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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.46 no.3 La Plata jul./set. 2012

 

BIOQUÍMICA CLÍNICA

Eficacia del cordón umbilical humano como sustrato para detección de anticuerpos anti endomisio*

Efficiency of human umbilical cord as substrate or detection of antiemdomysium antibodies

Aeficácia do cordão umbilical humano como substrato para a detenção de anticorpos anti-endomísio

 

Natalia Andrea Peano1, César Juan Gerardo Collino2, Luis Gabriel Mercado1, Lorena Vettorazzi3

1 Bioquímico.
2 Bioquímico Especialista en Hematología.
3 Bioquímico Especialista en Inmunología.
* Laboratorio de Inmunología, Hospital Privado Centro Médico de Córdoba. Naciones Unidas 346. Córdoba (CP 5000), Argentina.

CORRESPONDENCIA BIOQ. NATALIA ANDREA PEANO Achával Rodríguez 892 - Dpto. 1 Bº Observatorio 5000 CÓRDOBA - Argentina Tel. 0351-152305808 nataliapeano@hotmail.com


Resumen

Los anticuerpos anti endomisio IgA (EMA) están dirigidos hacia antígenos del tejido conectivo que rodea a las fibras del músculo liso. El objetivo de este trabajo fue evaluar la eficacia del cordón umbilical humano (CUH) como sustrato para detectar EMA mediante inmunofluorescencia indirecta y compararlo con una de las metodologías disponibles comercialmente, la cual utiliza como sustrato esófago de mono. Se obtuvieron 100 sueros de pacientes con diagnóstico de enfermedad celíaca y 50 sueros de pacientes clínicamente sanos con biopsia de mucosa intestinal normal, los cuales realizaron su consulta y atención en el Hospital Privado Centro Médico de Córdoba, en un periodo de tiempo comprendido entre los años 2006 y 2009. Los resultados obtenidos mostraron una "muy buena" concordancia entre ambos métodos. Se estimó para el método que utiliza CUH una sensibilidad y especificidad de 98% (93-99%) y 100% (93-100%) respectivamente con una eficacia del 99%. De acuerdo con lo anterior se concluye que utilizar CUH como sustrato para evaluar la presencia de EMA es confiable y efectivo para detectar pacientes con enfermedad celíaca no tratada.

Palabras clave: Anticuerpos anti endomisio; Esófago de mono; Cordón umbilical; Serología; Enfermedad celíaca.

Summary

The antiendomysium antibodies (EMA) are directed toward antigens of connective tissue that surrounds the smooth muscle fibers. The aim of this study was to evaluate the efficiency of human umbilical cord (HUC) as substrate to detect EMA by indirect immunofluorescence and to compare it with one of the commercially available methodologies which use monkey esophagus as substrate. Serum samples obtained from 100 patients with celiac disease diagnosis and 50 healthy controls with normal intestinal mucosa were evaluated. Patients were treated at the Hospital Privado Centro Médico de Córdoba over a period of time between 2006 and 2009. The results showed an "almost perfect" concordance between both methods. The calculated sensitivity and specificity for HUC was 98% (93-99%) and 100% (93-100%) respectively, with an efficiency of 99%. This results indicate that the use of HUC as substrate to evaluate the presence of EMA is reliable and effective for the detection of patients with untreated celiac disease.

Keywords: Antiendomysium antibodies; Monkey esophagus; Human umbilical cord; Serology; Celiac disease.

Resumo

Os anticorpos anti-endomísio IgA (EMA) são direcionados contra os antígenos do tecido conectivo que cercam as fibras do músculo liso. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia do cordão umbilical humano (CUH) como substrato para detectar EMA através da imunofluorescência indireta e compará-lo com uma das metodologias disponíveis comercialmente, a qual utiliza como substrato esôfago de macaco. Foram obtidos 100 soros de pacientes com diagnóstico de doença celíaca e 50 soros de pacientes clinicamente saudáveis com biópsia de mucosa intestinal normal, os quais realizaram sua consulta e atendimento no Hospital Privado Centro Médico de Córdoba, em um período de tempo compreendido entre os anos 2006 e 2009. Os resultados obtidos mostraram uma "ótima" concordância entre ambos os métodos. Foi calculada para o método que utiliza CUH uma sensibilidade e especificidade de 98% (93-99%) e 100% (93-100%) respectivamente com uma eficácia de 99%. De acordo com o acima exposto, se conclui que utilizar CUH como substrato para avaliar a presença de EMA é confiável e eficaz para detectar pacientes com doenças celíacas não tratadas.

Palavras-chaves: Anticorpos anti-endomísio; Esôfago de macaco; Cordão umbilical; Sorologia; Doença celíaca.


 

Introducción

La Enfermedad Celíaca (EC) es una patología inflamatoria del intestino delgado, donde el proceso inflamatorio es inducido y sostenido por el consumo de gluten contenido en trigo, avena, cebada y centeno. Esta enfermedad se desarrolla en individuos predispuestos genéticamente (1-3), en los cuales es necesaria la presencia de alelos que codifiquen las proteínas HLA-DQ2 o HLA-DQ8, productos de dos genes HLA (4). Estudios de prevalencia han demostrado que la EC afecta aproximadamente al 1% de la población mundial, y la mayoría de los casos se mantienen sin diagnóstico hasta la edad adulta. Interesantemente y por mecanismos aún sin dilucidar, diferentes estudios poblacionales demostraron que la prevalencia de EC en los individuos de sexo femenino es entre dos y tres veces superior respecto a los individuos de sexo masculino (2)(5-6). La lesión patológica se caracteriza por una mucosa intestinal aplanada con infiltrado linfocitario en lámina propia, hiperplasia de las criptas y atrofia vellositaria; mientras que la presentación clínica puede variar desde la forma típica de síndrome de malabsorción (diarrea, flatulencia, pérdida de peso, fatiga, vómitos y distensión abdominal) hasta síntomas extraintestinales variados (anemia, infertilidad, osteoporosis, depresión, manifestaciones en piel y enfermedades neurológicas) (7)(8). De acuerdo al último consenso reportado por la Federación de Sociedades Internacionales de Pediatría, Gastroenterología, Hepatología y Nutrición, la evaluación de EC requiere la realización de una biopsia de intestino delgado, siendo esta técnica el método de referencia para confirmación diagnóstica (9). Sin embargo, las lesiones patológicas deben ser evaluadas en el contexto de otros componentes relevantes, incluyendo signos clínicos, marcadores serológicos y haplotipos HLA (2). Debido al gran espectro clínico de expresión de este desorden no existe una única prueba que pueda diagnosticar o excluir definitivamente la enfermedad.
En la práctica diaria de laboratorio, la prueba anti Endomisio IgA (EMA) se realiza frecuentemente en conjunto con la prueba para anti Transglutaminasa IgA (aTgA) debido a que son marcadores cuya combinación otorga casi 100% de sensibilidad y especificidad (10-12). El alto costo de la inmunofluorescencia para EMA realizada sobre esófago de mono (EM) complica su uso como método de rutina. En estudios anteriores se encontraron resultados satisfactorios y disminución de costos utilizando como sustrato cortes de cordón umbilical humano (CUH) (10)(13-15).
El objetivo principal de este estudio fue evaluar sensibilidad y especificidad diagnóstica de la prueba para detectar EMA sobre improntas no comerciales de CUH. Además, se planteó como un segundo objetivo la comparación de esta metodología con la prueba comercial que utiliza improntas con EM como sustrato en muestras de suero de pacientes celíacos y no celíacos, diagnosticados según los actuales criterios clínicos (confirmación con biopsia duodenal en ambos casos).

Materiales y Métodos

Para este trabajo se utilizaron sueros de pacientes celíacos y no celíacos, diagnosticados según los actuales criterios clínicos, confirmados con biopsia duodenal en ambos casos, los cuales requirieron atención en el Hospital Privado Centro Médico de Córdoba entre el año 2006 y el año 2009. A todos los pacientes se les solicitó su consentimiento informado avalado por el comité de ética de la Institución. Las muestras se conservaron a -80ºC hasta el momento de ser procesadas.
Se construyeron dos grupos de individuos: uno que contenía 100 muestras de suero de pacientes con diagnóstico clínico y de laboratorio de EC confirmado con biopsia duodenal positiva (pacientes EC); y un grupo de 50 muestras de suero de pacientes en los cuales se desestimó clínicamente y con datos del laboratorio la presencia de EC, confirmado con biopsia duodenal negativa (pacientes normales). Las características de ambos grupos se detallan en la Tabla I.

Tabla I. Características de pacientes EC y pacientes normales al momento de la toma de muestra.

La presencia de EMA fue determinada por inmunofluorescencia realizada sobre dos sustratos; improntas comerciales de EM (ORGENTEC Diagnostika, Mainz, Alemania) e improntas no comerciales realizadas in house con CUH embebido en medio de inclusión para congelación (alcohol polivinílico 25%), cortado en secciones de 4 µm con crióstato SHANDON (Astmoor, Runcorn, UK) y luego adherido a portaobjetos lavados previamente con alcohol. En todos los casos evaluados se determinó la concentración de IgA total (Tina-quant, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), con la finalidad de descartar la deficiencia de la misma.
Se evaluó significancia, sensibilidad, especificidad y el índice kappa (16); todos estos parámetros fueron calculados usando el software estadístico MedCalc (versión DEMO, 11.3.8.0, 1993-2010). Se utilizó un intervalo de confianza (IC) de 95% y se consideró una significancia estadística con un valor p <0,05.

MONTAJE DE LA TÉCNICA DE IFI
Para los dos tipos de sustratos utilizados se realizaron diluciones seriadas de los sueros al doble partiendo del título 1/10 hasta 1/5120 con el tampón diluyente PBS (Immuno Concepts, Sacramento, EEUU; pH 7,4; 0,01M). El volumen sembrado de cada dilución fue de 50 µL y se incubó a temperatura ambiente (TA) por 30 min. Se colocaron 50 µL de conjugado (globulina anti IgA humana marcada con isotiocianato de fluoresceína - FITC Biocientífica) diluido 1/100 con PBS a cada pocillo, se incubó a TA por 30 min, se lavaron las improntas con PBS y se secaron con papel absorbente. Para el montaje se utilizó glicerina tamponada (pH 7,4) y la lectura de los patrones fluorescentes se hizo con microscopio de fluorescencia Carl Zeiss Axiolab (Thornwood, NY, EE.UU.).

Resultados

En la Figura 1 se muestran los patrones inmunofluorescentes típicos de anti EMA en ambos sustratos.


Figura 1
. Patrón reticular o en panal de abeja típico que tiñe el endomisio del esófago de mono (40x).


Figura 2. Patrón reticular o en panal de abeja típico que tiñe la periferia (endomisio) de las células del músculo liso de la arteria umbilical (40x). Corte transversal.

De los 100 pacientes con EC evaluados se obtuvieron 98 resultados positivos con CUH y 96 con EM. De las 4 muestras negativas para EM, 2 resultaron negativas también para CUH, mientras que las 2 muestras restantes mostraron resultados discordantes entre ambos sustratos. A partir de los 50 sueros de pacientes normales se registraron 50 resultados negativos (100%) para CUH y EM (Tabla II).

Tabla II. Grupos de pacientes con EC y pacientes normales evaluados según los métodos de IFI que utilizan como sustrato CUH y EM para detectar EMA

De acuerdo a los resultados obtenidos, para el método que utiliza CUH como sustrato se encontró una sensibilidad del 98%, especificidad del 100%, valor predictivo positivo (VPP) de 100% y valor predictivo negativo (VPN) de 96% (Tabla III). El índice kappa calculado para establecer concordancia entre ambos métodos arrojó un resultado de 0,81 (0,75 - 0,87) cuya interpretación indica una "muy buena" concordancia (16).

Tabla III. Comparación de indicadores de validación de los sustratos CUH y EM para detectar EMA.

Discusión y Conclusiones

En la actualidad la EC es considerada una patología compleja, que representa un modelo de interacción entre factores ambientales (gluten), genéticos (sistema HLA) e inmunológicos (marcadores serológicos) (17)(18). La EC se considera una enfermedad del intestino delgado mediada por linfocitos T, e inducida por la ingesta de gluten en la dieta (7).
El método de referencia para el diagnóstico de EC es la biopsia duodenal. Esta metodología permite evidenciar la presencia de cambios histológicos en la mucosa del intestino delgado. Sin embargo, debido a la naturaleza multifacética de la enfermedad, los terapeutas utilizan determinaciones serológicas como indicadores de manera previa a la realización de una técnica invasiva como es la biopsia (5)(10)(19). En estudios anteriores se observó que en los casos de EC la contribución al diagnóstico fue mayor al realizarse de manera conjunta los aTgA y EMA y remitir a biopsia por endoscopía sólo a aquellos pacientes que arrojasen resultados positivos para uno o ambos métodos (3)(20)(21). Actualmente EMA es considerada una técnica que posee una alta sensibilidad y especificidad para EC; sin embargo, presenta desventajas importantes como el hecho de ser una metodología semicuantitativa, subjetiva y de alto costo (13)(18).
De los resultados obtenidos en este trabajo sobre el empleo de CUH como sustrato para detectar EMA se evidencia que, más allá de ser una metodología que depende en gran medida de la experiencia del operador, los resultados analíticos obtenidos avalados por el desarrollo estadístico aplicado, confirman la alta sensibilidad y especificidad del método, así como una elevada capacidad en la detección de pacientes enfermos.
Debe destacarse que 2 de las 4 muestras que arrojaron resultados falsos negativos utilizando EM fueron positivos, y a bajos títulos (1/40 y 1/80), empleando el CUH como sustrato. Una explicación posible a la mayor eficacia de este último sustrato podría ser la diferencia interespecie que presenta el esófago por provenir de primates. Además, el uso de EM presenta los problemas éticos de la utilización de animales protegidos (22), mientras que el uso de CUH (tejido rico en fibras de reticulina, endomisio y que no contiene IgA) como sustrato ha logrado que la técnica sea más accesible y menos costosa (23). Estas pruebas serológicas son utilizadas para evaluar pacientes con sospecha de EC, monitoreo de la adherencia a la dieta libre de gluten, y para la búsqueda de pacientes con manifestaciones atípicas o extraintestinales. En este sentido es importante mencionar que todas las pruebas serológicas basadas en anticuerpos para EC se normalizan durante la dieta libre de gluten, por ende su efectividad depende del consumo de gluten al momento de realizarlos (24)(25).
Finalmente, y con los datos obtenidos en el presente trabajo, se puede afirmar que el CUH podría reemplazar al EM como sustrato en la reacción de detección de anticuerpos anti endomisio, debido principalmente a la confiabilidad y eficacia demostrada por esta técnica; además el CUH es un tejido disponible en la mayoría de los centros de salud, de bajo costo y fácil accesibilidad para el montaje de esta metodología.

Referencias bibliográficas

1. Green P, Cellier C. Celiac Disease. N Engl J Med 2007; 357: 1731-43.         [ Links ]

2. Volta U, Villanacci V. Celiac Disease: diagnostic criteria in progress. Cel Mol Immunol 2011; 8: 96-102.         [ Links ]

3. Schuppan D, Junker Y, Barisani D. Celiac Disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterology 2009; 137: 1912-33.         [ Links ]

4. Fraser JS, King AL, Ellis HJ, Moodie SJ, Bjarnason I, Swift J, et al. An algortim for family screening for celiac disease. World J Gastroenterol 2006; 12(48): 7805-9.         [ Links ]

5. Caja S, Mäki M, Kaukinen K, Lindfors K. Antibodies in celiac disease: implications beyond diagnostics. Celular & Molecular Immunology 2011; 8:103-9.         [ Links ]

6. AGA Institute Medical position Statement on the Diagnosis and Management of Celiac Disease. Gastroenterology 2006; 131: 1977-80.         [ Links ]

7. Jabri B, Solllid LM. Mechanisms of disease: immunopathogenesis of celiac disease. Gastroenterol Hepatol 2006; 3(9): 516-25.         [ Links ]

8. Vader LW, De Ru A, Van der Wal Y, MC Kooy Y, Benckhuijsen W, Mearin ML, et al. Specificity of tissue transglutaminase explains cereal toxicity in celiac disease. J Exp Med 2002; 195(5): 643-9.         [ Links ]

9. Rozamberg O, Lerner A, Pacht A, Grinberg M, Reginashvili D, Henig C, et al. A new algorithm for the diagnosis of celiac disease. Cell Mol Inmunol 2011; 8: 146-9.         [ Links ]

10. Poland D, Ceelie H, Dinkelaar RB, Beijer C. Determination of anti-endomisium IgA antibodies in the diagnosis of celiac disease: comparison of a novel ELISA-based assay with conventional immunofluorescence. World J Gastroenterol 2006; 12(17): 2779-80.         [ Links ]

11. Skovbjerg H, Anthonsen D, Knudsen E, Sjöström H. Deamination of gliadin peptides in lamina propia: implications for celiac disease. Dig Dis Sci 2008; 53: 2917-24.         [ Links ]

12. Aleanzi M, Demonte AM, Esper C, Garcilazo S, Waggener M. Celiac disease: antibody recognition against native and selectively deaminated gliadin peptides. Clin Chem 2001; 47(11): 2023-8.         [ Links ]

13. Ladinser B, Rossipal E, Pittschieler K. Endomysium antibodies in celiac disease: an improved method. Gut 1994; 35: 776-8.         [ Links ]

14. Bagnasco M, Montagna P, De Alessandri A, Castellano E, Pesce GP, Gatti R. IgA antiendomysium antibodies in human umbilical cord sections as a screening test in relatives of patients with celiac disease. Allergy 1997; 52: 1017-21.         [ Links ]

15. Amara W, Husebekk A. Improved method for serological testing in celiac disease. Scand J Clin Lab Invest 1998; 58: 547-54        [ Links ]

16. Casey P, Altobelli G, Pignatelli P. Application of the hypothesis analysis method using Cohen's Kappa index to measure the agreement between leather sorters. Disponible en: http://www.aaqtic.org.ar (Fecha de acceso 15 de enero de 2012).         [ Links ]

17. Fasano A, Shea-Donohue T. Mechanisms of disease: the role of intestinal barrier function in the pathogenesis of gastrointestinal autoimmune diseases. Gastroenterol Hepatol 2005; 2(9): 416-22.         [ Links ]

18. Freeman HJ, Chopra A, Cladinin MT, Thomson A. Recent advances in celiac disease. World J Gastroenterol 2011; 17(18): 2259-72.         [ Links ]

19. Torsten M, Neihöfer S, Pfeiffer S, Prager K, Reuter S, Gershwin ME. Novel trends in celiac disease. Cell Mol Immunol 2011; 8: 121-5.         [ Links ]

20. Leffler DA, Schuppan D. Update on Serologic Testing in Celiac Disease. Am J Gastroenterol 2010; 105: 2520-4.         [ Links ]

21. Dickey W. Endoscopic markers for celiac disease. Gastroenterol Hepatol 2006; 3: 546-51.         [ Links ]

22. Regan T. Jaulas Vacías. El Desafío de los Derechos de los Animales. Barcelona: Fundación Altarriba. 2006: 168-87. ISBN 84-611-0672-5 ISBN 978-84-611-0672-1.         [ Links ]

23. Volta U, Molinaro N, Franceschi L, Fratnagelo D, Bianchi FB. IgA anti-endomysial antibodies on human umbilical cord tissue for celiac disease screening. Save both money and monkeys. Dig Dis Sci 1995; 40(9): 1902-5.         [ Links ]

24. Sollid LM, Khosla C. Future therapeutic options for celiac disease. Gastroenterol Hepatol 2005; 2(3): 140-7.         [ Links ]

25. American Gastroenterological Association (AGA). Institute Technical Review on the Diagnosis and Management of Celiac Disease. Gastroenterol 2006; 131: 1981-2002.         [ Links ]

Aceptado para su publicación el 29 de mayo de 2012

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