BIOQUÍMICA CLÍNICA

Electroforesis bidimensional en orina: una alternativa para el laboratorio clínico*

Two dimensional electrophoresis in urine: an alternative for the clinical laboratory

Eletroforese bidimensional em urina: uma alternativa para o laboratório clínico

 

María Laura Facio¹, Leticia Madalena², Susana Fraind¹, Mariel Alejandre¹, Pablo Bresciani¹, Marco Pizzolato²

¹ Bioquímico.
² Doctor en Bioquímica.
* Departamento de Bioquímica Clínica. Laboratorio de Proteínas. INFIBIOC. Hospital de Clínicas José de San Martín. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires.

CORRESPONDENCIA DRA. MARÍA LAURA FACIO Departamento de Bioquímica Clínica Facultad de Farmacia y Bioquímica Junín 956, 1113 CIUDAD DE BUENOS AIRES, Argentina.E-mail: mlfacio@hotmail.com

---

Resumen

En este trabajo se presenta un método confiable para el análisis de rutina de proteínas urinarias. El método es la electroforesis bidimensional que combina la electroforesis en acetato de celulosa con la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio seguida de tinción argéntica. La electroforesis bidimensional abre el espectro de proteínas, siendo algunas de ellas identificadas por immunoblotting o espectrometría de masa MALDI. Dichas proteínas son de bajo peso molecular: Orosomucoide (40 kDa), apolipoproteína AI (28 kDa), zinc-alfa 2-glicoproteína (43 kDa), fragmento del perlecan C-terminal LG3 (23 kDa), prostaglandina D2 sintasa tipo-lipocalina (29 kDa) e inter-alfa inhibidor de tripsina cadena pesada H4 (35 kDa). Estas proteínas están incluidas en estudios de falla renal aguda, falla renal crónica, trasplante renal, enfermedad glomerular y enfermedad maligna del tracto urogenital. El método, no invasivo, se aproxima a la tecnología emergente de la proteómica que permite el análisis simultáneo de varias proteínas urinarias como una herramienta para el diagnóstico y monitoreo de una variedad de enfermedades humanas.

Palabras clave: Electroforesis bidimensional en orina; Zinc-alfa2-glicoproteína; Péptido LG3; Prostaglandina D2 sintasa; Inter-alfa-tripsina inhibidor H4; Endotelio vascular.

Summary

A method suitable for routine clinical analyses of urinary proteins is presented. This method is a two-dimensional electrophoresis procedure, combining cellulose acetate electrophoresis and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels electrophoresis followed by silver staining. The resulting two-dimensional electrophoresis opened the protein spectrum and some of the latter were identified, by immunoblotting or MALDI mass spectrometry. There are low molecular weight protein: Orosomucoid (40 kDa), apolipoprotein AI (28 kDa), Zinc-alpha2-glycoprotein (43 kDa), C-terminal perlecan fragment LG3 (23 kDa), lipocalin-type prostaglandin D2 synthase (29 kDa) and inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 (35 kDa). They include studies of acute and chronic kidney injury, renal transplantation, glomerular disease and malignancy of the urogenital tract. This method approaching the emerging proteomic technologies allows simultaneous examination of the patterns of multiple urinary proteins as a powerful non-invasive tool for diagnosis and monitoring of variety of human diseases.

Key words: Two-dimensional electrophoresis urine; Zinc-alpha2-glycoprotein; Fragment LG3; Prostaglandin D2 synthase; Inter-alpha-trypsin inhibitor H4; Vascular endothelial.

Resumo

Neste trabalho é apresentado um método confiável para a análise de rotina de proteínas urinárias. O método é a eletroforese bidimensional que combina a eletroforese em acetato de celulose com a eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio seguida de tinção argêntea. A eletroforese bidimensional abre o espectro de proteínas, sendo algumas delas identificadas por immunoblotting ou espectrometria de massa MALDI. Tais proteínas são de baixo peso molecular: Orosomucoide (40 kDa), apolipoproteína AI (28 kDa), zinco-alfa2-glicoproteína (43 kDa), fragmento do perlecan C-terminal LG3 (23 kDa), prostaglandina D2 sintase tipo-lipocalina (29 kDa) e inter-alfa inibidor de tripsina cadeia pesada H4 (35 kDa). Estas proteínas estão incluídas em estudos de falência renal aguda, falência renal crônica, transplante renal, doença glomerular e doença maligna do trato urogenital. O método, não invasivo, aproxima-se da tecnologia emergente da proteômica que permite a análise simultânea de várias proteínas urinárias como uma ferramenta para o diagnóstico e monitoração de uma variedade de doenças humanas.

Palavras chave: Eletroforese bidimensional urina; Zinco-alfa2-glicoproteína; Peptídeo LG3; Prostaglandina D2 sintase; Inter-alfa-tripsina inibidor H4; Endotélio vascular.

---

 

Introducción

La tecnología emergente de la proteómica permite el examen simultáneo de múltiples proteínas y su correlación con el diagnóstico, respuesta al tratamiento o pronóstico ⁽¹⁾. Una de las metodologías que aplica es la electroforesis bidimensional (2D) que combina la separación de proteínas en una primera instancia por isoelectroenfoque y luego por peso molecular en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, permitiendo de esta forma una mejor separación de las proteínas, las cuales forman un patrón proteico que puede ser caracterizado. La mayoría de los estudios para el descubrimiento de biomarcadores han utilizado un método cualitativo, buscando proteínas o péptidos que aparezcan o desaparezcan en la muestra de individuos enfermos en comparación con muestras de individuos sanos, a través de la electroforesis 2D asociada con espectrometría de masa y/o identificación inmunoquímica de proteínas. El descubrimiento de biomarcadores con variada sensibilidad y especificidad es cada vez mayor, no obstante persisten algunos desafíos en trasladar estos hallazgos a la práctica clínica ⁽²⁾. Muchos estudios se han enfocado en la identificación de biomarcadores en enfermedad renal y en enfermedades del tracto urogenital. Ellos incluyen el estudio de injuria renal aguda, rechazo renal agudo, enfermedad glomerular, y enfermedad maligna del tracto urogenital, entre otros ^(2-5). En pacientes con carcinoma de células de transición se identificaron a las proteínas orosomucoide (Oroso) y Zinc alfa-2 glicoproteína (ZAG) como potenciales marcadores tumorales utilizando electroforesis 2D. Ambas están incrementadas y la abundancia de estas proteínas en orina aumenta con el estadio del tumor ⁽⁶⁾. También pueden ser utilizadas en enfermedades sistémicas, como pancreatitis aguda, apnea obstructiva del sueño, cáncer de ovario temprano y cáncer de pulmón ^(7-10).
En 1989 Lapin et al. proponen la electroforesis bidimensional para uso clínico (2D UC) en el estudio de proteínas urinarias, combinando como primer paso la electroforesis en acetato de celulosa y luego la separación por peso molecular en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y coloración con Coomassie Blue R 250 ⁽¹¹⁾.
Actualmente, el estudio proteico urinario que se realiza en la práctica clínica es la electroforesis en acetato de celulosa, uroproteinograma (URO), que tiene limitaciones para definir el perfil tubular en comparación con el SDS-PAGE monodimensional (1D) y la cuantificación de microproteínas urinarias, alfa 1 y beta 2 microglobulinas ⁽¹²⁾. A su vez, en el seguimiento de pacientes con trasplante renal, el perfil tubular fue mejor evaluado y monitoreado por el método de la electroforesis 2D UC coloreado con tinción argéntica ⁽¹³⁾.
La presente propuesta consiste en utilizar el método de Lapin con coloración argéntica en muestras de orina como una aproximación al estudio de la proteómica para utilidad en el Laboratorio Clínico y para identificar el espectro proteico que se abre en la electroforesis 2D UC.

Materiales y Métodos

MUESTRAS
Orinas de 24 horas.

PROCEDIMIENTO
Primera dimensión: Acetato de celulosa gelatinizado (Cellogel-Biosystem), buffer veronal pH 8.6; Fi 0,05 (Helena).
Segunda dimensión: Mini protean 3 System Bio-Rad, gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) al 12,5% de concentración final. Buffer de corrida continuo tris glicina con SDS.
Se realizó la corrida electroforética de la muestra en primera dimensión en acetato de celulosa por duplicado, una como control de corrida y posición de las bandas proteicas y otra para la corrida electroforética vertical en segunda dimensión. Se sembró con sembrador lineal semimicro realizando 3 toques en el punto de siembra para el control, y entre 10 y 20 µL de orina (dependiendo de la concentración proteica de la muestra) con microjeringa en forma pausada y lineal, de la misma longitud que el sembrador semimicro, para la segunda. Se sembraron aproximadamente de 2 a 20 µg de proteína total. Se realizó la corrida electroforética en buffer veronal durante 30 min a 200 voltios. La corrida control se colocó en el fijador para continuar la coloración argéntica (14) y la segunda se sumergió inmediatamente en el gel de apilamiento (stacking) antes de su gelificación. A ambos lados de la tira de acetato se realiza una cavidad para sembrar 10 µL de muestra, diluida al medio con buffer muestra y el control de peso molecular, que correrán en una dimensión (SDS-PAGE clásico, monodimensional, 1D). Se realizó la electroforesis vertical durante 45 min a 200 voltios y luego se procedió a la coloración argéntica (15).

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Se realizó por Immunoblotting con antisueros específicos anti apolipoproteína A1 (Dako) y anti-orosomucoide (Dako) y como segundo anticuerpo anti-IgG de cabra o conejo (Sigma) marcado con peroxidasa, respectivamente.  
Espectrometría de masa (EM): Se procesó un spot coloreado con tinción argéntica y un blanco del mismo gel. Se digirió in gel utilizando tripsina como enzima proteolítica. El extractivo de cada una de las muestras se sometió a análisis en el espectrómetro de masas tipo MALDI-TOF-TOF (4800 plus, ABSciex, Concord, Canadá). Los datos se obtuvieron primeramente en Modo Reflectron y posteriormente se realizó la fragmentación de las señales más importantes. Se utilizó el programa Mascot PMF para la identificación de las proteínas a través de las masas moleculares de los péptidos (M+H+). Para el análisis de los espectros EM/EM se utilizó el programa MS/MS Ion Search de Mascot y el programa Paragom de Protein Pilot.

Resultados

En la Figura 1 se muestra un esquema del conjunto de las proteínas urinarias observadas en diferentes muestras patológicas en la electroforesis 2D UC. Las proteínas con peso molecular superior a la albúmina indican daño glomerular mientras que las inferiores indican daño tubular. En el ejemplo de la orina de un paciente con síndrome nefrótico se observa la mejor resolución de la 2D UC comparado con el SDS-PAGE en una dimensión (1D). También se lo compara con el perfil proteico en 2D que utiliza isoelectroenfoque como primera dimensión en el trabajo de Sanju SA et al. ⁽⁵⁾, donde están presentes las mismas proteínas (Figura 2).

Figura 1. Electroforesis bidimensional. Esquema del mapa de proteínas urinarias observadas en diferentes muestras patológicas por 2D UC.
IgG (150 kDa), 2- Tf (90 kDa), 3- Albúmina (67 kDa), 4- Alfa 1 antitripsina, 5- Proteína que une la Vitamina D (50-58 kDa), 6- Zinc-alfa 2 glicoproteína (41 kDa), 7- Orosomucoide (40 kDa), 8- Prealbúmina (33 kDa), 9- Cadenas livianas de inmunoglobulinas policlonales (45 y 25 kDa), 10- Prostanglandina-H2 D-isomerasa (29 kDa), 11- Alfa 1 microglobulina (30 kDa), 12- Apolipoproteína A I (28 kDa), 13- Proteína que liga el retinol (20 kDa), 14- Lisozima (14 kDa), 15- monómero de Hemoglobina (14 kDa), 16- Beta 2 microglobulina (12 kDa), 17- Inter alfa tripsina inhibidor cadena pesada H4 (35 kDa) y 18- Péptido LG3 (23 kDa).

Figura 2.
A) Orina de un paciente con síndrome nefrótico por 2D UC. a) 1D paciente, b) orina control.
B) Orina de un paciente con síndrome nefrótico por electroforesis 2D. Sanju SA. y col. Urine Biomarkers Predict the Cause of Glomerular Disease. J Am Soc Nephrol 2007; 18: 913-922. 1- IgG (150 kDa), 2- Tf (90 kDa), 3- Albúmina (67 kDa), 4-Alfa 1 antitripsina, 5- Proteína que une la Vitamina D, 6- Zinc-alfa 2 glicoproteína (43 kDa), 7- Orosomucoide (40 kDa), 8- Prealbúmina (33 kDa), 9- Cadenas livianas de inmunoglobulinas policlonales (45 y 25 kDa), 10- Prostanglandina-H2 D-isomerasa (29 kDa), 11-Alfa 1 microglobulina (30 kDa), 12-Apolipoproteína A I (28 kDa), 13- Proteína que liga el retinol (20 kDa), 14-Lisozima, 15- Hemoglobina monómero, 16-Beta 2 microglobulina (12 kDa).

Además de las bandas visualizadas en el SDS-PAGE en 1D, que también se confirman en la electroforesis 2D UC, se abre el espectro y se evidencia en algunos pacientes un grupo de proteínas con movilidad electroforética entre alfa-1 y alfa-2 globulinas y un PM entre 70 y 40 kDa, aproximadamente (Figura 3). Estas proteínas son orosomucoide (Oroso) o alfa-1 glicoproteína ácida de 41 kDa que se identificó por immunoblotting (Figura 4). La glicoproteína alfa-2 que precipita con sales de zinc (ZAG) con un PM aproximado de 43 kDa se identificó por espectrometría de masa (EM) (Tabla 1) y la proteína que une la vitamina D o Gc globulina (DBP) con un PM comprendido entre 50-58 KDa y la alfa-1 antitripsina (A1AT) con un PM comprendido entre 45 y 65 KDa aproximadamente, según bibliografía (12). Por otro lado, estas proteínas no siempre se observan todas en conjunto en un mismo paciente y además pueden variar en su concentración. En la Figura 5 se observa el 2D UC de un paciente trasplantado renal con nefropatía crónica del trasplante grado Ia y severa arteriolopatía hialina donde se destacan principalmente el orosomucoide y la a1 antitripsina (A1AT).

Figura 3. Grupo de proteínas con movilidad electroforética entre alfa-1 y alfa-2 globulinas y un PM entre 70 y 40 KDa aproximadamente
A1AT: alfa 1 anti tripsina, DBP: proteína que liga la vitamina D, ZAG: Proteína que precipita con sales de Zinc y Oroso: Orosomucoide. a) 1D Paciente, b) 1D orina control

Figura 4. 2D UC Orina
A)Tinción argéntica. B) Immunoblotting frente a anti orosomucoide. Orosomucoide (Oroso). 1) Orina del Paciente, 2) Marcador de PM (Rainbow Molecular Weight Markers Range 2.5-45 KDa) Amersham-England. Biosciences)

 

 

 

Tabla 1. Identificación por espectrometría de masa. Secuencias de Péptidos de mayor confiabilidad del análisis MS/MS.

Figura 5. 2D UC. Trasplante renal, Punción Biopsia Renal:
Nefropatía Crónica del Trasplante con severa arteriolopatía hialina.
1- Albúmina (67 KDa), 2-Orosomucoide (40 kDa), 3-A1m (30 kDa), 4-Apo AI(28 kDa), 5-Hap 1-1(85 kDa) y 2-1(120 kDa), 6- Tf (90 kDa) 7-RBP (20 kDa) 8-A1AT, 9- Hemop (80 kDa), 10-CL (45 y 25 kDa), 11-B2m (12 kDa),12- IgG (150 kDa), 13-Beta trace (28 kDa).
a) 1D orina Paciente, b) orina control.

Se realizó el immunoblotting con anti apolipoproteína A1 (Apo A1) para identificar dicha proteína en la posición 29 kDa en el SDS-PAGE 1D, la que estuvo presente sólo en la muestra 4 (Figura 6). Se evidencia una superposición de proteínas en la banda. Mediante la corrida bidimensional se observaron dos movilidades electroforéticas distintas, una con la movilidad de la albúmina y otra con la de beta 1. La primera correspondía a Apo A1 y la segunda a proteína Beta Trace (BT) o sintasa o isomerasa (tipo lipocalina) de la prostanglandina D2, identificada por EM (Tabla I).

Figura 6. Orina de pacientes (1, 2, 3, 4 y 5) con trasplante renal. Immunoblotting frente a anti Apolipoproteína A1 (Apo A1).
Presencia de Apo A1 en el paciente 4.

 

Por otro lado, el espectro proteico también se abre en los PM de 35 y 23 kDa con movilidad electroforética aproximadamente en beta-1. Se identificaron por EM inter-alfa-tripsina inhibidor cadena pesada H4 (IAI4) y el péptido LG3 respectivamente (Tabla I). Las proteínas BT, IAI4 y LG3 no fueron informadas por Lapin. En la Figura 7 se observa la orina de un paciente con trasplante hepático, diabético y tratamiento inmunosupresor con inhibidor mTOR donde se identificaron dichas proteínas. En la Figura 8 se observa la orina de un paciente diabético tipo 2 y de un paciente hipertenso, ambos normoalbuminúricos con un perfil tubular incompleto, es decir, con ausencia de proteínas de PM menor a 25 kDa .

Figura 7. 2D UC. Orina de un paciente con trasplante hepático,
diabético y tratamiento con mTOR. a) Paciente, b) orina control.
1- inter alfa inhibidor de tripsina cadena pesada H4,
2- Prostaglandina H2 D sintasa y 3-Péptido LG3.

Figura 8.
A) 2D UC. Orina de un Paciente Diabetico tipo 2. Normoalbuminurico. a)1D paciente, b) 1D orina control.
B) 2D UC Orina de un paciente Hipertenso Normoalbuminurico, b) 1D paciente. 1- ZAG, 2- Cadenas Livianas de Inmunoglobulinas policlonales, 3-Alfa 1 microglobulina, 4- inter alfa inhibidor de tripsina cadena pesada H4, 5-Prostaglandina H2 D sintasa y 6-Inmunoglobulinas enteras policlonales.

 

La electroferesis 2D UC fue de utilidad para resolver la orina de un paciente que presentaba daño tubular y una banda monoclonal catódica que también se visualizaba en el suero en la misma posición que en la orina. Se debía resolver si tenía proteinuria de Bence Jones (cadenas livianas monoclonales libres, BJ) superpuesta o no a la inmunoglobulina entera; esta última puede atravesar la barrera de filtración aunque no haya compromiso glomerular, por su alta concentración sérica. En el caso de la Figura 9, se presentan dos pacientes con la misma problemática, donde hubo superposición de bandas en la separación por carga del componente monoclonal entero y de la cadena liviana monoclonal libre y se separaron por el PM, el componente monoclonal entero de 150 kDa y las cadenas livianas libres como monómero y dímero en 25 y 45 kDa . Por lo tanto, los pacientes presentaron en la orina proteinuria de BJ que se resolvió en la separación por PM.

Figura 9. Electroforesis 2D UC de dos orina con un componente monoclonal y daño tubular. Presencia de la inmunoglobulina monoclonal entera y la cadena liviana monoclonal con la misma movilidad electroforética. Se diferencian por sus respectivos pesos moleculares.
a1) Paciente 1, a2) Paciente 2, b) Orina control

Discusión y Conclusiones

El método propuesto con la coloración argéntica de Swisser et al. ⁽¹⁵⁾ es de utilidad para proteínas de baja concentración con una sensibilidad entre 50 y 100 ng de proteína por banda. Además, dicha coloración es compatible con la identificación de las proteínas por espectrometría de masa, utiliza como solución fijadora, metanol y formaldehido. El tiempo completo para la realización de la 2D UC es de 4 horas para 2 pacientes simultáneamente.
Al realizar la electroforesis 2D UC se abre el espectro proteico donde se visualiza un grupo de proteínas, similares en carga y peso molecular. Dichas proteínas son la zinc alfa-2 glicoproteína (ZAG), el orosomucoide (Oroso), la alfa-1 antitripsina (A1AT) y la proteína Gc o transportadora de la vitamina D (DBP).
La proteína ZAG es un polipéptido de cadena única de 43 kDa, que se secreta en distintos líquidos biológicos ^(16-18). La ZAG es considerada como un miembro del gen de la superfamilia de las inmunoglobulinas en base a su secuencia aminoacídica y dominio estructural ⁽¹⁸⁾. Está involucrada preferentemente en la depleción de ácidos grasos desde el tejido adiposo, subsecuentemente llamada "factor movilizador de lípidos" ⁽¹⁹⁾. Este factor, el cual es altamente expresado en la caquexia debida al cáncer, se ha identificado y caracterizado como proteína biomarcadora en diversos fluidos orgánicos, como el suero y la orina, para detección temprana de enfermedades, particularmente de enfermedades malignas ⁽²⁰⁾. Jain et al. demostraron por 2D y EM en muestras de orina de pacientes diabéticos tipo 2 con microalbuminuria, la presencia de proteínas adicionales, como ZAG, Oroso, A1AT e IgG ⁽²¹⁾.
La proteína orosomucoide no sólo es una proteína de síntesis hepática, sino también puede ser sintetizada por otros tejidos o células, como el endotelio vascular ⁽²²⁾. Aparentemente, interviene en la permoselectividad de la barrera glomerular aportando cargas negativas al glicocálix del endotelio ⁽²³⁾. Además, esta proteína en orina es un poderoso predictor de mortalidad cardiovascular en pacientes normoalbuminúricos con diabetes tipo 2 ⁽²⁴⁾.
La proteína beta trace (BT), identificada como sintasa de la prostaglandina D2, es una proteína cerebro-específica que se produce principalmente en las leptomeninges y el plexo coroides y se secreta al líquido cefalorraquídeo ⁽²⁵⁾. Sin embargo, está también presente en otros fluidos corporales, como suero, orina, líquido amniótico y plasma seminal (26). Se excreta completamente por riñón y es estable a pH urinario ⁽²⁷⁾. La BT cataliza la isomerización de la prostaglandina H2 a prostaglandina D2 y está involucrada en varias acciones fisiológicas como la regulación del sueño, la inhibición de la agregación plaquetaria y la inducción de la vasodilatación ^(28-31).
En pacientes con angina pectoris, la concentración plasmática de BT en la vena cardiaca mayor fue más elevada que en las arterias coronarias, sugiriendo que la BT es biosintetizada y secretada por el miocardio o en las células endoteliales escleróticas (32) Además, se ha informado que la fuerza de rozamiento o la tensión entre la sangre que circula y la pared vascular (fluid shear stress) aumenta la producción de la expresión del ARNm de BT en células vasculares endoteliales ⁽³³⁾. Hirawa N et al. en 2001 demostraron la excreción urinaria incrementada de BT en pacientes con estadio temprano de nefropatia diabética ⁽³⁴⁾. Pacientes con hipertensión esencial exhibieron niveles elevados de BT en suero y en orina los que se incrementan con el avance de la disfunción renal. Estos datos sugieren que el metabolismo está relacionado con la presión sanguínea y con la injuria renal asociada con hipertensión ⁽³⁵⁾.
El péptido LG3 es un fragmento del Perlecan, un proteoglicano ampliamente expresado en estadios de desarrollo temprano en muchos tejidos vascularizados y en el cartílago avascular, que interactúa con otros componentes de la membrana basal y varios factores de crecimiento durante la vasculogénesis ^(36-39). La célula endotelial apoptótica libera proteasas, las cuales inducen proteólisis de la membrana basal, una característica de la vasculopatía crónica del trasplante ^(40-42). La proteólisis del perlecan de la membrana basal lleva a la producción de un fragmento activo carboxilo terminal (LG3) antiapoptótico en las células del músculo liso vascular y en fibroblastos ^(43)(44).
La proteína inter alfa tripsina inhibidor cadena pesada 4(ITIH4) es una proteína de fase aguda sintetizada principalmente por el hígado ⁽⁴⁵⁾. La proteína de 120 kDa fue propuesta como precursora de péptidos bioactivos generados por la kalicreína plasmática ⁽⁴⁶⁾. La ITIH4 genera dos fragmentos, uno carboxilo terminal de 35 kDa y el otro de 85 kDa . El de 35 kDa, el cual está O-glicosilado, permanece intacto mientras que el de 85 kDa se continúa fraccionando ⁽⁴⁷⁾. Los fragmentos obtenidos de regiones ricas en prolina están asociados con diferentes condiciones de enfermedad y pueden aportar importante información diagnóstica. El patrón de los fragmentos puede ser útil como biomarcador potencial para detección y clasificación de cáncer ⁽⁴⁸⁾. El fragmento de 35 kDa correlacionó con diferentes enfermedades malignas en sus estadios y progresión, se observó un aumento en el suero de pacientes con adenocarcinoma endometrial, en cáncer de mama y de ovario ^(49)(50).
Las proteínas ZAG, Oroso, ITIH4, BT y LG3 se encuentran cuando coexiste un daño glomerular, tubular o mixto, pero no siempre acompañan dichos perfiles. En los dos casos de pacientes con proteinuria de BJ, ambos presentan una proteinuria tubular, presencia de A1m, RBP y B2m, pero no se observan las proteínas antes mencionadas. Las proteínas ZAG, Oroso, ITIH4, BT y LG3 parecen tener como denominador común el endotelio vascular, ya que algunas como la ZAG y el Oroso intervienen en la permeabilidad vascular, la BT sintetiza prostaglandina D2 importante en la relajación del músculo liso arterial, el péptido LG3 es generado de un proteoglicano a partir de proteasa de la célula endotelial apoptótica, y el fragmento ITIH4 de 35 KDa se genera por la kalicreína, la cual forma parte del sistema kalicreína-kinina implicado a nivel circulatorio sistémico y renal, semejante al sistema renina angiotensina, pero con efectos opuestos. Se podría decir que este grupo de proteínas parecen reflejar un cambio en el endotelio vascular y una interacción entre la célula endotelial y la matriz extracelular.
La técnica propuesta de electroforesis bidimensional para uso clínico abre el espectro de proteínas urinarias, las cuales no se detectan actualmente por los métodos de rutina empleados en el Laboratorio Clínico. Estas podrían reflejar un daño a nivel vascular e intersticial, importante para la detección precoz y para el seguimiento de los distintos tipos de nefropatía.

Referencias bibliográficas

1. Hortin GL, Jortani SA, Ritchie JC Jr., Valdes R Jr., Chan DW. Proteomics: A new diagnostic frontier. Clin Chem 2006; 52(7): 1218-22.         [ Links ]

2. Barratt J, Topham P. Urine proteomics: the present and the future of measuring urinary protein components in disease. CMAJ 2007; 177(4): 361-8.         [ Links ]

3. Devarajan P, Williams LM. Proteomics for biomarker discovery in acute kidney injury. Semin Nephrol 2007; 27(6): 637-51.         [ Links ]

4. O'riordan E, Orlova TN, J Mei J, Butt K, Chander PM, Goligorsky MS, et al. Bioinformatic analysis of the urine proteome of acute allograft rejection. J Am Soc Nephrol 2004; 15: 3240-8.         [ Links ]

5. Sanju SA, Powell TB, Budisavljevic MN, Oates JC, Raymond JR, Almeida JS, et al. Urine biomarkers predict the cause of glomerular disease. J Am Soc Nephrol 2007; 18: 913-22.         [ Links ]

6. Pisitkun T, Johnstones R, Knepper MA. Discovery of urinary biomarkers. Mol Cell Proteomics 2006, 5: 1760-71.         [ Links ]

7. Valmu L, Ravela S, Stenman UH. Proteomic analysis of pancreatic secretory trypsin inhibitor/tumor-associated trypsin inhibitor from urine of patients with pancreatitis or prostate cancer. Methods Mol Biol 2010; 641: 347-57.         [ Links ]

8. Gozal D, Jortani S, Snow AB, Kheirandish-Gozal L, Bhattacharjee R, Kim J, et al. Two-dimensional differential in-gel electrophoresis proteomic approaches reveal urine candidate biomarkers in pediatric obstructive sleep apnea. Am J Respir Crit Care Med 2009; 180: 1253-61.         [ Links ]

9. Chambers AF, Vanderhyden BC. Ovarian cancer biomarkers in urine. Clin Cancer Res 2006; 12(2): 325-7.         [ Links ]

10. Tantipaiboonwong P, Sinchaikul S, Sriyam S, Phutrakul S, Chen ST. Different techniques for urinary protein analysis of normal and lung cancer patients. Proteomics 2005; 5: 1140-9.         [ Links ]

11. Lapin A, Gabl F, Kopsa H. Diagnostic use of analysis of proteins by a practicable sodium dodecyl-electrophoresis method and rapid two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 1989; 10: 589-95.         [ Links ]

12. Facio ML, Madalena LB, Bresciani PD, Alejandre ME, Fraind S, Pizzolato M, et al. Evaluación del perfil tubular renal mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio. Acta Bioquím Clín Latinoam 2006; 40 (3): 383-90.         [ Links ]

13. Facio ML, Madalena LB, Bacqué MC, Idiarte L, Bresciani P, Pizzolato M, et al. Seguimiento del perfil proteico urinario en el trasplante renal. Acta Bioquím Clín Latinoam 2010; 44 (4): 653-60.         [ Links ]

14. García M. Electroforesis de proteínas urinarias sin concentración previa de las muestras. Rev Asoc Bioquim Argent 1994; 58 (3):171-83.         [ Links ]

15. Switzer RC, Merril CR, Shifrin S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem1979; 98(1): 323-7.         [ Links ]

16. Burgi W, Schmid K. Preparation and properties of Zn-alpha 2-glycoprotein of normal human plasma. J Biol Chem 1961; 236: 1066-74.         [ Links ]

17. Tada T, Ohkubo I, Niwa M, Sasaki M, Tateyama H, Eimoto T. Immunohistochemical localization of Zn-alpha 2-glycoprotein in normal human tissues. J Histochem Cytochem 1991; 39: 1221-6.         [ Links ]

18. Araki T, Gejyo F, Takagaki K, Schaller J, Rickli E, Brossmer R, et al. Complete amino acid sequence of human plasma Zn-alpha 2-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 679 - 83.         [ Links ]

19. Bao Y, Bing C, Hunter L, Jenkins JR, Wabitsch M, Trayhurn P. Zinc-alpha 2-glycoprotein, a lipid mobilizing factor, is expressed and secreted by human (SGBS) adipocytes. FEBS Lett 2005; 579: 41 - 7.         [ Links ]

20. Bing C, Bao Y, Jenkins J, Sanders P, Tisdale MJ, Trayhurn P, et al. Zinc-alpha 2-glycoprotein, a lipid mobilizing factor, is expressed in adipocytes and is up-regulated in mice with cancer cachexia. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 2500 - 5.         [ Links ]

21. Jain S, Rajput A, Kumar Y, Uppuluri N, Arvind AS, Tatu U. Proteomic analysis of urinary protein markers for accurate prediction of diabetic kidney disorder. J Assoc Physicians India 2005; 53: 513 - 20.         [ Links ]

22. Sôrensson J, Matejka G, Ohlson M, Haraldsson B. Human endothelial cells produce orosomucoid, an important component of the capillary barrier. Am J Physiol 1999; 276: H530-H534.         [ Links ]

23. Camici M. Renal glomerular permselectivity and vascular endothelium. Biomedicine & Pharmacotherapy; 2005. 59; 30-7.         [ Links ]

24. Cristiansen MS, Hommel E, Magid E, Rasmunssen-Feldt B. Orosomucoid in urine is a powerful predictor of cardiovascular mortality in normoalbuminuric patients with type 2 diabetes at five years of follow-up. Diabetologia 2005; 48: 386-93.         [ Links ]

25. Watanabe K, Urade Y, Mader M, Murphy C, Hayaishi O. Identification of-trace as prostaglandin D synthase. Biochem Biophys Res Commun 1994; 203: 1110-6.         [ Links ]

26. Melegos DN, Diamandis EP, Oda H, Urade Y, Hayaishi O. Immunofluorometric assay of prostaglandin D synthase in human tissue extracts and fluids. Clin Chem 1996; 42: 1984-91.         [ Links ]

27. Urade Y, Hayaishi O. Biochemical, structural, genetic, physiological, and pathophysiological features of lipocalin-type prostaglandin D synthase. Biochim Biophys Acta 2000; 1482: 259-71.         [ Links ]

28. Urade Y, Fujimoto N, Hayaishi O. Purification and characterization of rat brain prostaglandin D synthase. J Biol Chem 1985; 260: 12410 -5.         [ Links ]

29. Hayaishi O, Urade Y. Prostaglandin D2 in sleep-wake regulation: Recent progress and perspectives. Neuroscientist 2002; 8: 12-5.         [ Links ]

30. Bushfield M, McNicol A, MacIntyre DE. Inhibition of platelet-activating-factor-induced human platelet activation by prostaglandin D2: Differential sensitivity of platelet transduction processes and functional response to inhibition by cyclic AMP. Biochem J 1985; 232: 267-71.         [ Links ]

31. Braun M, Schror K. Prostaglandin D2 relaxes bovine coronary arteries by endothelium-dependent nitric oxide-mediated cGMP formation. Circ Res 1992; 71: 1305-13.         [ Links ]

32. Inoue T, Takayanagi K, Morooka S, Uehara Y, Nakajima H, Urade Y, et al. Serum prostaglandin D synthasa level after coronary angioplasty may predict occurrence of retenosis. Tromb Haemost 2001; 85: 165-70.         [ Links ]

33. TabaY, SasaguriT, Miyagi M, Abumiya T, Ikeda T, Mitsumata M, et al. Fluid shear stress induces lipocalin-type prostaglandin D2 synthasa expression in vascular endotelial cells. Circ Res 2000; 86: 967-73.         [ Links ]

34. Hirawa N, Uehara Y, Ikeda T, Seiki K, Nakajima H, Urade Y, et al. Urinary prostanglandin D syntasa (beta trace) excretion increases in the early stage of diabetes mellitus. Nephron 2001; 42: 1201-7.         [ Links ]

35. Nobuhito Hirawa, Yoshio Uehara, Minoru Yamakado, Yoshiyuki Toya, Yoshihiro Urade, Satoshi Umemura, et al. Lipocalin-type prostaglandin D synthase in essential hypertension. Hypertension 2002; 39: 449-54.         [ Links ]

36. Murdoch AD, Liu B, Schwarting R, Tuan RS, Iozzo RV. Widespread expression of perlecan proteoglycan in basement membranes and extracellular matrices of human tissues as detected by a novel monoclonal antibody against domain III and by in situ hybridization. J Histochem Cytochem 1994; 42(2): 239-49.         [ Links ]

37. Yurchenco PD, Amenta PS, Patton BL. Basement membrane assembly, stability and activities observed through a developmental lens. Matrix Biol 2004; 22(7): 521-38.         [ Links ]

38. Hassell J, Yamada Y, Arikawa-Hirasawa E. Role of perlecan in skeletal development and diseases. Glycoconj J. 2002; 19(4-5): 263-7.         [ Links ]

39. Handler M, Yurchenco PD, Iozzo RV. Developmental expression of perlecan during murine embryogenesis. Dev Dyn 1997; 210(2): 130-45.         [ Links ]

40. Cailhier JF, Sirois I, Laplante P, Lepage S, Pshezhetsky AV, Hébert MJ, et al. Caspase-3 activation triggers extracellular cathepsin L release and endorepellin proteolysis. J Biol Chem 2008; 283: 27220-9.         [ Links ]

41. Joosten SA, Sijpkens YW, van Ham V, van den Heuvel B, van Kooten C, Paul LC, et al. Antibody response against the glomerular basement membrane protein agrin in patients with transplant glomerulopathy. Am J Transplant 2005; 5: 383-93.         [ Links ]

42. Joosten SA, van Dixhoorn MG, Borrias MC, van Veelen PA, van Kooten C, Paul LC, et al. Antibody response against perlecan and collagen types IV and VI in chronic renal allograft rejection in the rat. Am J Pathol 2002; 160: 1301-10.         [ Links ]

43. Raymond MA, Désormeaux A, Laplante P, Landry K, Pshezhetsky AV, Hébert MJ, et al. Apoptosis of endothelial cells triggers a caspase-dependent anti-apoptotic paracrine loop active on VSMC. FASEB J 2004; 18: 705-7.         [ Links ]

44. Laplante P, Raymond MA, Labelle A, Abe J, Iozzo RV, Hébert MJ. Perlecan proteolysis induces an alphalpha 2beta1 integrin- and Src family kinase-dependent anti-apoptotic pathway in fibroblasts in the absence of focal adhesion kinase activation. J Biol Chem 2006; 281: 30383-92.         [ Links ]

45. Piñeiro M, Alava N, González-Ramón J, Lasierra L, Larrad A, Piñeiro F, et al. ITIH4 serum concentration increases during acute phase processes in human patients and is upregulated by interleukin 6 in hepatocarcinoma HepG2 cells. Biochem Biophys Res Commun 1999; 263: 224-9.         [ Links ]

46. Nishimura H, Kakizaki I, Muta T, Sasaki N, Yamashita T, Nagasawa S, et al. cDNA and deduced amino acid sequence of human PK-120, a plasma kallikrein-sensitive glycoprotein. FEBS Lett 1995; 357: 207-11.         [ Links ]

47. Pu XP, Iwamoto A, Nishimura H, Nagasawa S. Purification and characterization of a novel substrate for plasma kallikrein (PK-120) in human plasma. Biochim Biophys Acta 1994; 1208: 338-43.         [ Links ]

48. Song J, Patel M, Rosenzweig CN, Goggins M, Chan DW, Zhang Z, et al. Quantification of fragments of human serum inter-a-trypsin inhibitor heavy chain 4 by a surface-enhanced laser desorption/ionization-based immunoassay. Clin Chem 2006; 52(6): 1045-53.         [ Links ]

49. Mohamed E, Abdul-Rahman PS, Doustjalali SR, Singh VA, Yip CH, Hashim OH, et al. Lectin-based electrophoretic analysis of the expression of the 35 kDa inter-Æ-trypsin inhibitor heavy chain H4 fragment in sera of patients with five different malignancies. Electrophoresis 2008; 29: 2645-50.         [ Links ]

50. Siti S, Abdullah-Soheimi, Boon-Kiong Lim, Onn H Hashim, Adawiyah S Shuib. Patients with ovarian carcinoma excrete different altered levels of urine CD59, kininogen-1 and fragments of inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 and albumin. Proteome Science 2010: 8:58.         [ Links ]

Aceptado para su publicación el 24 de febrero de 2012