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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.46 no.1 La Plata ene./mar. 2012

 

HEMORREOLOGÍA

Técnica de cuantificación de la agregación eritrocitaria por análisis digital de imágenes

Erythrocyte aggregation quantification technique using digital image analysis

Técnica de quantificagáo do agregado eritrocitário por análise digital de imagens

 

Alicia Beatriz Fontana1a, Natalia Lerda2b, Marcela María Delannoy3ab, Adriana Cecilia Alessi1a, Bibiana Doris Riquelme4ab

1 Bioquímica
2 Tesinista Lic. en Biotecnología
3 Lic. en Física
4 Dra. en Física

a Dpto. Química-Física, FCByF (UNR). Suipacha 531, CP: 2000, Rosario, ARGENTINA.
b Óptica Aplicada a la Biología, IFIR (CONICET-UNR). Bv. 27 de febrero 210 bis, CP: 2000, Rosario, ARGENTINA.

 


Resumen

La caracterización de agregados eritrocitarios es importante para analizar las posibles alteraciones en la microcirculación observadas en ciertas patologías vasculares como la hipertensión y la diabetes. El objetivo de este trabajo fue estandarizar una técnica que pueda ser utilizada por cualquier operador con un equipamiento similar. Para ello se prepararon distintas suspensiones de glóbulos rojos de dadores sanos en plasma autólogo, que fueron observadas con un microscopio óptico invertido. Se registraron para su análisis las imágenes de los agregados con una cámara digital. Se realizaron los recuentos de células individuales, agregados de 2 a 4 células, agregados de 5 ó más células y amas (redes de agregados de gran tamaño). Se midió el perímetro y el área, obteniéndose un parámetro de forma (ASP) de cada agregado de 5 ó más células. Los resultados obtenidos permitieron estandarizar el protocolo de trabajo concluyendo que la dilución óptima de glóbulos rojos en plasma autólogo para esta técnica es 0,5%.

Palabras clave: Agregación eritrocitaria; Patologías vasculares; Imágenes digitales

Summary

Characterization of erythrocyte aggregates is important in the analysis of the possible alterations observed in the microcirculation of certain vascular pathologies such as hypertension and diabetes. The objective of this work was to standardize a technique that can be used by any operator having similar equipment. For that purpose, different suspensions of red blood cells from healthy donors were prepared in autologous plasma and then observed with an inverted light microscope. The images of the aggregates were recorded with a digital camera in order to be later analyzed. Individual cell count was carried out, as well as 2 to 4 cell- aggregates, 5 or more cell- aggregate and amas (big aggregate networks). Measurement of perimeter and area of each of the aggregates made up of 5 or more cells was performed, getting a shape parameter (ASP). Due to the results obtained, this working protocol has been standardized and it can be concluded that the optimal dilution of red blood cells in autologous plasma is 0.5% for this particular technique.

Keywords: Erythrocyte aggregation; Vascular pathologies; Digital images

Resumo

A caracterizagáo de agregados eritrocitários é importante para analisar as possíveis alteragóes na microcirculagáo observadas em certas patologias vasculares como a hipertensáo e a diabetes. O objetivo deste trabalho foi padronizar uma técnica que possa ser utilizada por qualquer operador com um equipamento similar. Para isso foram preparadas diversas suspensóes de glóbulos vermelhos de doadores saudáveis em plasma autólogo, que foram observadas com um microscópio óptico invertido. Foram registradas para a sua análise as imagens dos agregados com uma camera digital. Realizaramse as recontagens de células individuais, agregados de 2 a 4 células, agregados de 5 ou mais células e amas (redes de agregados de grande tamanho). Foi medido o perímetro e a área, obtendo um parametro de forma (ASP) de cada agregado de 5 ou mais células. Os resultados obtidos permitiram padronizar o protocolo de trabalho concluindo que a diluigáo ótima de glóbulos vermelhos em plasma autólogo para esta técnica é de 0,5%.

Palavras chave: Agregado eritrocitário; Patologias vasculares; Imagens digitais


 

Introducción

La agregación eritrocitaria, el factor más importante en la determinación de la viscosidad sanguínea a bajas velocidades de flujo, refleja un delicado balance entre las fuerzas de adhesión celular (debidas a la adsorción de macromoléculas y a la cCAICYTión de puentes entre los eritrocitos) y el efecto de las fuerzas de desagregación (fuerzas de cizallamiento mecánico, repulsión electrostática entre las células, etc.) Esta interacción célula-célula es considerada de crucial importancia en la microcirculación ya que influye en la viscosidad sanguínea (1)(2).

In vivo e in vitro, los eritrocitos se agregan naturalmente en presencia de macromoléculas plasmáticas que actúan como puentes intercelulares, formando agregados lineales como "pilas de monedas" conocidos como rouleaux. Cuando estos rouleaux se unen lateralmente forman redes filamentosas conocidas como amas.

En los últimos años se han propuesto diversas técnicas para el estudio de la agregación eritrocitaria, siendo las más accesibles aquellas que analizan la morfología de los agregados mediante el análisis digital de imágenes (3)(4). Sin embargo, la determinación de los parámetros de agregación eritrocitaria puede estar influenciada por las condiciones propias de la determinación, en particular si las condiciones de flujo son no estacionarias, ya que afectan la dinámica de la agregación (5). Por tal motivo, es importante tener en cuenta todos los parámetros al momento de estudiar el fenómeno de agregación y estandardizar las determinaciones para que sean comparables. En la bibliografía se observa que los resultados de las mediciones de los distintos parámetros dependen del criterio establecido por cada operador, es por esto que se ha desarrollado el presente trabajo para estandardizar la técnica a fin de uniformar los criterios a utilizar en estas determinaciones.

La caracterización de los agregados eritrocitarios es importante para analizar las posibles alteraciones en la microcirculación observadas en ciertas patologías vasculares como la hipertensión y la diabetes (6) y en las producidas in vitro por la acción de diversos agentes (7). Además, trabajos recientes han demostrado su importancia para la comprensión de los disturbios vasculares producidos en pacientes obesos (8) y luego de la remoción de torniquetes (9).

En las enfermedades vasculares (diabetes, hipertensión), la forma de los rouleaux está alterada, produciéndose grandes agregados globulares que pueden conducir a obstrucciones en la microcirculación sanguínea. Esta obstrucción disminuye a su vez las fuerzas desagregantes, resultando en un aumento en el tamaño de los agregados eritrocitarios, lo que se traduce en una mayor dificultad para dicho flujo, provocando una situación de retroalimentación que lleva a un aumento de la viscosidad sanguínea (10). En consecuencia, es de gran interés poder disponer de métodos accesibles que permitan cuantificar la morfología de los agregados eritrocitarios, para evaluar con más detalle la gravedad de las alteraciones hemorreológicas en estas patologías.

Por ejemplo, en la hipertensión arterial se supone la existencia de distintas vías y mecanismos que modifican los parámetros hemorreológicos e influyen en la resistencia periférica. Además del diámetro de los vasos, la deformabilidad y la agregación eritrocitaria juegan un papel preponderante a través de la viscosidad sanguínea. Por lo tanto, la determinación del parámetro de forma de los agregados (ASP) al igual que el análisis de la distribución de tamaño de los mismos, brindan información importante sobre las características de la agregación eritrocitaria en una muestra dada.

Esta técnica se ha difundido rápidamente en los laboratorios por su accesibilidad y bajo costo, existiendo en la actualidad la necesidad de estandarizarla para que pueda ser utilizada masivamente en Bioquímica Clínica.

Materiales y Métodos

Se utilizaron muestras de sangre provenientes de cinco (5) dadores sanos, entre 20 y 30 años, sin medicación alguna, con hemograma normal. Las muestras se recolectaron en recipientes estériles que contenían EDTA/Na2 como anticoagulante. Luego, se centrifugaron a 2.000 rpm durante 5 min a 25 °C, y se separó el plasma del paquete globular, descartándose la capa leucoplaquetaria. Se prepararon suspensiones con 0,25; 0,50; 1,00; 1,50 y 2.00 yxL de glóbulos rojos (GR) en 100 yxL de plasma autólogo. Cada suspensión se homogeneizó por inversión lenta y se colocaron 30 yxL en un portaobjeto excavado, el cual se ubicó sobre la platina de un microscopio óptico invertido (Union Optical, Japón) acoplado a una cámara digital (Canon Power Shot A640, China). Las muestras se dejaron en reposo durante 5 min para permitir la formación y sedimentación de los agregados, luego se observaron con un objetivo de 40x, adaptador de 52 mm y zoom 7.1 de la cámara. Se registraron seis imágenes para cada una de las distintas diluciones de cada muestra, estudiándose 150 imágenes en total.

DETERMINACIÓN DEL ASP

El parámetro de forma de cada agregado (ASP) (8) fue calculado a partir de la medición del perímetro P y del área A con el programa Image J, utilizando la siguiente fórmula:

ASP = 4p A / P2 (1)

Este parámetro es un índice de circularidad, es decir que los agregados globulares presentan un ASP cercano a 1, mientras que los agregados con forma rectangular (rouleaux) tienen un ASP<1. En la Figura 1 se representan esquemáticamente los correspondientes valores de ASP cuando los agregados están en forma de pequeños rouleaux (0,64) o son globulares (0,80).


Figura 1. Representación esquemática de diferentes formas de agregados y los correspondientes valores de ASP

Las mediciones se realizaron en cada agregado de 5 ó más células y los resultados finales se expresaron como valor medio ± desvío estándar de los valores de ASP obtenidos en las 6 imágenes de las distintas diluciones de cada muestra.

ANÁLISIS DE LA DISTRIBUCIÓN DE TAMAÑO

Las imágenes se visualizaron en la pantalla de la PC y se realizó un recuento de los agregados, los que fueron clasificados de acuerdo con las siguientes cuatro categorías:

* células individuales;

* agregados de 2, 3 ó 4 células;

* agregados de 5 o más células

* presencia de amas (redes de agregados de gran tamaño).

En la Figura 2 se observa el efecto que la concentración de glóbulos rojos en plasma autólogo produce en el tamaño de los agregados. A modo de ejemplo, se muestran las imágenes correspondientes a las 5 concentraciones de una misma muestra de eritrocitos, donde se puede observar en las imágenes (a), (b) y (c) la presencia de células individuales y rouleaux bien definidos; en la imagen (d) la presencia de rouleaux y algunos amas y en la imagen (f) sólo amas.


Figura 2. Efecto de la concentración de glóbulos rojos en plasma autólogo en el tamaño de los agregados. Imágenes correspondientes a 5 concentraciones de una misma muestra obtenidas en un microscopio óptico invertido con un objetivo de 40x, y una cámara digital (Canon Power Shot A640) con zoom 7,1x y adaptador de 52 mm.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Dentro de cada muestra se aplicó un análisis de la varianza unifactorial, previa verificación de los supuestos exigidos por la técnica y el test de comparaciones múltiples de Scheffé.

Resultados

Se calculó el porcentaje correspondiente en las distintas categorías para cada suspensión eritrocitaria y, finalmente, estos porcentajes fueron promediados para todas las muestras sanguíneas estudiadas. Los resultados se muestran en la Tabla I. En cada muestra se analizaron seis imágenes para cada concentración, de las cuales se obtuvieron los valores promedios para cada categoría de distribución del tamaño de los agregados. Los resultados son presentados como media ± desvío estándar de las 150 imágenes estudiadas.

Tabla I. Distribución del porcentaje del tamaño de los agregados eritrocitarios y del ASP, valores promedio ± desvío estándar para cada categoría en función de la concentración de glóbulos rojos en plasma autólogo.

En la Figura 3 se presentan los resultados del análisis estadístico de la distribución de tamaño de agregados en función del porcentaje de glóbulos rojos en cada suspensión, promediado sobre la totalidad de las muestras (valores presentados como media ± desvío estándar). En cada muestra se analizaron seis imágenes para cada concentración de las cuales se obtuvieron los valores promedios para cada categoría de distribución del tamaño de los agregados.


Figura 3. Distribución de los porcentajes del tamaño de agregados en función del porcentaje de glóbulos rojos en cada suspensión

Discusión

Se encontraron diferencias significativas en los valores promedios del número de células individuales (p = 0,02), de agregados de 2 a 4 células (p < 0,02) y de agregados de 5 o más células (p < 0,0001) para las distintas concentraciones de GR en las muestras analizadas. Los valores promedios del número de agregados de 5 o más células para muestras con el 1,5% y 2% de GR fueron significativamente mayores que los correspondientes a las muestras de menor dilución ( p < 0,05).

En las diluciones mayores se observaron abundantes cantidades de amas y relativamente pocas células individuales. A bajas concentraciones no se encontraron amas, observándose agregados con forma de rouleaux y abundantes células individuales. A la concentración de 0,5% se encontraron células aisladas, formas bien definidas de rouleaux, pero no se observaron redes de agregados de gran tamaño ( amas) que dificulten la medición.

Se observa en la Tabla II que, en general, los valores de los coeficientes de variación (desvío estándar/ media aritmética: es decir qué porcentaje de la media aritmética representa el desvío estándar) entre las repeticiones de una misma muestra es del mismo orden que el de la totalidad de las mismas. Además, fue la dilución del 0,5% la que presentó un coeficiente de variación menor por lo cual es elegida como óptima para esta técnica.

Tabla II. Valores del coeficiente de variación correspondientes a cada una de las muestras y a la totalidad de las mismas.

En la Figura 4 se representan los valores de ASP versus las concentraciones de GR. No se observan diferencias significativas en los valores de ASP en las concentraciones analizadas, estableciendo que el valor medio es de (0,67 ± 0,02).


Figura 4. Gráfico de los valores medios del ASP en función del porcentaje de glóbulos rojos en las diluciones analizadas.

Conclusiones

Los valores promedios del número de células individuales, de los agregados de 2 a 4 células y de los agregados de 5 o más células se ven afectados por las distintas concentraciones de glóbulos rojos en plasma autólogo ensayadas en este trabajo.

De acuerdo con los resultados obtenidos se estandardiza el protocolo de trabajo concluyendo que la concentración óptima para esta técnica es la de 0,5% de GR en plasma autólogo, dado que en las imágenes obtenidas se observan y distinguen claramente las células aisladas, los grupos de 2 ,3 ó 4 células y los grupos de 5 o más células y los parámetros presentan un menor coeficiente de variación.

Con este trabajo se logró estandarizar el protocolo de preparación de muestras para la toma de imágenes microscópicas, permitiendo aplicarlo a estudios de agregación eritrocitaria para analizar las posibles alteraciones, ya sea en muestras provenientes de pacientes con diversas patologías como en muestras alteradas in vitro por diferentes agentes.

La técnica es altamente accesible por lo cual puede ser adaptada como técnica de rutina en los laboratorios de Hemorreología y de Bioquímica Clínica.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean expresar su agradecimiento a la Lic. Liliana Racca y a la Dra. Mabel D'Arrigo por su colaboración en el desarrollo de este trabajo.

CORRESPONDENCIA

BIOQ. ALICIA B. FONTANA

Área Física - Facultad Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas Suipacha 535
2000 - ROSARIO - Argentina E-mail: alicia_fontana@yahoo.com.ar riquelme@ifir-conicet.gov.ar

Referencias bibliográficas

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Aceptado para su publicación el 27 de septiembre de 2011