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Acta bioquímica clínica latinoamericana

Print version ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.46 no.4 La Plata Dec. 2012

 

MICROBIOLOGÍA

Desarrollo y validación de una PCR múltiple para el diagnóstico de Bordetella spp.

Development and validation of a multiplex PCR for diagnosis of Bordetella spp.

Desenvolvimento e validação de uma PCR múltipla para o diagnóstico de Bordetella spp.

 

Luis Alfredo Pianciola1 a, Melina Leonor Mazzeo2 a, Darío Flores2 b, Daniela Flavia Hozbor3 b

1 Magister en Microbiología Molecular
2 Bioquímico
3 Doctora en Bioquímica

a Laboratorio Central. Subsecretaría de Salud de Neuquén. Gregorio Martínez 65. Neuquén.
b Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Facultad Ciencias Exactas. Universidad Nacional de La Plata. Calles 49 y 115. La Plata. Argentina

 


Resumen

El objetivo del trabajo consistió en diseñar y validar una PCR en formato convencional que permita confirmar la presencia o ausencia de Bordetella pertussis y detectar otras especies del género, como Bordetella parapertussis y Bordetella bronchiseptica, que pudieran estar involucradas en el cuadro clínico de coqueluche. A tal fin se diseñó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple que amplifica una secuencia del promotor del gen de Toxina Pertussis y otra del gen de la Toxina Adenilato Ciclasa-Hemolisina. Se validó la metodología siguiendo esquemas publicados anteriormente. Se optimizaron las condiciones de la PCR. Se validó la metodología obteniéndose un límite de detección para ambas secuencias de 0,5 bacterias por reacción. Se validó, además, la especificidad y robustez de la técnica. Se presenta una nueva herramienta diagnóstica optimizada y validada, que permite detectar la presencia de las especies de Bordetella más frecuentemente involucradas en el cuadro clínico de coqueluche. Su uso combinado con alguna de las PCR habituales en diagnóstico, como la PCR IS481, permite aumentar la sensibilidad del diagnóstico de esta enfermedad, la especificidad del mismo discriminando los resultados falsos positivos/negativos y aumentar el conocimiento sobre los agentes etiológicos implicados en esta patología.

Palabras clave: Bordetella pertussis; Bordetella parapertussis; Bordetella bronchiseptica; Reacción en cadena de la polimerasa

Summary

The aim of the present work was to design and validate a conventional PCR that enables to confirm the presence or absence of Bordetella pertussis and to detect other Bordetella species, such as Bordetella parapertussis metoand B. bronchiseptica, that may be involved in this pathology. To this aim, a multiplex PCR that amplifies a sequence of the promoter of the Pertussis Toxin gene and a sequence of the Adenylate Cyclase Toxin-Hemolysin gene were designed. The PCR was validated following previously published schemes. PCR conditions were optimized. The methodology was validated obtaining a detection limit of 0.5 bacteria per reaction, for both sequences. Specificity and robustness of the technique were also validated. A new optimized and validated tool to detect the presence of the Bordetella species most frequently responsible of pertussis was presented. The combined use with some of the usual PCR, such as IS 481, may increase the sensitivity of the diagnosis of this disease, its specificity discriminating false positive/negative results and increase awareness of the etiologic agents involved in this pathology.

Key words: Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Polymerase chain reaction

Resumo

O objetivo do trabalho foi desenhar e validar uma reação em cadeia da polimerase (PCR) em formato convencional que permita confirmar a presença ou ausência de Bordetella pertussis e detectar outras espécies do gênero, como Bordetella parapertussis e Bordetella bronchiseptica, que pudessem estar envolvidas no quadro clínico de coqueluche. Para tal, foi desenhada uma PCR múltipla que amplifica uma sequência do promotor do gene de Toxina Pertussis e outra do gene da Toxina Adenilato Ciclase-Hemolisina. A metodologia foi validada seguindo esquemas publicados anteriormente. Foram otimizadas as condições da PCR. Validou-se a metodologia obtendo-se um limite de detecção para ambas as sequências de 0,5 bactérias por reação. Validou-se também a especificidade e robustez da técnica. Apresenta-se uma nova ferramenta diagnóstica otimizada e validada, que permite detectar a presença das espécies de Bordetella mais frequentemente envolvidas no quadro clínico de coqueluche. Seu uso combinado com alguma das PCR habituais em diagnóstico, como a PCR IS481, permite aumentar a sensibilidade do diagnóstico desta doença, a especificidade do mesmo discriminando os resultados falsos positivos/negativos e aumentar o conhecimento sobre os agentes etiológicos envolvidos nesta patologia.

Palavras chave: Bordetella pertussis; Bordetella parapertussis; Bordetella bronchiseptica; Reação em cadeia de Polimerase


 

Introducción

Pertussis o coqueluche es una infección respiratoria aguda, altamente contagiosa y particularmente grave en menores de un año. Se estima que esta enfermedad inmunoprevenible, luego de más de 60 años de vacunación, aún produce en el mundo 30 millones de casos por año con más de 300 000 muertes (1)(2). El principal agente etiológico de esta enfermedad es una bacteria gramnegativa perteneciente al género Bordetella denominada Bordetella pertussis. Otra especie del género, Bordetella parapertussis, también causa la enfermedad, aunque con menor frecuencia y generalmente presenta cuadros más leves (3). Bordetella bronchiseptica es primariamente un patógeno animal, pero también puede causar infecciones en seres humanos, generalmente en pacientes inmunocomprometidos (4). Recientemente, esta especie ha sido asociada a cuadros similares a pertussis, aunque generalmente con evolución clínica menos severa (5). Bordetella holmesii, la última especie descripta asociada a infecciones respiratorias, se ha encontrado en sangre de adultos jóvenes y ocasionalmente en el tracto respiratorio. Ha sido relacionada también a cuadros similares a pertussis aunque su impacto epidemiológico en esta patología aún no se conoce (6)(7).
La presentación clínica de pertussis se caracteriza por la presencia de algunos de los siguientes signos y/o síntomas: tos paroxística, estridor inspiratorio y vómitos después de toser. Sin embargo, ésta puede variar con la edad y el estado inmune del paciente. Así, los lactantes pueden presentar apneas y cianosis sin otro síntoma característico de la enfermedad mientras que los adolescentes y adultos, que aún cuentan con cierta inmunidad, pueden presentar síntomas más moderados e incluso en algunos casos, típicos. En la enfermedad clásica, el diagnóstico clínico puede realizarse sin dificultad. Sin embargo, en aquellos casos en los que la clínica dista de la presentación clásica, se requiere de confirmación por el laboratorio (8). Lo mismo ocurre cuando es necesario el diagnóstico etiológico diferencial entre las distintas especies de Bordetella (3). El cultivo es altamente específico y está considerado el estándar de oro pero su sensibilidad es baja, la metodología es compleja y demora varios días hasta tener un resultado. La serología es más sensible y específica pero el requerimiento, en el formato más difundido en este medio, de una muestra de la fase convaleciente, lo hace un diagnóstico tardío y de escasa utilidad clínica (9). El desarrollo de la tecnología de amplificación de ácidos nucleicos ha tenido un impacto significativo en el diagnóstico y manejo de muchas enfermedades infecciosas (10), incluyendo pertussis (11). En Argentina se utiliza habitualmente una metodología dirigida específicamente a detectar ADN de B. pertussis (12), dada la importancia epidemiológica de esta especie sobre las demás. A pesar del buen desempeño de la metodología y el excelente aporte al diagnóstico clínico, su especificidad impide el conocimiento de la participación de las otras especies de Bordetella en el cuadro clínico. Se han descripto metodologías que amplifican otras regiones del genoma de Bordetella spp como la secuencia codificante de la toxina adenilato ciclasa-hemolisina (13), la del gen de la porina (14)(15), la secuencia de inserción IS481 (16), la secuencia de inserción IS1001 (17), la del gen de flagelina (4), etc. Cada uno de estos ensayos tiene especificidad variable para una especie de Bordetella, por lo tanto si se quiere obtener información sobre la presencia o no de otras especies relacionadas a la patología, deben realizarse varios ensayos independientes. Recientemente se han descripto algunos ensayos en formato múltiple, pero todos ellos basados en PCR en tiempo real, con costos que dificultan o impiden su aplicación en este medio (18).
En este trabajo se presenta el diseño y validación de una PCR múltiple en formato convencional destinada al diagnóstico clínico en muestras respiratorias. La misma tiene la suficiente especificidad para confirmar presencia o ausencia de B. pertussis y a la vez la sensibilidad necesaria para detectar otras especies del género Bordetella (B. parapertussis y B. bronchiseptica) que pudieran estar involucradas en el cuadro clínico. Para ello se seleccionó como uno de los blancos posibles la secuencia promotora del gen que codifica para la toxina pertussis, específica para B. pertussis, descartando la IS481 ya que, aunque más sensible, también está presente en B. holmesii (19)(20) y B. bronchiseptica (15). Para el otro blanco de la PCR, orientada a la detección de las otras especies potencialmente involucradas en la patología, se eligió la secuencia del gen que codifica para la toxina Adenilato Ciclasa-Hemolisina (AC-Hly). Esta metodología fue descripta en 1993 por Douglas et al (13). La misma permite la amplificación de un fragmento de 522 pares de bases (pb), lo que la hace compatible con la amplificación múltiple junto con la PCR del gen promotor de toxina pertussis (191 pb).

Por otra parte, la evolución de los microorganismos con la aparición de secuencias polimórficas, podría afectar la especificidad e incluso la sensibilidad de las distintas PCR. Estos parámetros también pueden verse 76 afectados por errores técnicos como en todo proceso analítico, además de otras fallas relacionadas a los sistemas abiertos de detección de amplicones. Los resultados falsos positivos y negativos causados por polimorfismos en las secuencias blanco, variaciones técnicas o ambos, pueden evidenciarse mediante la detección simultánea de múltiples secuencias blanco (15), como en la metodología propuesta en este trabajo.

Materiales y Métodos

Cepas utilizadas y extracción de ADN: Las cepas a utilizar en los distintos ensayos fueron repicadas en los medios adecuados, a partir de los cuales se realizó una suspensión en agua bidestilada hasta una turbidez equivalente al tubo 1 del estándar de Mc Farland. En el caso particular de las cepas de Bordetella spp la suspensión se preparó a partir del desarrollo bacteriano obtenido en placas de agar Bordet Gengou (Difco, Sparks, MD, EEUU) suplementado con sangre de carnero 15%, luego de 72 h de incubación a 37 °C y de un repique posterior de 24 h en el mismo medio y condiciones de incubación. La suspensión se realizó en agua bidestilada. El lisado para utilizar en las distintas experiencias se realizó calentando las suspensiones durante 10 min en baño de agua a 100 ºC y centrifugando a 8000 x g durante 5 min. Las cepas utilizadas como controles positivos fueron: B. pertussis cepa Tohama (CIP 8132), B. bronchiseptica cepa HHH 2589 y B. parapertussis cepa HHH 3800.
La optimización de la PCR múltiple se realizó a partir del conocimiento de las condiciones de las dos PCR originales.
PCR de la secuencia promotora del gen de toxina pertussis: Se utilizó la PCR descripta por Grimprel et al en 1993 (12), con algunas modificaciones realizadas en el laboratorio por los autores (21). Este ensayo amplifica la secuencia promotora del gen que codifica para toxina pertussis, obteniéndose una banda de 191 pb. Los cebadores utilizados fueron:

PTp1: 5´ CCAACGCGCATGCGTGCAGATTCGTC 3´ y
PTp2: 5´ CCCTCTGCGTTTTGATGGTGCCTATTTTA 3´.

La PCR se llevó a cabo en un volumen final de 20 µL, con concentraciones finales de 50 mM de KCl (Fermentas UAB, Vilnius, Lithuania), 10 mM Tris-HCl (pH 8,3) (Fermentas UAB, Vilnius, Lithuania), 2,5 mM de MgCl2, (Fermentas, UAB, Vilnius, Lithuania), 200 µM de cada deoxinucleótido trifosfato (Invitrogen, Carlsbad, CA, EEUU), 1,0 µM de cada cebador (Operon, Huntsville, AL, EEUU) y 0,05 U/µL de Taq polimerasa (Fermentas UAB, Vilnius, Lithuania). Se utilizaron 3 µL de templadologíado. La amplificación consistió en una primera desnaturalización de 75 s a 94 ºC, seguida de 35 ciclos, cada uno de ellos compuesto por 20 s de desnaturalización a 94 ºC, 10 s de hibridación a 60 ºC y 15 s de elongación a 72 ºC. La elongación final fue de 30 s a 72 ºC.

PCR del gen codificante de Adenilato Ciclasa-Hemolisina: se utilizaron los reactivos y condiciones descriptos por Douglas et al en 1993 (13). Este ensayo amplifica el gen que codifica para la toxina Adenilato Ciclasa-Hemolisina, obteniéndose una banda de 522 pb. La secuencia de los cebadores utilizados fue la siguiente:

AC1: 5´ ATGCAGCAATCGCATCAGGCTGGTTAC 3´ y
AC2: 5´ GCCGATCACCTTGACCGCCTCGAAAT 3´

La PCR se llevó a cabo en un volumen final de 20 mL, con concentraciones finales de 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2,5 mM de MgCl2, 200 mM de cada deoxinucleótido trifosfato, 0,5 mM de cada cebador y 0,05 U/mL de Taq polimerasa. Se utilizaron 3 mL de templado. La amplificación consistió en una primera desnaturalización de 2 min a 94 ºC, seguida de 40 ciclos, cada uno de ellos compuesto por 25 s de desnaturalización a 94 ºC, 10 s de hibridación a 53 ºC y 20 s de elongación a 72 ºC. La elongación final fue de 20 s a 72 ºC.

Puesta a punto de la PCR múltiple AC-Hly/PT (PCRAC-Hly/PT): se partió de las siguientes condiciones y reactivos (22), que son compatibles con las óptimas para cada PCR individual. La PCR se llevó a cabo en un volumen final de 20 mL, conteniendo concentraciones finales de 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2,5 mM de MgCl2, 200 mM de cada deoxinucleótido trifosfato, 0,5 mM de cada cebador y 0,05 U/mL de Taq polimerasa. Se utilizaron 3 mL de templado. La amplificación consistió en una primera desnaturalización de 2 min a 94 ºC, seguida de 40 ciclos, cada uno de ellos compuesto por 25 s de desnaturalización a 94 ºC, 15 s de hibridación a 56 ºC y 20 segundos de elongación a 72 ºC. La elongación final fue de 20 s a 72 ºC.

Análisis de los productos de PCR: los productos de la PCR se analizaron en corridas electroforéticas empleando geles de agarosa al 2% (p/v) que contenían 0,5 mg/mL de bromuro de etidio (Invitrogen, Carlsbad, CA, EEUU). Las corridas se realizaron a 120 V durante 20 min. Los resultados se analizaron por visualización del gel a la luz ultravioleta y fueron registrados empleando una cámara fotográfica digital Panasonic Lumix (Kadoma, Osaka, Japón).

Procesamiento de muestras clínicas: se utilizaron aspirados o hisopados nasofaríngeos procesados según técnicas descriptas previamente (21).

VALIDACIÓN DE LA PCR AC-HLY/PT

Rango de trabajo: se utilizó la cepa B. pertussis TOHAMA (Colección Instituto Pasteur, París, Francia, CIP 8132), en diluciones que abarcaban desde 5x102 a 5x10-2 bacterias/reacción. La prueba se realizó por triplicado por dos operadores distintos en tres días distintos. Se determinó el Límite de Detección para la PCR AC-Hly/PT y para cada una de las PCR individuales, PCR PT y PCR AC-Hly, en sus condiciones propias. También fue determinado el Límite de Corte mediante sucesivas repeticiones del ensayo.

Selectividad: para la prueba de Inclusividad se utilizaron 33 cepas de Bordetella spp (20 B. pertussis, 8 B. bronchiseptica y 5 B. parapertussis) provenientes de aislamientos clínicos de los laboratorios de los autores o de otros laboratorios colaboradores. Para estimar la Exclusividad se utilizaron 32 cepas de distintas especies bacterianas, cuyo detalle se muestra en la Tabla I.

Tabla I. Cepas utilizadas en los ensayos de Exclusividad.

Robustez: se utilizaron cuatro cepas: Streptococcus pneumoniae ATCC 49619, Bordetella pertussis HHH 3066, Bordetella parapertussis HHH 3800 y Bordetella bronchiseptica HHH 2589. Se evaluaron las variables que podrían afectar el desempeño del ensayo, como cambios en equipo, operador y día de realización de la reacción.

Resultados

PUESTA A PUNTO DE LA PCRAC-Hly/PT

Se comenzó por evaluar el comportamiento de cada par de cebadores en las condiciones que se emplearían en la PCR múltiple. Para ello se preparó una mezcla de reactivos que contenían sólo cebadores que hibridan con la secuencia de PT y otra solo cebadores que hibridan con la de AC-Hly. En las condiciones estándar detalladas se produjo adecuada amplificación de las dos secuencias seleccionadas.
Cuando se emplearon ambos cebadores en la misma mezcla de reacción para realizar la PCR múltiple, se obtuvo amplificación de ambas secuencias. Sin embargo, la intensidad de las bandas indicaba un desempeño subóptimo de la amplificación en el formato múltiple y por lo tanto, la necesidad de mejorar la sensibilidad de la reacción. Con este objetivo se analizaron los cambios posibles en las condiciones de reacción y se realizaron distintas experiencias para evaluarlos. Las modificaciones consideradas fueron: distintos tiempos de elongación, distintas temperaturas de hibridación, diferentes concentraciones de cebadores de AC-Hly y de PT, agregado de agentes adyuvantes como dimetil sulfóxido (DMSO) y seroalbúmina bovina (BSA), así como distintas concentraciones de Mg y de Taq polimerasa (23). A continuación se detallan los resultados obtenidos al modificar cada una de las condiciones indicadas.

Tiempo de elongación: Se cambió de 20 a 30 segundos. La sensibilidad de la PCR mejoró significativamente en especial en lo que se refiere al amplicón de la secuencia correspondiente a AC-Hly

Temperatura de hibridación: se realizó una experiencia en la que se emplearon distintas temperaturas cercanas a las óptimas para cada par de cebadores. Se determinó que a 60 ºC se obtiene la mayor sensibilidad e intensidad de las bandas para cada uno de los amplicones.
Con estas modificaciones las condiciones de la PCR quedaron definidas de la siguiente forma: una primera desnaturalización de 2 min a 94 ºC, seguida de 40 ciclos, cada uno de ellos compuesto por 25 s de desnaturalización a 94 ºC, 15 s de hibridación a 60 ºC y 30 s de elongación a 72 ºC. La elongación final fue de 20 s a 72 ºC.

Concentración de los cebadores: se diseñaron experiencias cuantitativas que permitieran conocer la concentración óptima de cada uno en la solución final de reacción. La máxima sensibilidad se logró con cantidades equimoleculares de los 2 pares de cebadores, especialmente cuando se utilizó 1 mL de cada uno, lo que equivale a una concentración final en el tubo de reacción de 0,5 mM.

Concentración de cloruro de magnesio: se realizó una experiencia utilizando distintas cantidades de cloruro de magnesio. El límite de detección no varió con los cambios en la concentración de Mg en el rango estudiado (2,0 a 3,0 mM); sin embargo se pudo apreciar una baja en la intensidad de las bandas a medida que la misma disminuía. Se consideró como concentración óptima la de 2,5 mM ya que con ella se logró una disminución en la intensidad de las bandas inespecíficas sin repercusión apreciable en la intensidad de las bandas específicas.

Agregado de dimetil sulfóxido: para mejorar la sensibilidad general de la PCR, se evaluó el agregado de dimetil sulfóxido (Fluka-Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) a la reacción en una concentración de 5%. Se observó que la adición de este componente incrementó el rendimiento de la PCR, especialmente la amplificación de la secuencia de AC-Hly.

Aumento de la concentración de Taq Polimerasa: el aumento en la cantidad de unidades de Taq polimerasa agregadas a la mezcla de reacción (de 1U a 1,5U por reacción) derivó en una mejoría en la detección de muestras muy débilmente positivas en la PCR PT y que hasta ese momento no habían podido detectarse con la PCR múltiple.

Agregado de seroalbúmina bovina: para mejorar la sensibilidad de la reacción se probó el agregado de seroalbúmina bovina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU) a la mezcla de reacción en una concentración de 0,5 mg/mL. Con este cambio se detectaron muestras muy débilmente positivas que eran negativas en las condiciones anteriores.
En base a todas las experiencias anteriores las concentraciones finales de los reactivos de la PCR AC-Hly/PT quedaron definidas de la siguiente forma: 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2,5 mM de MgCl2, 200 µM de cada deoxinucleótido trifosfato, 0,5 µM de cada cebador, 0,075 U/µL de Taq polimerasa, 5% v/v de dimetil sulfóxido y 0,5 mg/mL de albúmina bovina. Se utilizaron 3 µL de templado para un volumen final de 20 mL.

VALIDACIÓN DE LA PCR AC-Hly/PT

Rango de trabajo: Tanto las PCR simples como las dos secuencias de la múltiple, presentaron el mismo límite de detección de 0,5 bacterias por reacción. Esto indica que se lograron las condiciones óptimas de la PCR múltiple para conservar la sensibilidad de las reacciones individuales (Figura 1). Luego de sucesivas repeticiones se obtuvieron idénticos resultados en la banda de PT pero la de AC-Hly varió entre 0,5 y 5 bacterias por reacción. De esta forma, se concluye que el límite de detección para PT coincide con el límite de corte (0,5 bacterias por reacción), mientras que para AC-Hly el límite de detección coincide con los anteriores pero el límite de corte es de 5 bacterias por reacción. Algunas de las repeticiones y sus variaciones se muestran en la Figura 2.


Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa 2% (p/v) de los productos de las reacciones de PCR PT, AC-Hly y múltiple AC-Hly/PT. Límite de detección para las tres PCR. Como templado se utilizó el material obtenido de la lisis de suspensiones de B. pertussis (cepa Tohama) en concentraciones equivalentes a 5x102 a 5x10-2 bacterias/reacción. Calle 1: control negativo (agua bidestilada). Calle 2: B. pertussis 5x102 bacterias/reacción. Calle 3: B. pertussis 5x101 bacterias/reacción. Calle 4: B. pertussis 5x100 bacterias/reacción. Calle 5: B. pertussis 5x10-1 bacterias/reacción. Calle 6: B. pertussis 5x10-2 bacterias/reacción. Calle 7: Control positivo (material obtenido de la lisis de una suspensión de B. pertussis, cepa Tohama). Para la visualización se empleó bromuro de etidio a 0,5 mg/mL.


Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa 2% (p/v) de los productos de la reacción de PCR múltiple AC-Hly/PT. Límite de corte. A a E: distintas repeticiones. Como templado se utilizó el material obtenido de la lisis de suspensiones de B. pertussis (cepa Tohama) en concentraciones equivalentes a 5x102 a 5x10-2 bacterias/reacción. Calle 1: control negativo. Calle 2: B. pertussis 5x102 bacterias/reacción. Calle 3: B. pertussis 5x101 bacterias/reacción. Calle 4: B. pertussis 5x100 bacterias/reacción. Calle 5: B. pertussis 5x10-1 bacterias/reacción. Calle 6: B. pertussis 5x10-2 bacterias/reacción. Calle 7: Control positivo. Para la visualización se empleó bromuro de etidio a 0,5 mg/mL.

Selectividad: Al determinar la Inclusividad, la totalidad de las cepas estudiadas presentaron las bandas esperadas para el o los genes correspondientes, al evaluar el ADN equivalente a 103 UFC por reacción. Así, las cepas de B. pertussis presentaron las bandas de 191 pb y 522 pb, correspondientes a la amplificación de las secuencias de PT y AC-Hly, respectivamente. En el caso de B. bronchiseptica y B. parapertussis, se observó sólo la banda correspondiente a AC-Hly (522 pb). Con respecto a la Exclusividad, en su totalidad las cepas presentaron ausencia de señal para los dos fragmentos genómicos considerados, al evaluar la PCR con una concentración de ADN correspondiente a 103 UFC por reacción. Algunos de estos resultados se muestran en la Figura 3.


Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa 2% (p/v) de los productos de la reacción de PCR múltiple AC-Hly/PT. Panel A: Prueba de Inclusividad. Calles 1 a 7: cepas de B. pertussis. Calle 8: control negativo. Calles 9 a 11: cepas de B. pertussis. Calle 12: control positivo. Calles 13 a 18: cepas de B. pertussis. Calle 19: control negativo. Panel B: Prueba de Inclusividad. Calles 1 a 4: cepas de B. bronchiseptica. Calle 5: control negativo. Calles 6 a 8: cepas de B. bronchiseptica. Calle 9: control positivo. Calles 10 a 14: cepas de B. parapertussis. Panel C: Prueba de Exclusividad. Calle 1: control negativo. Calles 2 a 7: cepas 3 a 8. Calle 8: control positivo. Calles 9 a 13: cepas 10 a 14.

Robustez: las cuatro cepas estudiadas presentaron la señal o señales esperadas en un total de doce repeticiones que incluyeron dos operadores, dos termocicladores y realizadas en tres días distintos. Se demuestra así que la PCR es resistente al cambio de respuesta cuando se introducen cambios deliberados tanto de operador como de termociclador y se realizan en tres días distintos. Algunas de esas experiencias con las distintas situaciones citadas anteriormente, se muestran en la Figura 4.


Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa 2% (p/v) de los productos de la reacción de PCR múltiple AC-Hly/PT. Prueba de robustez. Operador 1: A, B y C. Operador 2: D, E y F. Calle 1: control negativo. Calle 2: Streptococcus pneumoniae ATCC 49619. Calle 3: B. bronchiseptica. Calle 4: B. parapertussis. Calle 5: B. pertussis. Calle 6: control positivo.

Discusión y Conclusiones

En coqueluche, como en muchas otras enfermedades infecciosas de alta contagiosidad, un diagnóstico rápido es de vital importancia. Especialmente porque permite que el tratamiento antibiótico tenga impacto en la reducción de los síntomas y en el bloqueo de la diseminación del patógeno (16). En este contexto es que el diagnóstico molecular basado en PCR realiza un aporte invalorable a la vigilancia y control de la enfermedad. Desde la introducción de esta metodología para el diagnóstico de coqueluche en 1989, se han publicado distintas metodologías en más de 100 trabajos. Se han usado como blanco en las distintas técnicas a diferentes regiones del genoma de Bordetella sp: secuencias de inserción, gen de adenilato ciclasa, gen de porina, secuencia promotora del gen de la toxina pertussis, etc (16). A pesar del gran adelanto que significó el aporte de la PCR al diagnóstico, la metodología no fue aún completamente estandarizada.
Si bien existe un gran desarrollo de PCR en tiempo real, los costos para países como la Argentina impiden su uso en el diagnóstico de rutina. Así es que las técnicas de PCR en su formato convencional mantienen plena vigencia y es necesario avanzar en mejoras de las mismas. El desarrollo y validación de una PCR en formato múltiple implicaría un avance en este sentido. Por un lado, podría disminuir los falsos negativos debidos a la existencia de variantes polimórficas o a errores técnicos en el proceso analítico. Por otra parte, permitiría ampliar el rango de especies detectables.
La elección de la secuencia blanco es crítica para cualquier ensayo de PCR. Es deseable que, además de los beneficiosenunciados anteriormente, el uso de una metodología múltiple brinde información adicional sobre el o los agentes etiológicos presentes en la muestra estudiada. En el caso de diagnóstico de coqueluche, es altamente recomendable que la combinación de cebadores elegida permita la detección de las principales especies de Bordetella que causan la enfermedad, además de brindar información sobre la presencia o ausencia de B. pertussis, microorganismo que causa más del 90% de los casos.
En el presente trabajo se diseñó y puso a punto una PCR múltiple utilizando como secuencia blanco a la secuencia promotora del gen de la toxina pertussis ya que es específica para B. pertussis y el laboratorio de los autores tiene amplia experiencia con esta metodología. Se incluyó además, una secuencia interna del gen que codifica para Adenilato Ciclasa-Hemolisina ya que está presente en las tres especies más frecuentes que causan infecciones con sintomatología compatible con pertussis (B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica) y además puede compatibilizarse con la PCR anterior en un formato múltiple. Los tamaños de los productos de amplificación (191 pares de bases para la PCR de la secuencia promotora de toxina pertussis y 522 para la de Adenilato Ciclasa-Hemolisina) son claramente diferenciables en un gel de agarosa. Adicionalmente, es posible compatibilizar las temperaturas de hibridación de los distintos cebadores.
En este trabajo se optimizaron las condiciones de reacción de la PCR múltiple y luego la metodología optimizada fue validada. Este es un requisito indispensable para que un método analítico pueda ser aplicado al estudio de muestras en forma habitual, dado que las características de su desempeño deben estar definidas y adecuadamente aseguradas (24). Las Normas ISO definen validación como la confirmación obtenida mediante la provisión de evidencia objetiva, de haber cumplido los requisitos particulares para un uso pretendido y específico (24)(25).
En estos ensayos se ha podido determinar que el desempeño en la validación de la PCR AC-Hly/PT fue óptimo ya que se obtuvo un límite de detección igual al de cada PCR realizada individualmente. El mismo fue de 0,5 bacterias por reacción, lo que implica una excelente sensibilidad para el diagnóstico de la patología.

Las pruebas de selectividad permitieron corroborar el excelente desempeño de la PCR, demostrando un 100% de resultados óptimos, tanto en los ensayos de inclusión como en los de exclusión.
Finalmente, quedó demostrada la robustez del ensayo
obteniendo resultados 100% concordantes al variar el operador, el equipo utilizado y realizando la metodología en tres días diferentes. En total se probó para este parámetro el desempeño de la PCR en doce situaciones distintas.
En resumen, se presenta una nueva herramienta diagnóstica que puede significar un aporte importante al desafío de diagnosticar esta patología. Su uso combinado con alguna de las PCR habituales en diagnóstico, como la PCR IS481, puede aumentar la sensibilidad del diagnóstico de coqueluche, la especificidad del mismo discriminando los resultados falsos positivos/negativos y aumentar el conocimiento sobre los agentes etiológicos implicados en la patología.
Teniendo en cuenta la probable presencia de agentes etiológicos distintos de B. pertussis, la posible presencia de microorganismos con variantes polimórficas en las secuencias blanco estudiadas y la posible ocurrencia de errores técnicos, se recomienda la utilización de esta PCR múltiple junto con la de IS481, basándose en el algoritmo diagnóstico que figura en la Tabla II.

Tabla II. Algoritmo de interpretación de los resultados de PCR.

En las primeras pruebas de la nueva herramienta diagnóstica con muestras clínicas y utilizando los algoritmos diagnósticos propuestos, se pudieron detectarvarios pacientes infectados con B. parapertussis con cuadro clínico compatible con coqueluche, además de otros pacientes infectados con B. pertussis. Estos resultados que a entender de los autores son los primeros notificados sobre la circulación de B. parapertussis en Argentina, demuestran la utilidad de la PCR desarrollada en este trabajo.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Laboratorio Nacional de Referencia de Coqueluche (Instituto de Biotecnología y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata) y al Laboratorio de Microbiología del Hospital Horacio Heller de Neuquén, por haber cedido gentilmente la mayoría de las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo.

Correspondencia

Mag. en Microb. Mol. Luis A. Pianciola Gregorio Martínez 65 8300 - Neuquén, Argentina
E-mail: luispianciola@yahoo.com.ar

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Aceptado para su publicación el 17 de abril de 2012

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