRA

Se trabajó con la fracción media de 120 pulpas humanas (60 vitales y 60 necróticas) y 6 pulpas bovinas (3 vitales y 3 necrosadas). Las primeras procedían de dientes unirradiculares de pacientes de 17 a 33 años con indicación de tratamiento endodóntico que concurrieron al Servicio Odontológico de la Cátedra de Endodoncia de la Facultad de Odontología de la UNT, previo consentimiento informado de cada paciente. Las 60 pulpas humanas vitales fueron extraídas por diagnóstico de inflamación pulpar, y las 60 pulpas necróticas se obtuvieron a causa de necrosis pulpar. Las pulpas vitales bovinas se aislaron de dientes sin desgaste de la mandíbula inferior de animales de 2 a 4 años recién sacrificados, de las cuales se necrosaron 3 y las restantes fueron tratadas como pulpas vitales. Para obtener el tejido necrosado bovino se adaptó el método propuesto por Gordon et al. (1); se colocaron fracciones medias de pulpas en recipientes cubiertos a 25 °C durante 72 h. En la pulpectomía de dientes humanos se empleó tiranervios; en dientes bovinos se usó pinza de algodón previa extracción de la corona y seccionamiento longitudinal de la raíz en dirección vestíbulo- lingual. Ambos procedimientos fueron realizados por un mismo odontólogo.
Se usó la fracción media de las pulpas a fin de evitar variación en el contenido orgánico de porciones diferentes (5). Se prepararon extractos de aproximadamente 50 mg con 40 pulpas humanas (20 vitales y 20 necróticas) obtenidas in vivo de pacientes en tratamiento y 2 pulpas bovinas (1 vital y 1 necrótica) obtenidas ex vivo de animales.
Los tejidos obtenidos fueron colocados a 0 ºC y luego conservados a -15 ºC hasta la preparación de los extractos.

PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS CRUDOS

En cada extracto se empleó la fracción media (5) (aproximadamente 1/3) de 20 pulpas humanas o (aproximadamente 1/5) de 1 pulpa bovina hasta alcanzar 50 mg. Las pulpas fueron colocadas en 500 μL de buffer de extracción, compuesto por Tris-HCl 50 mM pH 7,4 (7) en presencia de floruro de fenil metil sulfonilo 1mM e hidrocloruro de benzamidina 5 mM como inhibidores de proteasas. Se maceraron los tejidos con homogeneizador de teflón a 0 ºC durante 15 min. Posteriormente, se los centrifugó 15 min a 4 ºC y a 10000 rpm. Se recogieron los sobrenadantes o extractos crudos (I), de volumen aproximado 300 μL, que fueron parcialmente purificados por precipitación con sulfato de protamina 1% a 0 ºC durante 10 min. Los sedimentos fueron resuspendidos, dializados en buffer acetato de sodio 500 mM pH 6 durante 2 horas con agitación suave y recambio del buffer cada 30 min (II), y posteriormente ultrafiltrados a través de membranas Millipore de 0,22 μm. Se obtuvieron fracciones ultrafiltradas (III) y las retenidas en el filtro que fueron resuspendidas en el mismo volumen III con buffer acetato de sodio 500 mM pH 6 (IV). La preparación de los extractos se repitió por triplicado.
Se confeccionaron tablas de purificación en base al contenido de hidroxiprolina y de proteínas totales. Se presenta por primera vez en la literatura la relación de colágeno (a través del contenido en hidroxiprolina) (3) respecto del total de proteínas y su rendimiento y grado de purificación. Las tablas incluyen el cálculo referido al volumen total de cada etapa.

DETERMINACIONES QUÍMICAS

Se adaptaron técnicas colorimétricas para ser utilizadas como micrométodos. Se determinaron proteínas totales según el método de Lowry et al. (15) (20 μL de muestra y 180 μL de agua destilada en 400 μl de hidróxido de sodio 0,5 N reaccionan con 2 mL de reactivo formador del complejo coloreado que contiene carbonato de sodio 2%, sulfato cúprico pentahidratado 1% y tartrato de sodio 2,7% en proporciones 100/1/1; se incuba 10 min a temperatura ambiente y se agregan 200 μL de reactivo de Folin diluido 1/1 para leer la absorbancia a 750 nm entre 30 y 60 min); hidroxiprolina con la técnica de Jamall et al. (16) (20 μL de muestra se humedecen con 580 μL de propanol 50% durante 30 min, se agregan 100 μL de cloramina T y 500 μL de reactivo de Erlich recién preparado; se incuba 1,5 horas a 50 ºC, y se lee la absorbancia a 550 nm) y se determinan hidratos de carbono totales por el método del Fenol sulfúrico (17) (20 μL de muestra en 780 μL de agua destilada, 40 μL de fenol y 2 mL de ácido sulfúrico concentrado agregado a presión; se incuban a 100 ºC durante 30 min, se enfría y se lee la absorbancia a 490 nm).
Se realizaron electroforesis (Mini Protean II) en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS PAGE) 12%. Para ello se aplicó el método de Laemmli (18) empleando buffer Tris-Glicina pH 8,3 y aplicando 30 mA/gel durante aproximadamente 50 min. Para el revelado de las bandas proteicas se empleó Coomassie Brilliant Blue R-250 0,1%. Se sembraron además estándares proteicos (BIO-RAD) que incluyeron miosina (200,0 kDa), ß- galactosidasa (116,2 kDa), fosforilasa b (97,4 kDa), sero albúmina (66,2 kDa), ovo albúmina (45,0 kDa), anhidrasa carbónica (31,0 kDa), inhibidor de tripsina (21,5 kDa), lisozima (14,4 kDa) y aprotinina (6,5 kDa).

Resultados

La Figura 1 muestra la diferencia de tamaños de dientes (a) y pulpas (b) humanos y bovinos, vitales y de reciente extracción. El peso de las pulpas humanas osciló entre 2 y 6 mg, mientras que las pulpas de dientes bovinos pesaron entre 150 y 250 mg. En la Tabla I se registran los promedios y error estándar de los valores obtenidos de proteínas totales, hidroxiprolina e hidratos de carbono totales en los extractos crudos (I). La pulpa humana al estado vital mostró mayor concentración de los tres componentes orgánicos determinados, respecto del bovino. También las pulpas humanas vitales presentaron mayor contenido de proteínas, hidroxiprolina y azúcares totales que las necróticas, mientras que en los extractos bovinos se observaron diferencias en contenido entre pulpas vitales y necróticas sólo para hidroxiprolina.


Figura 1. a) Dientes humano (izquierda) y bovino (derecha), b) Pulpas de dientes humano (izquierda) y bovino (derecha)

Tabla I. Valores promedio y error estándar de los parámetros químico-orgánicos evaluados en extractos crudos de pulpa dental humana y bovina, vital y necrótica

La cuantificación del proceso de purificación de los componentes de tejido pulpar se resume en las Tablas II (humano) y III (bovino) para cada extracto de mejor rendimiento. Se partió de cantidades más altas de proteínas e hidroxiprolina en los extractos humanos respecto de los bovinos. Las etapas de precipitación (II) y posterior ultrafiltrado (III) favorecieron la eliminación de proteínas no abundantes en hidroxiprolina y el rendimiento del proceso respecto del retenido y resuspendido (IV). La relación hidroxiprolina/proteínas totales fue mayor en pulpas vitales respecto de necróticas para los extractos del ultrafiltrado (III) tanto humano como bovino.

Tabla II. Valores promedio de los parámetros químico-orgánicos analizados durante el proceso de purificación parcial de proteína rica en hidroxiprolina de extractos de pulpa humana. a) Vital, b) Necrótica

Tabla III. Valores promedio de los parámetros químico-orgánicos analizados durante el proceso de purificación parcial de proteína rica en hidroxiprolina de extractos de pulpa bovina. a) Vital, b) Necrótica

En la Figura 2 se presentan los resultados por SDS PAGE de las etapas del proceso de purificación. Se evidencia, en general, mayor presencia de proteínas en el ultrafiltrado (III) que en el retenido y resuspendido (IV), confirmando el mejor rendimiento de esa etapa en la purificación de proteínas. Además, los extractos humanos presentan mayor número de bandas de proteínas que aquéllos bovinos, así como los extractos vitales respecto de los necróticos para ambos tipos de tejidos, confirmando los resultados anteriores.


I, II, III, IV: Etapas del proceso de purificación parcial. PM: Marcadores de peso molecular; PBV: pulpa bovina vital; PHV: pulpa humana vital; PHN: pulpa humana necrótica; PBN: pulpa bovina necrótica
Figura 2. SDS PAGE de las etapas de purificación de proteínas de pulpas de dientes humanos y bovinos, vitales y necróticos

Comparando particularmente los extractos crudos de pulpas humanas y bovinas por SDS PAGE (Figura 3) se evidenció la presencia de bandas coincidentes a 6 kDa, 25 kDa, 31 kDa, 40 kDa, 66 kDa, 93 kDa, 95 kDa, 180 kDa, 200 kDa y >200 kDa. Sin embargo, se observó una zona con diferentes bandas de proteínas para extractos humanos y bovinos entre 70 kDa y 80 kDa. Esto es, en pulpas humanas se obtuvieron bandas aproximadamente a 78 kDa y 80 kDa, y en bovinas a 74 kDa y 76 kDa. No se detectaron diferencias entre los tejidos vital y necrótico.


PM: Marcadores de peso molecular; PBV: pulpa bovina vital; PHV: pulpa humana vital; PBN: pulpa bovina necrótica; PHN: pulpa humana necrótica
Figura 3. SDS PAGE de extractos crudos de proteínas de pulpas de dientes humanos y bovinos, vitales y necróticos

Discusión y Conclusiones

La pulpa dental humana está constituida por tejido conectivo especializado. El principal componente proteico de la pulpa y la dentina madura es el colágeno, glicoproteína rica en hidroxiprolina y en menor proporción, en hidroxilisina e hidratos de carbono. El tamaño de la pulpa y en consecuencia, el volumen de la cámara pulpar disminuyen con la edad del diente debido a la disminución del contenido proteico y al desarrollo de la dentina.
En este trabajo se presenta un estudio comparativo del contenido orgánico de pulpas de dientes jóvenes de origen humano y bovino. Si bien la pulpa humana tiene menor tamaño, expresando su contenido en mg/mg de tejido, al estado vital presenta mayor concentración de los tres componentes orgánicos determinados respecto del bovino. Dado que las pulpas bovinas presentan dimensiones mucho mayores que las pulpas humanas,
frecuentemente son empleadas en investigaciones odontológicas (19-21) sin que exista una clara validación cuali-cuantitativa del modelo animal. Además, muchas investigaciones in vitro en tejido pulpar bovino pueden ser difícilmente extrapoladas a la situación clínica donde sucederían procesos de necrosis tisular.
En este trabajo se puso a punto un micrométodo de extracción de componentes orgánicos de los tejidos vitales y necróticos de ambos orígenes. La pulpa humana resultó ser más concentrada en proteínas totales, hidroxiprolina e hidratos de carbono totales que la pulpa bovina. El método utilizado para determinar la concentración de proteínas totales (15) detecta proteínas hidrosolubles y no colágeno maduro. Por ello se emplearon pulpas de dientes jóvenes que contienen mayor proporción de colágeno inmaduro, el cual es mayormente soluble (5). Al completar su desarrollo, aumenta el número de enlaces cruzados en el procolágeno y el colágeno maduro forma gradualmente el tejido fibroso insoluble.
También la relación de colágeno respecto de otras proteínas fue mayor en pulpas vitales que en neuróticas, para los tejidos de ambos orígenes. Este mayor contenido orgánico demostraría que la integridad estructural de las proteínas tisulares habría sido afectada por el proceso de necrosis. Esta diferencia fue mayor en pulpas humanas que en bovinas, posiblemente debido a que en las primeras el proceso de necrosis parcial fue natural y en las pulpas bovinas se indujo la necrosis. Las diferencias bioquímicas y biofísicas entre la necrosis natural e inducida podría haber afectado la comparación entre los tejidos humano y bovino.
Dado que la relación hidroxiprolina/proteínas totales y el grado de purificación respecto de otras proteínas acompañantes son más altos en los extractos bovinos que en los humanos, el colágeno habría sido mejor separado de los otros componentes proteicos. Ello indicaría que en la composición de la pulpa bovina habría mayor proporción de colágeno respecto de otras proteínas que en la pulpa humana, aunque este cociente en tejido bovino resultó de valores numéricos pequeños.
La pulpa humana podría contener mayor variación de proteínas, además de colágeno, que el tejido bovino. Las diferencias observadas podrían deberse a diferencias en la madurez del colágeno de los dientes de edad equivalente empleados. Un estudio previo comparó el contenido de hidroxiprolina en diferentes tipos de colágeno de pulpa bovina y mostró mayor proporción del aminoácido (41,4%) en el colágeno tipo III respecto de los tipos I y V (7).
El mayor contenido de azúcares totales en la pulpa humana respecto de la bovina indicaría una actividad metabólica más intensa en la pulpa humana. Los hidratos de carbono de la matriz extracelular tienen a su cargo el mantenimiento de la función del tejido, la formación y organización del colágeno y la proliferación celular (12). Se ha informado en la literatura un 16,7% de azúcares totales respecto del total de materia orgánica en la pulpa dental humana (22) y un 5,93% en la pulpa dental bovina (6) mediante un método de determinación (23)diferente. La necrosis en el tejido humano habría alterado también el contenido en hidratos de carbono.
En este trabajo se puso a punto un método de purificación parcial de la proteína rica en hidroxiprolina no descripto hasta ahora, siendo el proceso de mejor rendimiento (entre 30% y 60%) aquél que consistió en tratar al tejido pulpar con el buffer de extracción, precipitarlo con sulfato de protamina y ultrafiltrarlo por membrana de 0,22 μm (III). Por SDS PAGE se mostró un perfil proteico similar entre pulpas humanas y bovinas, el cual incluiría a las proteínas no colágenas y a diferentes fracciones hidrolizadas del colágeno soluble. También se evidenció la desnaturalización de proteínas en el tejido necrótico respecto del vital. Bandas reveladas entre 70 kDa y 80 kDa podrían diferenciar los tejidos según su origen. Esta evidencia cualitativa y aquéllas cuantitativas expresadas en este estudio podrían ser de utilidad a fin de validar al modelo bovino en investigaciones relacionadas a la Endodoncia. Estudios posteriores por Western Blotting con anticuerpos monoclonales permitirían identificar las proteínas durante el proceso de purificación parcial, caracterizar el tipo de colágeno presente y determinar el grado de afección en diferentes estadios de la necrosis.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio fue parcialmente subsidiado por CIUNT (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas de la Universidad Nacional de Tucumán) y FOUNT (Facultad de Odontología de la Universidad Nacional de Tucumán).

CORRESPONDENCIA

DRA. MARÍA ELENA LÓPEZ
Cátedra Química Biológica - Facultad de Odontología - UNT.
Avenida Benjamín Aráoz 800
(4000) SAN MIGUEL DE TUCUMÁN-Argentina
Fax Nº: 54-381-4227589
Phone Nº: 54-381-4107317
E-mail: mariae.lopez@odontologia.unt.edu.ar

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Aceptado para su publicación el 11 de marzo de 2011