INMUNOLOGÍA

Desenmascaramiento del antígeno T por larvas de Trichinella spiralis y Ascaris lumbricoides

T antigen unmasking by Trichinella spiralis and Ascaris lumbricoides larvae

Desmascaramento do antigeno T por larvas de Trichinella spiralis e Ascaris lumbricoid

 

Patricia Ponce de León^{1 a}, Manuel Menéndez ^{2 a}, Griselda Bertorini^{1 a},
Claudia Biondi^{3 b}, Juana Valverde^{3 b}

1 Bioquímica.
2 Estudiante de Medicina.
3 Doctora en Ciencias Bioquímicas.
a Laboratorio de Parasitología.
b Laboratorio de Inmunohematología, Hemorreología e Inmunogenética. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. UNR. Argentina.

 

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Resumen

La activación T es causada por cambios en la estructura de la membrana de los glóbulos rojos (GR), que producen la aglutinación de esas células transformadas con la mayoría de los sueros de adultos ABO compatible. La unión del antígeno T con su anticuerpo específico desencadena poliaglutinación, hemólisis, trombocitopenia y trombosis. El objetivo del trabajo fue estudiar el efecto de larvas de A. lumbricoides y T. spiralis sobre el desenmascaramiento del antígeno T eritrocitario. Se trabajó con 3 concentrados de larvas L1/ L2 de A. lumbricoides (CLAL), y 6 de Larvas Musculares de T. spiralis (LM): CLAL1 y LM1: 450-500 larvas/mL; CLAL2 y LM2: 900-1000 larvas/mL; CLAL3 y LM3: 1800-2000 larvas/mL; LM4: 3000-3500 larvas/mL; LM5: 7500-8000 larvas/mL; LM6: 20.000 larvas/mL. Se utilizaron GR Grupo O en medio enzimático. Los GR se incubaron con igual volumen de CLAL/ LM y los GR Controles con solución fisiológica durante 120 minutos a 37 ºC. Se realizaron Pruebas de Aglutinación en Placa y en Tubo, enfrentando GR Tratados y Controles a sueros de adulto y de cordón. Los resultados mostraron que 2 de las 5 suspensiones de GR Tratados con CLAL3 y 1 de las 5 Tratadas con LM6, aglutinaron con suero de adulto, pero no con suero de cordón. Los GR incubados con los concentrados restantes y los Controles no aglutinaron con ninguno de los sueros. Se concluye que es importante continuar estos estudios para relacionar la activación T con las dosis infectantes en ascariosis y triquinosis, particularmente en patologías que cursen con déficit de ácido siálico.

Palabras clave: A. lumbricoides; T. spiralis; Desenmascaramiento; Antígeno T eritrocitario

Summary

T activation is caused by changes in the structure of red blood cells (RBC) membrane producing the agglutination of these transformed cells with the majority of adult ABO compatible sera. The union of T antigen with its specific antibody unleashes polyagglutination, haemolysis, thrombocytopenia, and thrombosis. The aim of the present work was to study the effect of A. lumbricoides and T. spiralis larvae on erythrocyte T antigen unmasking. Work was performed on 3 L1/ L2 larvae concentrates of A. lumbricoides (ALLC) and 6 muscle larvae concentrates of T. spiralis (ML): ALLC1 and ML1: 450-500 larvae/ mL; ALLC2 and ML2: 900-1,000 larvae/ mL; ALLC3 and ML3: 1,800-2,000 larvae/ mL; ML4: 3,000-3,500 larvae/ mL; ML5: 7,500-8,000 larvae/ mL; ML6: 20,000 larvae/ mL. Group O RBC in enzymatic medium were used. RBC were incubated with an equal volume of ALLC/ ML and the Controls with physiological solution for 120 minutes at 37 ºC. Plate and Tube Agglutination Tests were made, facing Treated RBC and Controls against adult and cord human sera. The results showed that 2 of the 5 RBC suspensions treated with ALLC3 and 1 of the 5 RBC suspensions treated with LM6 agglutinated with serum from adult, but not cord serum. RBC incubated with the remaining concentrates and Control suspensions were not agglutinated with any of the sera. It can be concluded that it is important to continue these studies to correlate T activation with infective dose in ascariosis and trichinosis, particularly in pathologies that course with sialic acid deficiency.

Key words: A. lumbricoides; T. spiralis; Unmasking; Erythrocyte T Antigen

Resumo

Ativação T é causada por alterações da estrutura do membrana dos glóbulos vermelhos (GV), que produz a agregação dessas células transformadas com a maioria dos soros de adultos ABO compatível. A União de antígeno T com o anticorpo específico desencadeia poliaglutinação, hemólise, trombocitopenia e trombose. O objetivo do trabalho foi estudar o efeito de larvas da A. lumbricoides e T. spiralis sobre o desmascaramento do antígeno T eritrocitário. Trabalhou-se com 3 concentrados de larvas L1 / L2 da A. lumbricoides (CLAL) e 6 de larvas musculares da T. spiralis (LM): CLAL1 y LM1: 450-500 larvas/mL; CLAL2 LM2: 900-1000 larvas/mL; CLAL3 y LM3: 1800-2000 larvas/mL; LM4: 3000-3500 larvas/mL; LM5: 7500-8000 larvas/mL; LM6: 20.000 larvas/mL. Foram utilizados eritrócitos Grupo O em meio enzimático de bromelina O sedimento globular foi incubado com igual volume de CLAL / LM e o de GR Controles com solução fisiológica durante 120 minutos a 37 ºC. Foram realizados Testes de Aglutinação em Placa e em Tubo, enfrentando os GV Tratados e Controles a soros humanos de adulto e de cordão. Se utilizaron GV Grupo O en medio enzimático. Os GV foram incubados com igual volume de CLAL/ LM e os GV Controles com solução fisiológica durante 120 minutos a 37 ºC. Realizaram-se Provas de Aglutinação em Placa e em Tubo, enfrentando GV Tratados e Controles a soros de adulto e de cordão. Os resultados mostraram que 2 das 5 suspensões de GV Tratadas com CLAL3 e 1 das 5 Tratadas com LM6, aglutinaram com soro de adulto, mas não com soro de cordão. Os GV incubados com as concentrações restantes e os Controles não aglutinaram com nenhum dos soros. Conclui-se que é importante continuar estes estudos para relacionar a ativação T com as doses infectantes em ascaríase e triquinose, particularmente em patologias que cursem com déficit de ácido siálico. controles, não aglutinaram com nenhum dos soros.

Palavras chave: A. lumbricoides; T. spiralis; Desmascaramento; Antígeno T eritrocitári

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Introducción

El antígeno T (Thomsen-Friedenreich) es una glicoproteína críptica (Gal-GalNAc), asociada a cáncer o tumor, debido a que se encuentra ausente o enmascarada en los tejidos normales ^{(1- 3)}. Sin embargo, las sustancias o lipopolisacáridos de ciertos microorganismos actúan como estímulo para la aparición de los anticuerpos naturales anti-T, principalmente de Clase IgA e IgM ⁽⁴⁾. Las aglutininas anti-T están presentes en todos los sueros de individuos adultos normales, pero no en el neonato ni en la infancia temprana ⁽⁵⁾⁽⁶⁾, permaneciendo sus niveles en suero estables para cada individuo sano, desconociéndose la razón de su variación en el estado de enfermedad ⁽⁷⁾.
La desialización del eritrocito podría exponer determinantes antigénicas de la membrana que habitualmente se encuentran ocultas, entre las cuales se encuentra el antígeno T eritrocitario. La activación T es causada por cambios en la estructura de la glicoproteína de la membrana de los glóbulos rojos produciendo la aglutinación de esas células transformadas con la mayoría de los sueros humanos normales provenientes de adultos ABO compatibles ⁽⁸⁾. La unión del antígeno T con su anticuerpo específico desencadena poliaglutinación in vitro y una posible hemólisis, trombocitopenia y trombosis in vivo ⁽⁹⁾. Otra complicación es la reacción hemolítica asociada a la transfusión, debido a que las IgM anti-T presentes en el plasma transfundido producen reacciones transfusionales importantes en el individuo receptor ⁽¹⁰⁾.
En experiencias previas se demostró que Ascaris lumbricoides altera la carga superficial eritrocitaria ^(11-15), así como también que los estadios larvales de este nematodo, en una concentración de 1300-1500 larvas/mL, pueden exponer al antígeno T del glóbulo rojo ⁽¹⁶⁾.
El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de distintas concentraciones de larvas de A. lumbricoides y Trichinella spiralis sobre el desenmascaramiento del antígeno T eritrocitario.

Materiales y Métodos

Muestras

Concentrado de Larvas de A. lumbricoides (CLAL): Se utilizaron 3 concentrados de larvas de primer y segundo estadio (L1/ L2) obtenidas por embrionación in vitro de huevos del helminto y posterior eclosión ⁽¹⁷⁾.
Concentrado de Larvas Musculares de T. spiralis (LM): Se trabajó con 6 concentrados de larvas L1 obtenidas de músculo de ratones CBi infectados, provenientes del Bioterio del Instituto de Genética Experimental de la Facultad de Ciencias Médicas (UNR), que fueron liberadas del músculo por digestión artificial con pepsina y acido clorhídrico ⁽¹⁸⁾.
huevos del helminto y posterior eclosión (17).
Concentrado de Larvas Musculares de T. spiralis (LM): Se trabajó con 6 concentrados de larvas L1 obtenidas de músculo de ratones CBi infectados, provenientes del Bioterio del Instituto de Genética Experimental de la Facultad de Ciencias Médicas (UNR), que fueron liberadas del músculo por digestión artificial con pepsina y acido clorhídrico ⁽¹⁸⁾.
Glóbulos rojos (GR) en medio enzimático de bromelina: Se seleccionaron 5 muestras de eritrocitos Grupo O provenientes de dadores sanos. Se colocó un volumen de sedimento globular, previamente lavado en solución salina, con un volumen y medio de bromelina durante 15 minutos en baño termostatizado a 37º C. A continuación los GR fueron lavados 3 veces con solución fisiológica ⁽⁵⁾.

Métodos

Tratamiento de los eritrocitos: Se realizó el tratamiento de los GR bromelinizados, el cual consistió en incubar el sedimento globular con igual volumen de CLAL/ LM a 37º C durante 120 minutos. Para cada tratamiento hubo un Control (GR en medio enzimático, sin contacto con las larvas) que fue incubado de la misma manera con 5igual volumen de solución salina. Al finalizar el tiempo de incubación, los sedimentos de los GR Tratados y Controles fueron lavados 3 veces en solución salina y se prepararon suspensiones al 20% y al 2-5%.
Prueba en Placa de Aglutinación anti-T con antígeno T: Se colocaron 30 µL de la suspensión de GR al 20% en 2 tubos. A uno se le agregaron 30 µL de suero de individuos adultos sanos (sueros anti-T) y al restante, 30 µL de suero de cordón (control negativo de anti-T). Todos los tubos se homogeneizaron por agitación y se colocaron, con tapones de goma, a 4 ºC durante 24 horas. Pasado este tiempo, se volcó el contenido de los tubos correspondientes en una placa de vidrio y se observó la presencia o ausencia de aglutinación ⁽⁵⁾.
Prueba en Tubo de Aglutinación anti-T con antígeno T: Se colocaron 30 µL de la suspensión al 2-5% de GR en 2 tubos. A uno se le agregaron 30 µL de suero de individuos adultos sanos (sueros anti-T) y al restante 30 µL de suero de cordón (control negativo de anti-T). Todos los tubos se homogeneizaron por agitación y se colocaron, con tapones de goma, a 4 ºC durante 24 horas. Luego fueron centrifugados durante 1 minuto a baja velocidad (500 rpm), y se agitaron para observar la presencia de aglutinados ⁽⁵⁾.

Resultados

Los resultados mostraron que 2 de las 5 suspensiones de GR tratados con CLAL3 y 1 de las 5 tratadas con LM6, aglutinaron con suero de adulto, pero no con suero de cordón, por lo que se evidenció en estas muestras el desenmascaramiento del antígeno T eritrocitario. De las 3 muestras que aglutinaron con suero de adulto, todas lo hicieron en la Prueba de Placa, mientras que en la Prueba de Tubo, solamente una de las muestras tratadas con CLAL3. Los eritrocitos incubados con las concentraciones restantes de CLAL y LM no aglutinaron con ninguno de los sueros, así como tampoco ninguno de los GR Controles.

Discusión y Conclusiones

La experiencia mostró que la alteración de carga de los eritrocitos en medio enzimático producida por CLAL3 y LM6 puede exponer al antígeno críptico T. Los resultados obtenidos en este trabajo se correlacionan con los presentados previamente, en los que se comunicó que el contacto de glóbulos parcialmente desializados con concentrados larvales L1/ L2 de A. lumbricoides que contenían 1300-1500 larvas/mL, puede desenmascarar al antígeno Thomsen-Friedenreich ⁽¹⁶⁾. La captación de ácido siálico producida por este nematodo es dependiente de la cantidad de larvas utilizada en el tratamiento ⁽¹⁹⁾, lo que sugeriría que a mayores concentraciones larvales también se podría producir la activación T. El tratamiento globular con larvas musculares infectantes de T. spiralis en concentraciones de 20000 larvas/mL, también puede provocar este efecto, indicando que para lograr la alteración de carga aniónica y la modificación de la membrana eritrocitaria que desenmascare al antígeno T, la cantidad de larvas de T. spiralis debería ser varias veces superior a la de A. lumbricoides.
Si bien la activación T está frecuentemente asociada con la producción de neuraminidasas de organismos como Clostridium perfringens, Streptococcus pneumoniae, Bacteroides, Escherichia coli, Actinomyces, el virus de la Influenza y Vibrio Cholerae ⁽²⁰⁾, sólo recientemente se ha relacionado a infecciones parasitarias ⁽¹⁶⁾.
La unión del antígeno T con su anticuerpo específico desencadena poliaglutinación in vitro y una posible hemólisis, trombocitopenia y trombosis in vivo ⁽⁹⁾, así como reacciones hemolíticas asociadas a la transfusión ^{(9)(10)(21)(22)}.
Los glóbulos rojos, en medio enzimático de bromelina, pierden parcialmente su contenido de ácido siálico, por lo que podrían homologarse a patologías in vivo que presentan déficit de carga aniónica eritrocitaria, como son la diabetes y la hipertensión ^(23)(24). La experiencia realizada permite concluir que es necesario continuar con estos estudios preliminares, utilizando mayor número de muestras y distintas concentraciones larvales, a los fines de relacionar la exposición del antígeno T eritrocitario con las dosis infectantes en ascariosis y triquinosis, particularmente en pacientes que cursen patologías con déficit de ácido siálico.

Correspondencia

Bioq. Patricia Ponce de León
Laboratorio de Parasitología. Dpto. de Microbiología Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas Suipacha 531 2000 ROSARIO, Santa Fe
E-mail: tefu1958@hotmail.com

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Aceptado para su publicación el 2 de noviembre de 2012