BIOLOGÍA MOLECULAR

Premio Bienal FABA 2012

Meta-análisis: diagnóstico de tuberculosis resistente por técnicas no comerciales de amplificación*

Meta-analysis: drug-resistant tuberculosis diagnosis by non commercial amplification techniques

Meta-análise: diagnóstico de tuberculose resistente por técnicas não comerciais de amplificação

 

Belén Rocío Imperiale¹

¹Doctora de la Universidad de Buenos Aires. Área Farmacia y Bioquímica, Microbiología.

^*Lugar de trabajo: Hospital Dr. Antonio A. Cetrángolo (Laboratorio de Referencia del Programa de Control de la Tuberculosis de la Provincia de Buenos Aires). Italia 1750, Florida, Vicente López (CP: 1602). Argentina.

CORRESPONDENCIA DRA. BELÉN IMPERIALE Italia 1750 CP 1602 - FLORIDA, Vicente López, Argentina. E-mail: belen.imperiale@conicet.gov.ar belen_imperiale@yahoo.com.ar

 

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Resumen

La emergencia de tuberculosis (TB) multidrogo y extensivamente-resistente reactivó la necesidad de contar con métodos rápidos para detectar resistencia a isoniacida (INH) y rifampicina (RIF). Por tal motivo, los objetivos de este trabajo fueron evaluar, mediante meta-análisis, la exactitud global y la posible utilidad de métodos caseros basados en PCR para la detección rápida de resistencia a INH y RIF en aislamientos clínicos de Mycobacterium tuberculosis. La búsqueda bibliográfica incluyó Medline/PubMed, BioMedLib. Para estimar la variabilidad entre los resultados de los estudios y el grado de exactitud diagnóstica de los métodos utilizados se realizaron gráficos "forest plot" y curvas SROC (summary receiver operating characteristic) mediante el software Meta-DiSc. Fueron seleccionados 15 estudios, conteniendo 1311 aislamientos resistentes a INH y 953 a RIF. Para la detección de resistencia a INH la sensibilidad y especificidad globales fueron: 84,0% y 96,0% respectivamente, mientras que para la detección de resistencia a RIF esos valores fueron 92,0% y 97,0%. Además, estos métodos mostraron alta exactitud diagnóstica, con áreas bajo la curva SROC>0,9. La alta sensibilidad y especificidad obtenidas con métodos moleculares caseros sugieren que algunos de ellos podrían ser aplicados para el diagnóstico rápido de resistencia a partir del aislamiento de M. tuberculosis.

Palabras clave: Mycobacterium tuberculosis; Tuberculosis; Sensibilidad a drogas; Rifampicina; Isoniacida; Métodos moleculares; Reacción en cadena de la polimerasa; Métodos rápidos.

Summary

Due to the emergency of multidrug and extensively-drug resistant tuberculosis, molecular methods for a rapid detection of isoniazid (INH) and rifampicin (RIF) resistance are urgently needed. For that reason, the objectivesof this study were to asses through a meta-analysis the global accuracy and the utility of the home-made molecular methods based in PCR for INH and RIF resistance rapid detection from Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. The articles were searched using Medline/PubMed, BioMedLib. The variability among different studies results and the diagnostic accuracy of the used methods were estimated by forest plot and summary receiver operating characteristic (SROC) curves performed with software Meta-DiSc. Fifteen studies were chosed: 1311 containing INH resistant and 953 RIF resistant isolates. The pooled sensitivity and specificity for INH resistance detection was 84.0% and 96.0% respectively, while 92.0% and 97.0% were the pooled values for RIF resistance detection. Besides, these methods showed a high diagnostic accuracy, with the area under the SROC curve >0.9. Due to the high sensitivity and specificity obtained with the home-made molecular methods, some of these tests could be applied for a rapid detection of M. tuberculosis drug resistance in clinical practice.

Keywords: Mycobacterium tuberculosis; Tuberculosis; Drug susceptibility; Rifampicin; Isoniazid; Molecular methods; Polymerase chain reaction; Rapid methods.

Resumo

A emergência de tuberculose (TB) multidrogas e extensivamente-resistente reativou a necessidade de contar com métodos rápidos para detectar resistência à isoniazida (INH) e rifampicina (RIF). Por isso, o objetivo deste trabalho foi a avaliação através da meta-análise, da exatidão global e da possível utilidade de métodos caseiros baseados em PCR para detectar rapidamente a resistência a INH e RIF em isolamentos clínicos de Mycobacterium tuberculosis. A pesquisa bibliográfica incluiu Medline/PubMed, Bio MedLib. Para estimar a variabilidade entre os resultados dos estudos e o grau de exatidão diagnóstica dos métodos utilizados, foram realizados gráficos "forest plot" e curvas SROC (summary receiver operating characteristic) com o software Meta-Disc. Foram selecionados 15 estudos, contendo 1311 isolamentos resistentes a INH e 953 a RIF. Para a detecção de resistência a INH, a sensibilidade e especificidade globais foram 84,0% e 96,0% respectivamente, enquanto que para a detecção de resistência a RIF esses valores foram de 92,0% e 97,0%. Alem disso, os mesmos métodos mostraram elevada exatidão diagnóstica, com áreas inferiores à curva SROC>0,9. A elevada sensibilidade e especificidade obtida através de métodos moleculares caseiros sugere que alguns deles poderiam ser aplicados para o diagnóstico rápido de resistência a partir do isolamento de M. tuberculosis.

Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis; Tuberculose; Sensibilidade às drogas; Rifampicina; Isoniazida; Métodos moleculares; Reação em cadeia da polimerase; Métodos rápidos.

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Introducción

La tuberculosis (TB) y especialmente la TB multidrogo-resistente (TB MDR), causada por Mycobacterium tuberculosis simultáneamente resistentes a isoniacida (INH) y rifampicina (RIF) ⁽¹⁾⁽²⁾ y la TB extensivamente resistente (TB XDR), que además de ser MDR presenta resistencia agregada a amicacina, capreomicina o kanamicina más una fluoroquinolona, están propagándose mundialmente y convirtiéndose en problemas de salud muy serios ⁽¹⁾⁽²⁾. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que cada año ocurren aproximadamente 500.000 nuevos casos de TB MDR ⁽³⁾ de los cuales un 5-7% de los casos terminarán siendo XDR ⁽⁴⁾⁽⁵⁾. Estas cifras alarmantes llevan a la urgente necesidad de contar con métodos rápidos de detección de resistencia a los principales fármacos con actividad anti-tuberculosa (anti-TB) especialmente para ser aplicados en aquellos pacientes con un alto riesgo de tener TB MDR/XDR, como ocurre, por ejemplo, en casos de transmisión nosocomial de cepas resistentes, de co-infección con el VIH o en inmunosuprimidos en general ⁽⁶⁾.
La INH y RIF son las principales drogas anti-tuberculosas de primera línea que se usan en los regímenes estándares para el tratamiento de la TB ⁽⁷⁾. La resistencia a INH es generalmente adquirida en una primera instancia y es el primer paso para desarrollar TB MDR. En la mayoría de las regiones del mundo, la resistencia a RIF (RIF-R) es un excelente marcador de TB MDR, ya que más del 90,0% de las cepas de M. tuberculosis RIF-R también presentan INH-R (8)(9). Además, la INH también es la droga utilizada para la quimioprofilaxis en niños que son contactos de casos de TB sensibles ⁽¹⁰⁾.
Ha sido previamente descrito que la drogo-resistencia (DR) en M. tuberculosis es causada principalmente por mutaciones puntuales en ciertos genes ⁽¹¹⁾. La principal mutación asociada a INH-R es la del codón 315 del gen katG de M. tuberculosis, seguida por la mutación del sitio -15 del promotor del gen inhA ^(12-16). Según lo hallado internacionalmente, las mutaciones ocurridas dentro de la región de 81 pares de bases llamada "hot spot region" del gen rpoB de M. tuberculosis, principalmente en los codones 516, 526 y 531, son responsables de aproximadamente el 95-97% de la RIF-R ^(17-19).
Durante los últimos años, un gran número de estudios ha evaluado el uso de métodos basados en la amplificación de ácidos nucleicos (AAN) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección rápida de M. tuberculosis resistente a drogas, principalmente a INH y RIF. Estos estudios se han llevado a cabo en distintas zonas geográficas y han incluido los genes antes mencionados ^(15)(20-23). Estos métodos han surgido como alternativas prometedoras para el diagnóstico rápido de la enfermedad y su resistencia.
Los sistemas diagnósticos utilizando la AAN han sido separados en dos grupos: "comerciales" o "caseros" ^(24-28). Dentro de los métodos comerciales para la detección molecular de resistencia a RIF se encuentran el INNO-LiPA Rif.TB (Innogenetics, Bélgica) ^(8)(29)(30) utilizado mayormente en países de Europa y el GGenoType MTBDRplus (Hain Lifescience, GmbH, Alemania), que también detecta resistencia a INH, aprobado recientemente por el ANMAT y utilizado ampliamente a nivel mundial ^(31-33). Los métodos caseros son utilizados principalmente en países en vías de desarrollo, como es el caso de la Argentina donde las posibilidades de adquirir los equipos comerciales y mantener su provisión constante en el tiempo son escasas ^{(11) (15)(16)(19)(34-36)}. En general, los métodos caseros basados en AAN tienen una sensibilidad y especificidad más variable que las que se obtienen con los métodos comerciales ^(31)(37)(38).
Los estudios sistemáticos de revisión son importantes para resumir evidencia sobre la exactitud de las pruebas diagnósticas y, generalmente, preceden a su incorporación en la práctica clínica, proporcionando una visión global y sintética del rendimiento de estas pruebas y permitiendo la elección por parte del futuro usuario. Por lo expuesto, se puede decir que este artículo de revisión tiene como objetivos evaluar la exactitud global y la utilidad de los métodos moleculares no comerciales de AAN mediante PCR (MMNC-PCR) para la detección rápida de resistencia a INH y RIF en aislamientos clínicos de M. tuberculosis y examinar su utilidad como herramientas útiles destinadas a la detección preliminar de TB MDR principalmente en aquellos países con bajos a medianos ingresos, en los cuales ya han sido implementados.
En Argentina y en general en los países en vías de desarrollo, la detección de resistencia se basa principalmente en los métodos fenotípicos de pruebas de sensibilidad a drogas (PS). Estos métodos están basados en el desarrollo microbiano en medios de cultivo y demoran entre 15 a 42 días a partir de la obtención del primo-cultivo, ya que el tiempo de generación del M. tuberculosis oscila entre 18-24 horas (39)(40). Métodos rápidos para la detección de DR para evitar tratamientos anti-TB erróneos así como para prevenir la transmisión de formas resistentes de la enfermedad en la comunidad, son urgentemente necesarios.

Materiales y Métodos

MÉTODOS DE LOCALIZACIÓN
La fuente primaria de información para esta revisión fue seleccionada mediante búsquedas en distintas bases de datos, como ser Medline/PubMed (NCBI), BioMedLib. También se accedió a la bibliografía mediante la intranet de los proyectos de investigación financiados por la Comisión Europea "OLIGOCOLOR y FAST-XDR DETECT" (Proyecto N°: C. E. 516028 y C. E. 201690). En forma complementaria fue realizada una búsqueda en libros de resúmenes de Congresos y se revisó la bibliografía de los seleccionados, para localizar otras publicaciones de interés.
Las palabras claves utilizadas para la búsqueda fueron "Mycobacterium tuberculosis", "tuberculosis", "sensibilidad a drogas", "resistencia", "rifampicina", "isoniacida", "métodos", "moleculares", "métodos rápidos", "reacción en cadena de la polimerasa". La búsqueda incluyó artículos desde el año 1996 sin limitaciones geográficas. Se incluyeron manuscritos escritos en español e inglés. Fueron revisados todos los manuscritos sobre MMNC-PCR para la detección de resistencia a INH y/o RIF de M. tuberculosis.

SELECCIÓN DE LOS ESTUDIOS
Criterios de inclusión: fueron seleccionados artículos en los que los autores detectaron aislamientos clínicos de M. tuberculosis resistentes a INH y/o RIF mediante MMNC-PCR y compararon los resultados hallados con los obtenidos con un método de referencia (método de las proporciones, MGIT 960 SIRE, por ejemplo).
Criterios de exclusión: no fueron incluidos estudios basados en PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR). Además se excluyeron estudios donde el material de estudio no correspondió a aislamientos clínicos sino que se partió desde esputos con baciloscopía positiva.

ANÁLISIS DE LOS DATOS Y SÍNTESIS DE LOS RESULTADOS
Los datos más importantes correspondientes a cada uno de los artículos analizados fueron presentados en las Tabla I y II, conteniendo el número de aislamientos clínicos totales, números de aislamientos sensibles y resistentes a INH y RIF, MMNC-PCR utilizado para determinar DR, método fenotípico de referencia utilizado para la determinación de susceptibilidad a drogas de primera línea, valores de sensibilidad y especificidad hallados.

Tabla I. Características de los estudios para el análisis de los métodos de detección de resistencia a Isoniacida

N: número, S: sensible; R: resistente; INH: isoniacida; MDR: multidrogo-resistente; SE: sensibilidad, ES: especificidad; PCR: reacción en cadena de la polimerasa; MAS-PCR: PCR múltiple alelo específica; RFLP: polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción; EGA: electroforesis en gel de agarosa; RLBH: hibridación en línea reversa; MPLJ: método de las proporciones en Löwenstein-Jensen; M7H10: Middlebrook 7H10; MCA: método de concentración absoluta

Tabla II. Características de los estudios para el analisis de los métodos de detección de resistencia a Rifampicina

N: número, S: sensible; R: resistente; RIF: rifampicina; MDR: multidrogo-resistente; SE: sensibilidad, ES: especificidad; S/E: sin especificar; PCR: reacción en cadena de la polimerasa; MAS-PCR: PCR múltiple alelo específica; SSCP: single strand conformation polymorsphism; EGA: electroforesis en gel de agarosa; EGP: electroforesis en gel de poliacrilamida; RLBH: hibridación en línea reversa; MPLJ: método de las proporciones en Löwenstein-Jensen; M7H10: Middlebrook 7H10.

Un revisor inspeccionó el cumplimiento de los criterios de inclusión de los estudios seleccionados y comprobó la exactitud en los datos extraídos.
Para comenzar la realización del análisis global de los estudios incluidos en la revisión debe ser cuantificado el grado de heterogeneidad entre los resultados obtenidos con cada método utilizado en cada uno de los estudios que están siendo analizados. La variabilidad entre los resultados de los estudios puede ser debida a las diferencias reales de planteamiento y ejecución entre los estudios incluidos, o a otras causas. La heterogeneidad estadística trata de cuantificar la variabilidad del resultado medido en los diferentes estudios con respecto al resultado global promedio, y determinar si dicha variabilidad es superior a la que sería esperable por puro azar ⁽⁴¹⁾. Para evaluar el grado de variabilidad entre los resultados de los diferentes estudios se realizó un análisis estadístico de los datos mediante el software Meta-DiSc (versión 1.1.1, en español) y se estimó el grado de exactitud diagnóstica de los métodos utilizados en los distintos estudios ⁽⁴²⁾. Para el análisis de los resultados se recolectaron datos de sensibilidad y especificidad de cada uno de los estudios. La sensibilidad, definida como "verdaderos positivos" (VP) fue calculada como la proporción de aislamientos determinados como resistentes a INH y/o RIF por el método de referencia fenotípico que fue correctamente identificada como resistente a INH y/o RIF mediante el método de detección de DR basado en PCR. La especificidad, o "falsos positivos" (FP) fue definida como la proporción de aislamientos calificados como sensibles por el método fenotípico de referencia, correctamente identificados por el MMNC-PCR ^(42)(43).
El grado de variabilidad entre los estudios considerados se evaluó mediante la realización de gráficos de tipo "forest plot". Estos gráficos son utilizados para representar los resultados del meta-análisis, los cuales muestran el efecto estimado de cada estudio con el valor obtenido combinando los resultados de todas las investigaciones, acompañados por sus respectivos intervalos de confianza ^(41)(43). En este meta-análisis los gráficos forest plot fueron utilizados para la representación de la sensibilidad y la especificidad para la determinación de DR obtenida en cada uno de los estudios. Además, este tipo de gráfico permitió también obtener un valor de especificidad y sensibilidad global para todos los métodos moleculares incluidos en la revisión.
La exactitud y performance general de los MMNC-PCR fue evaluada mediante el método de la curva SROC (summary receiver operating characteristic). El método de SROC grafica sensibilidad versus 1-especificidad, indicando la relación entre los valores de sensibilidad y especificidad de cada uno de los estudios incluidos y mostrando el punto en que ambos valores son los mayores para cada estudio. El área bajo la curva representa un resumen general de la exactitud diagnóstica de los MMNC-PCR (42).

Resultados

SELECCIÓN DE LOS ESTUDIOS
Como consecuencia de la búsqueda bibliográfica realizada, fueron seleccionados 15 estudios relevantes que utilizaron un sistema basado en PCR para la detección rápida de DR. Diez de los artículos utilizaron métodos para detectar INH-R (uno de ellos utilizó dos métodos distintos) mientras que hubo 12 que detectaron resistencia a RIF en M. tuberculosis.

DESCRIPCIÓN DE LOS ESTUDIOS SELECCIONADOS
Todos los estudios incluidos en el meta-análisis probaron un método molecular, no comercial, de detección de resistencia a INH y/o RIF basado en PCR y a partir de aislamientos clínicos de M. tuberculosis. En las Tablas I y II se muestran las características de cada uno de los estudios. Los métodos de referencia utilizados para la determinación de resistencia a drogas fueron muy variados, siendo el más utilizado el de proporciones en Löwenstein-Jensen (MPLJ), pero los métodos BACTEC 460, MGIT 960 SIRE, método de concentración absoluta, y discos de agar fueron también utilizados. Todos estos métodos se encuentran aprobados y son recomendados por la OMS como pruebas fenotípicas de sensibilidad a drogas anti-TB de primera línea ^(39)(40)(44).
Los métodos moleculares analizados en este artículo fueron todos basados en PCR, tal como lo indican los criterios de inclusión. Algunos realizaron una PCR simple, de un único fragmente a la vez, y otros realizaron PCR múltiples alelo específicas (MAS-PCR) en las cuales se realizó la amplificación de varios fragmentos de genes simultáneamente y en las mismas condiciones de reacción (15)(16)(22)(28)(45). Luego de la PCR se utilizaron distintos sistemas de detección según el estudio, dentro de los cuales se pueden nombrar la electroforesis en gel de agarosa/poliacrilamida, hibridación en línea reversa, macro-arreglos, pirosecuenciación ^{(15)(18)(28) (34-36)(46)}.
El objetivo de los estudios seleccionados para la revisión fue coincidente en todos y consistió en describir, desarrollar y evaluar un MMNC-PCR para el diagnóstico rápido de TB DR y/o MDR.
El número total de aislamientos de M. tuberculosis estudiados fue de 3.917, siendo 1311 INH-R y 953 RIF-R, mientras que 596 aislamientos sensibles a la INH y 1057 aislamientos sensibles a RIF fueron también analizados.
Los estudios seleccionados incluyeron aislamientos provenientes de varios países representando América, Asia, África y Europa. Entre los países representados se encontraron Argentina, Vietnam, Suecia, Latvia, Filipinas, Finlandia, Rusia, Turquía, España, Tailandia, China y Holanda.
El tiempo de obtención de los resultados, o TAT por su sigla en inglés (turn around time), fluctuó entre 1 a 2 días (promedio: 1,3 días) según el estudio en cuestión.

ANÁLISIS SISTEMÁTICO O META-ANÁLISIS
Mediante el software Meta-DiSc (versión 1.1.1) se obtuvieron los gráficos "forest plot" (Figura 1.a y 1.b y 2.a y 2.b) para evaluar estadísticamente el grado de variabilidad existente entre cada uno de los estudios con respecto a la sensibilidad y especificidad de cada método empleado para la rápida detección de INH-R y de RIF-R. En este análisis, la sensibilidad fue definida como la proporción de aislamientos de M. tuberculosis clasificados como resistentes a INH o RIF según el método molecular empleado en comparación con el método fenotípico de referencia. La especificidad se refirió a la proporción de aislamientos determinados como sensibles por el método de estudio en comparación con el método fenotípico de referencia. Para los métodos de detección de resistencia a INH se puede ver que la sensibilidad varió entre 100,0%-63,8%, con una sensibilidad global del 84,0% y la especificidad entre 100,0%-74,0% entre todos los estudios incluidos, con una especificidad global del 96,0%; mientras que para los métodos de detección de resistencia a RIF la sensibilidad estuvo entre 100,0-80,0% con una sensibilidad global del 92,0% y la especificidad entre 100,0%-83,8% con una especificidad global del 97,0%.

Figura 1. Forest plot de sensibilidad y especificidad para los métodos de detección de resistencia a isoniacida

 

Figura 2. Forest plot de sensibilidad y especificidad para los métodos de detección de resistencia a Rifampicina

La Figura 1.a y 1.b muestra el valor de sensibilidad y especificidad globales obtenidas entre todos los estudios que incluyen métodos de detección de INH-R, mientras que la figura 2.a y 2.b muestra estos valores para los estudios que detectan RIF-R.
Observando ambas Figuras se puede ver claramente que todos los estudios muestran resultados homogéneos para sensibilidad y especificidad, excepto el de Nikolayevsky et al que muestra valores de especificidad para la detección de ambas drogas bastante más bajos en comparación con el resto de los estudios.
Por otra parte, la agrupación de los estudios analizados permitió establecer el rendimiento diagnóstico representado en un único número dado por el área bajo la curva SROC (Summary receiver operating characteristic) la cual resume los resultados de todos los estudios analizados. Las Figuras 3 y 4 muestran las curvas SROC para los métodos de detección de INH-R y RIF-R respectivamente. Como puede verse en dichas figuras, el área bajo la curva (AUC) resultó ser de 0,9915 y 0,9874 para las pruebas diagnósticas de resistencia a INH y RIF respectivamente, estos valores cercanos al 1 (>0,90) indican una alta exactitud diagnóstica de los MMNC-PCR, con respecto a los métodos fenotípicos de referencia, a excepción del estudio de Nikolayevsky et al que fue excluido automáticamente del cálculo por el método de la SROC. Los métodos de detección analizados mostraron un alto rendimiento diagnóstico; ya que las pruebas perfectas tendrían un valor de AUC cercano a 1. El valor dado por el índice Q* resume la performance de los métodos donde la sensibilidad y especificidad son iguales y también resultaron ser cercanos al 1 (0,9624 para INH y 0,9524 para RIF) ⁽⁴²⁾.

Figura 3. Curva SROC para los métodos de detección de resistencia a Isoniacida
SROC: Summary receiver operador curve para los métodos basados en PCR para la detección de reasistencia a isoniacida. Los puntos representan los distintos estudios analizados. AUC: área bajo la curva; SE(AUC): error estándar del AUC; Q*: punto en que la sensibilidad y especificidad son iguales, y es el punto de la curva más cercano al ideal extremo superior del plano ROC; SE(Q*): error estándar de Q*.

 

Figura 4. Curva SROC para los métodos de detección de resistencia a Rifampicina
SROC: Summary receiver operador curve para los métodos basados en PCR para la detección de resistencia a rifampicina. Los puntos representan los distintos estudios analizados. AUC: área bajo la curva; SE (AUC): error estándar del AUC; Q*: punto en que la sensibilidad y especificidad son iguales, y es el punto de la curva más cercano al ideal extremo superior del plano ROC; SE(Q*): error estándar de Q.

Discusión y Conclusiones

Debido al incremento de los casos de TB MDR y XDR es que surge la necesidad del desarrollo de herramientas que permitan el diagnóstico rápido y eficiente de TB DR en aquellos países donde el acceso a kits comerciales es muy dificultoso ⁽⁴⁷⁾. Además, el diagnóstico temprano de la TB como también de la TB MDR es un paso crítico en el manejo y control de la enfermedad. Los métodos moleculares basados en PCR aceleran el diagnóstico así como también la detección de la resistencia micobacteriana.
Esta revisión realizada sobre los métodos de diagnóstico de resistencia a INH y RIF basados en la amplificación de ADN mediante PCR demostró que éstos son, en general, altamente sensibles y específicos para la detección rápida (entre 1-2 días), a partir del aislamiento clínico, de la resistencia a las dos drogas de primera línea, INH y RIF, más importantes de los esquemas terapéuticos convencionales.
Efectuando comparaciones de resultados obtenidos con los MMNC-PCR entre ambas drogas, se puede ver que la sensibilidad global obtenida para INH con los MMNC-PCR, fue menor que la obtenida con los métodos que detectan resistencia a RIF. Estos resultados fueron esperables ya que como ha sido previamente mencionado en la introducción, la mayoría de las mutaciones causantes de resistencia a RIF ocurren en una región muy acotada del gen rpoB ^(17-19)(48). Mientras que en el caso de la INH, se considera que hay mecanismos de resistencia que todavía no han sido dilucidados. Dependiendo del área geográfica, alrededor de un 80-50% de los aislamientos clínicos INH-R presentan mutación en el codón 315 del gen katG ^(13)(14)(49), entre un 8%-30% de los aislamientos presentan mutaciones en la región -15 (C>T) del promotor del gen inhA ^(12)(49)(50), hasta 5% de los aislamientos INH-R tienen mutación en el marco abierto de lectura del gen inhA ^(49)(51), y en aproximadamente un 20-30% de aislamientos clínicos INH-R no es posible hallar la mutación causante de la resistencia mediante el estudio de estos dos genes (inhA y katG) ^(15)(49), que son los que contemplan los métodos caseros y comerciales moleculares de detección de INH-R como el GenoType MTBDRplus ^{(15)(28)(35)(52)}. Por este motivo es esperable obtener una sensibilidad global de alrededor del 80,0% para la detección de INH-R y que ésta a su vez sea menor que la obtenida para la detección de RIF-R.
Algunos estudios mostraron valores de sensibilidad sustancialmente menores a los de la sensibilidad global. En el caso en que la droga analizada fuera la INH, esto podría deberse a que en algunos de dichos estudios no hubiera sido incluido el promotor del gen inhA para que las mutaciones ocurridas en el mismo pudieran ser detectadas. Otra explicación posible sería la relacionada con el área geográfica y la frecuencia de aparición de mutaciones en otros genes no considerados por el sistema estudiado y que pudieran ser las responsables de causar la resistencia en esa área en particular. Esto es debido a que se postula que existirían otros mecanismos de resistencia a RIF y principalmente a INH que todavía no han sido dilucidados en su totalidad ^(51)(53-57).
Particularmente, los resultados publicados por Nikolayevsky et al mostraron llamativamente valores comparativamente más bajos de especificidad para INH (74,0%) y RIF (83,8%) que los valores medios obtenidos para todos los estudios, sin ser tampoco incluidos en los intervalos de confianza del 95% respectivamente (ver forest-plots). Las causas de valores de especificidad, sustancialmente menores que las medias correspondientes, son poco claras. Deberían revisarse los procedimientos técnicos en forma individual y comparativa para evaluar correctamente esos resultados. Cabe mencionar que, en todos los casos analizados estadísticamente, las diferencias entre sensibilidad o especificidad media, para INH y RIF, y los valores puntuales de especificidad obtenidos en el estudio de Nikolayevsky et al, arrojaron valores significativos (p<0,0001). Además, el desvío estándar para los valores de especificidad para RIF-R y para INH-R arrojó un valor de 4,85 y de 7,5 respectivamente. Estos valores descendieron a 2,2 y 1,0 al excluir el estudio con valores más bajos.
Teniendo en cuenta los blancos de detección de los métodos moleculares evaluados, se puede concluir que una ventaja de estos métodos es que además de la detección de la DR permitieron identificar al mismo tiempo al aislamiento como perteneciente al complejo M. tuberculosis, ya que en todos los casos, los fragmentos de genes amplificados son específicos de dicha especie micobacteriana.
Todos los estudios analizados concluyeron que los métodos utilizados pueden ser aplicados para el diagnóstico rápido de resistencia a INH y/o RIF a partir del aislamiento del M. tuberculosis. No todos los estudios analizados hicieron referencia a los costos estimados de los métodos utilizados para el diagnóstico de MDR, pero sí es claro que resultan mucho más accesibles que cualquier método comercial. Por otra parte, el ahorro del tiempo en el diagnóstico de la DR por parte de los métodos moleculares con respecto a los métodos fenotípicos hace que la relación costo beneficio también sea favorable para los nuevos métodos ⁽⁴⁰⁾.

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Nora Morcillo por la revisión del manuscrito. BI es Becaria Postdoctoral del CONICET.

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Aceptado para su publicación el 17 de diciembre de 2012