BIOQUÍMICA CLÍNICA

Especies reactivas de oxígeno y su efecto sobre la actividad de las células óseas*

Reactive oxygen species on bone cells activity

Espécies reativas de oxigênio e seu efeito na atividade das células ósseas

 

Clarisa Marotte¹, Susana Noemí Zeni²

¹ Dra. en Ciencias Biológicas.
² Dra en Ciencias Químicas.
* Laboratorio de Enfermedades Metabólicas Óseas. Hospital de Clínicas. Instituto de Inmunología, Genética y Metabolismo (INIGEM). CONICET-UBA. Buenos Aires, Argentina

CORRESPONDENCIA DRA. Susana N. Zeni Córdoba 2351-8vo. Piso (1120) Buenos Aires, Argentina Tel-FAX: 541159508972 E-mail: snzeni@hotmail.com

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Resumen

Las mitocondrias generan especies reactivas de oxígeno (ERO) que cumplen con una multiplicidad de procesos celulares; cuando se producen en exceso son responsables del estrés oxidativo y de múltiples procesos patológicos, incluyendo osteoporosis. Los factores de transcripción FoxO 1, 3 y 4 actúan como moléculas sensoras de ERO convirtiendo la señal de estrés oxidativo en la inducción de mecanismos de protección o señales apoptóticas. La insulina y los factores de crecimiento insulínicos (IGFs) regulan negativamente a FoxOs en mamíferos. Las ERO están involucradas en el remodelamiento óseo a través del efecto que ejercen sobre osteoblastos y osteoclastos. Los FoxOs controlan la acción de ERO sobre la osteoblastogénesis y la osteoclastogénesis. Con la edad, el aumento del estrés oxidativo acelera la adipogénesis a expensas de la osteoblastogénesis, al mismo tiempo que aumenta la oxidación de ácidos grasos generando compuestos pro-oxidantes que incrementan el estrés oxidativo. Asimismo, la caída estrogénica acelera la osteoclastogénesis por vía genómica o no genómica. Dada la importancia de FoxOs y ERO en la fisiología ósea y durante el envejecimiento, clarificar los eventos celulares y pasos moleculares involucrados en el control del estrés oxidativo sería vital para entender la regulación de la osteoporosis relacionada a la edad.

Palabras clave: Especies reactivas de oxígeno; Osteoblastos; Osteoclastos; Remodelamiento óseo; Factores de transcripción sensibles a reacciones redox; Estrés oxidativo; Osteoporosis.

Summary

Reactive oxygen species (ROS) are key players in oxidative stress, and they are generated as by-products of cellular metabolism, primarily in the mitochondria. ROS are well recognised for playing a dual role as both deleterious and beneficial species. FoxOs transcription factors are activated in oxidative stress responses and participate in the regulation of cellular functions, including cell cycle arrest, cell death, and protection from stress stimuli. FoxO activity is inhibited by growth factors and the insulin signaling pathways. They play a fundamental role in skeletal homeostasis by exerting both ROS céludependent and independent effects on bone cells. FoxOs modulate osteoblastogenesis and attenuate osteoclastogenesis through both cell autonomous and indirect mechanisms. With aging there is an inevitable increment in oxidative stress that accelerates adipogenesis at the expense of osteoblastogenesis. There is also an increment in lipid oxidation to form pro-oxidant products that enhance oxidative stress generation. In addition, the estrogen withdrawal accelerates osteoclastogenesis. Given the importance of both FoxOs and ROS in aging and bone biology, understanding the cellular events and molecular pathways that are controlled by FoxOs during aging may be vital to our understanding of the regulation of age-related osteoporosis.

Key words: Reactive oxygen species; Osteoblasts; Osteoclasts; Bone remodeling; Redox-sensitive transcription factors; Oxidative stress; Osteoporosis.

Resumo

Mitocôndrias geram espécies reativas de oxigênio (ERO) que cumprem uma grande variedade de processos celulares; se produzidas em excesso são responsáveis pelo estresse oxidativo e por múltiplos processos patológicos, incluindo a osteoporose. Os fatores de transcrição FoxO 1.3 e 4 funcionam como moléculas sensoras de ERO transformando o sinal de estresse oxidativo na indução de mecanismos de proteção ou sinais apoptóticos. A insulina e os fatores de crescimento insulínicos (IGFs) regulam em forma negativa Foxos em mamíferos. As ERO estão envolvidos na remodelação óssea através do seu efeito nos osteoblastos e osteoclastos. Os Foxos controlam a ação de ERO na osteoblastogênese e na osteoclastogênese. Com a idade, o aumento do estresse oxidativo acelera a adipogênese à custa de osteoblastogênese; ao mesmo tempo que aumentam a oxidação de ácidos graxos gerando compostos pró-oxidantes que incrementam o estresse oxidativo. Além disso, a queda estrogênica acelera a osteoclastogênese por via genômica ou não genômica. Devido à importância de FoxOs e ERO na fisiologia óssea e durante o envelhecimento, esclarecer os eventos celulares e passos moleculares envolvidos no controle do estresse oxidativo seria vital para a compreensão da regulação da osteoporose relacionada com a idade.

palavras chave: Espécies reativas de oxigênio; Osteoblastos; Osteoclastos; Remodelação óssea; Fatores de transcrição sensíveis a reações redox; Estresse oxidativo; Osteoporose.

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Introducción

Hacia finales del siglo XIX, Paul Bert demostró el fenómeno de la toxicidad del oxígeno en animales; sin embargo, se requirieron varias décadas para darle una explicación científica. En un principio, dicha toxicidad fue asociada a las altas tensiones de oxígeno; más adelante se demostró que aún bajo tensiones normales, al ser utilizado por las células se generan especies reactivas de oxígeno (ERO) intracelulares, responsables del efecto detrimental que ocurre en los sistemas biológicos. Este hallazgo llevó a la conclusión de que la formación de ERO es una consecuencia inevitable de la vida en un ambiente rico en oxígeno ^(1-3).
Durante la respiración oxidativa las mitocondrias de los organismos aeróbicos reducen univalentemente al oxígeno; en dicho proceso se generan ERO debido a una reducción incompleta ya que los electrones libres se unen al oxígeno molecular generando moléculas reactivas e inestables como ion superóxido (O₂ -.), peróxido de hidrógeno (H₂O₂) y radical hidroxilo (HO.) ^(4-6) (Fig. 1). El O₂ .- es considerado la fuente primaria de ERO pero reacciona con otras moléculas generando especies secundarias más agresivas y reactivas. El H₂O₂ debido a su mayor estabilidad y concentración molar intracelular es la ERO con mayor actividad oxidativa y, si bien no es un radical libre, puede difundir a otras localizaciones celulares dando lugar a HO., extendiendo así el daño oxidativo. Otras ERO de probable relevancia producida en menor medida por las mitocondrias son el radical perhidroxilo (HO₂ .), particularmente aquellos generados en la cercanía de las membranas, el óxido nítrico (NO) y el oxígeno singulete (1O2). Aunque la producción de NO mitocondrial es inferior a la de H₂O₂, ambas especies pueden reaccionar entre sí generando otras especies reactivas de nitrógeno más potentes, como el peroxinitrito (ONOO-), que también pueden modificar macromoléculas ⁽⁷⁾.

Figura 1. Transporte mitocondrial como generador de ERO.

Aproximadamente entre el 1% y 3% del oxígeno consumido por la mitocondria es convertido en ERO lo cual hace que dicha organela sea la responsable de generar el 90% de las ERO intracelulares ⁽⁸⁾. Sin embargo, existen otras fuentes endógenas de menor producción, entre las que se encuentran los peroxisomas, la activación de células fagocíticas y la acción de ciertos sistemas enzimáticos. Los peroxisomas contienen oxidasas que, como aquellas que participan en la â-oxidación peroxisomal de los ácidos grasos, tienen una gran capacidad para generar H₂O₂. En el sistema inmunológico, y en especial en la activación de las células fagocíticas, la actividad de NADPH oxidasa unida a membranas genera una importante cantidad de H₂O₂. La enzima presente en las células no fagocíticas es de naturaleza estructural y genéticamente diferente, por lo cual apenas genera el 1% de lo que se produce en las células fagocíticas ^{(1) (9-10)}. Ciertas enzimas como la xantin oxidasa, el sistema de detoxificación hepática del citocromo P450, la acil CoA oxidasa, las NADPH/NADH oxidasas y la acil CoA oxidasa son también fuentes endógenas de producción de O₂ . y de H₂O₂. Las ERO, además, pueden ser generadas en respuesta a estímulos externos, como: citoquinas proinflamatorias, factores de crecimiento, toxinas ambientales, luz UV, radiaciones ionizantes, entre otros ⁽²⁾.
Si bien cuando se producen en forma excesiva las ERO inducen estrés oxidativo y con ello efectos detrimentales ⁽⁵⁾, a bajas concentraciones son beneficiosas para los seres vivos, ya que participan en diversos aspectos de señalización y regulación intracelular ⁽¹¹⁾. En este sentido, las ERO pueden regular importantes procesos fisiológicos dependiendo del tipo de célula, del oxidante que las genere, de su intensidad y del tiempo de desequilibrio redox. Las ERO modulan diversas vías de señalización influenciando la síntesis de enzimas antioxidantes, los procesos de reparación, la inflamación y las transformaciones oncogénicas. En este último caso, actuando sobre distintos estadios del ciclo celular, controlan la migración, la proliferación, la sobrevida y la apoptosis.

Mecanismos de defensa frente a la producción exagerada de ERO

La exposición a una producción continua de ERO conduciría a una alteración en la homeostasis de óxidoreducción intracelular que desencadenaría estrés oxidativo; por ello, las células desarrollan una batería de mecanismos de defensa adaptativos de prevención, reparación y antioxidantes ⁽¹⁰⁾. Los mecanismos de defensa antioxidante pueden ser de naturaleza enzimática y no enzimática. Los enzimáticos incluyen a la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y la glutatión peroxidasa (GPx) cuya síntesis puede modificarse por ejercicio, dieta y edad ⁽²⁾. La SOD elimina el O₂ convirtiéndolo en oxígeno y H₂O₂. Existen diferentes formas de la enzima; aquella que contiene manganeso (Mn) se encuentra en la matriz mitocondrial y es esencial para la vida. Por sí sola la SOD no es un antioxidante porque produce H₂O₂; la CAT descompone dicha molécula con alta velocidad y la GPx, conteniendo o no selenio (Se) en su constitución, es complementaria de la CAT, ya que descompone al H₂O₂ con baja intensidad pero con alta afinidad. Estas enzimas utilizan al glutatión (GSH), antioxidante no enzimático, como agente reductor generando GSH oxidado (GSSG) que es altamente tóxico para la célula. La glutatión reductasa (GSR), otra enzima antioxidante, lo regenera nuevamente a expensas de NADPH ⁽¹²⁾. En células y tejidos se encuentran presentes otros antioxidantes no enzimáticos, además del GSH: ubiquinonas (coenzima Q), bilirrubina, albúmina, ferritina, ceruloplasmina y ácido úrico. Dentro de los antioxidantes no enzimáticos que se incorporan en el humano por la dieta se pueden mencionar al b-caroteno o provitamina A; a las vitaminas C (ácido ascórbico) y E (a-tocoferol); a los polifenoles antioxidantes presentes en frutas y verduras (flavonoides, ácidos fenólicos y taninos) que colaboran en la prevención eliminando radicales libres, y ciertos micronutrientes minerales que actúan como cofactores enzimáticos (Cu, Se, Mg, Zn).
La presencia de toda esta multiplicidad de antioxidantes tisulares de fuentes tanto endógenas como exógenas ayuda a controlar el estrés oxidativo in vivo. Sin embargo, dichas defensas no presentan un 100% de eficiencia, lo que se traduce en la producción de cierto nivel de daño oxidativo, aún en ausencia de patologías. Dichos daños aumentan con la edad y afectan a lípidos, proteínas y ADN. El aumento del daño oxidativo en las proteínas se ha demostrado por la presencia de compuestos de tipo carbonílicos o de productos de entrecruzamiento como ditirosina. Respecto de los lípidos, las membranas biológicas son ricas en ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), vulnerables a la peroxidación lipídica por acción de radicales libres. Los peróxidos cíclicos y radicales hidroperóxidos (HOO·) producidos dan lugar a una reacción de propagación en cadena que se amplifica por la presencia en el plasma de metales de transición. Las ERO pueden atacar directamente al ADN a nivel de sus bases o del azúcar-fosfato modificando la estructura de las purinas y pirimidinas ⁽¹¹⁾. Todos estos procesos están limitados debido a la presencia de sistemas de reparación del daño oxidativo, si bien debe tenerse en cuenta que la continua generación de moléculas modificadas puede dar lugar a consecuencias negativas e irreparables a lo largo de la vida. A modo de ejemplo, el daño en las proteínas puede repararse por recambio celular utilizando la codificación contenida en el ADN; sin embargo, las mutaciones que en él ocurran pueden impedir la recuperación de la información transmitida por la replicación del ADN mitocondrial (mtADN) para transformarse en una proteína determinada. La acumulación de mutaciones en el mtADN que ocurre con el tiempo sería la principal causa de los cambios observados durante el envejecimiento.
El envejecimiento ha sido definido como el resultado de la acumulación progresiva de efectos deletéreos que reducen la habilidad del organismo para resistir situaciones de estrés y que disminuyen la posibilidad de sobrevida ⁽¹³⁾. En 1956 Harman D ⁽¹⁴⁾ propuso su teoría acerca del envejecimiento según la cual las ERO, que se generan endógenamente durante la respiración tisular, serían las responsables de dicho proceso. Asimismo, las ERO también estarían involucradas en varios desórdenes degenerativos asociados a la edad tales como ciertas enfermedades neurodegenerativas (ej. Parkinson y Alzheimer), aterosclerosis, cáncer, diabetes, osteoporosis ^{(9) (15)}. Como en ausencia de patologías la mitocondria es la principal fuente de ERO, dicha teoría es conocida como "teoría del envejecimiento de los radicales libres mitocondriales" ⁽¹⁴⁾.

Mecanismos de defensa frente al estrés oxidativo

En el sitio donde las ERO son generadas existen moléculas sensoras que convierten la señal de estrés oxidativo en la inducción de mecanismos de protección o señales apoptóticas. Dichos sensores son activados por O₂ o H₂O₂, los cuales regulan a diversas enzimas que contienen hierro (Fe) y grupos sulfhidrílicos (-SH) en sus centros activos. Los grupos -SH de los residuos de cisteína (Cis) de los centros activos de diversas fosfatasas, quinasas y factores de transcripción son directamente oxidados en forma reversible por el H₂O₂ ⁽⁵⁾.
Los FoxOs, factores de transcripción sensibles a reacciones redox, constituyen una de las moléculas sensoras de daño oxidativo. Los FoxOs pertenecen a una gran familia de proteínas que se caracteriza por la presencia de dominios llamados forkhead box de unión al ADN mediante los cuales inician la transcripción de una gran cantidad de genes. En mamíferos existen cuatro miembros de la familia FoxO: 1, 3 y 4, ampliamente distribuidos y con un patrón de expresión superpuesto tanto en tejidos en desarrollo como en tejidos adultos y FoxO6, restringido a estructuras específicas del cerebro en desarrollo ^(16)(17). Estos factores, a través de la activación de moléculas de señalización como la proteína p66sch, convierten el estímulo de estrés oxidativo en programas dinámicos de expresión génica de varios procesos fisiológicos y patológicos ⁽¹⁷⁾.
Los FoxOs, como un mecanismo celular de defensa preventivo frente a procesos oxidativos, presentan la habilidad de regular positivamente la actividad de SOD y CAT pero también la de genes como Gadd45 involucrados en la reparación del ADN ⁽¹⁸⁾. Los FoxOs se ubican en el núcleo o citoplasma celular, dependiendo de fosforilaciones activantes o inhibitorias en diferentes sitios específicos de la molécula llevadas a cabo por una multitud de quinasas ⁽⁵⁾. La actividad de dichas quinasas se encuentra regulada por las ERO, el receptor de insulina (RIns) y la vía de las proteínas wingless (Wnt). Otras modificaciones postraduccionales que modifican la localización celular de FoxOs son la acetilación y la ubiquitinación ^(19-21) (Fig. 3).

Figura 3. Activación de FoxOs.

Regulación de la actividad de FoxOs

La insulina y los factores de crecimiento insulínicos (IGFs) regulan negativamente a FoxO 1, 3 y 4 de mamíferos. La unión de dichos factores a su receptor activa, a través del factor de transcripción DAF 16, a diversas enzimas incluyendo a la de la vía fosfatidil-inositol-3-quinasa y serina/treonina Akt quinasa (PI-3K/Akt), y a la quinasa inducible por glucocorticoides séricos (SGK) ⁽²⁰⁾. La fosforilación de FoxOs por dichas quinasas favorece su retención en el citoplasma donde es captado y degradado por el proteosoma; por ej.: Akt fosforila directamente a FoxOs en tres residuos diferentes que evitan su unión al ADN por lo cual se produce la salida hacia el citoplasma ^{(2) (22-26)}. La activación por factores externos de las ERK-quinasas induce la fosforilación de FoxOs en múltiples residuos lo que lleva a la ubiquitinación del factor y su degradación proteosomal. Otros reguladores negativos de la actividad de FoxOs son la quinasa inhibidora del factor nuclear-kB (IIkB) y Pin1 ⁽²⁷⁾ (Fig. 2).

Figura 2. Degradación de FoxOs.

Por otra parte, niveles bajos de ERO y varios estímulos pro-apoptóticos rápidamente generan mecanismos de supervivencia favoreciendo la traslocación de FoxOs al núcleo y con ello la transcripción de diversos genes ⁽²⁸⁾. La retención nuclear de FoxOs ocurre mediante fosforilaciones, monoubiquitinaciones, acetilaciones/ desacetilaciones o la oxidación de la Cis ⁽¹⁹⁾. Las fosforilaciones son inducidas por la actividad de la c-Jun-Nterminal- quinasa-(JNK) o por la quinasa Mst1. La JNK es el mayor inductor de la actividad transcripcional de ERO ya que, además, fosforila al receptor de insulina y con ello suprime el efecto inhibitorio de insulina/ factores de crecimiento fibroblásticos (FGFs) evitando la acción negativa de Atk sobre los FoxOs ⁽²⁹⁾. En el proceso de acetilación/desacetilación participa la acetiltransferasa de las proteínas de unión de CREB y la deacetilasa Sirt1 dependiente de NAD ⁽¹⁹⁾ (Fig. 3).
En respuesta a la exagerada producción de ERO, la actividad transcripcional de FoxOs puede controlar la expresión de genes involucrados en la resistencia al estrés oxidativo (MnSOD), en la reparación del DNA (Gadd45), en modificaciones del ciclo celular (ciclinas D1 y D2), en el arresto celular (p27kip1), y en la apoptosis (ligandos Bim y Fas) ^{(5) (17) (20) (27)(28) (30)(31)} (Fig. 3).
La presencia de FoxOs en el núcleo permite, además, la interacción con otros factores de transcripción como la b-catenina, el receptor ã activado por el proliferador del peroxisoma (PPAR) g, el receptor estrogénico (RE) a o el receptor androgénico (AR) ⁽³²⁾. Al unirse a b-catenina modifica la formación ósea; al unirse a PPARg, los FoxOs inhiben la adipogénesis en el estadio de preadipocitos ⁽³³⁾. La asociación directa entre AR y FoxOs bloquea la unión de FoxOs al ADN limitando su actividad y, recíprocamente, FoxOs suprimen la acción androgénica ⁽³²⁾. FoxOs también interaccionan con REa y en forma similar a AR, dicha unión reprime la función transcripcional de FoxOs ⁽³³⁾ (Fig. 3).

Efecto del estrés oxidativo sobre el remodelamiento óseo

El hueso es un tejido que se renueva continuamente a través del mecanismo denominado remodelamiento óseo. Dicho mecanismo está formado por dos procesos, la resorción de hueso viejo que es llevada a cabo por osteoclastos y la formación de hueso nuevo que es llevada a cabo por osteoblastos. El inicio del remodelamiento se produce por acción de aquellos osteoblastos que quedaron inmersos en la matriz que ellos mismos sintetizaron, denominados osteocitos y, para que se lleve a cabo, osteoclastos y osteoblastos deben encontrarse interconectados en espacio y tiempo.
Si bien el remodelamiento se inicia por la acción resortiva ejercida por los osteoclastos, la actividad de dichas células se encuentra regulada por factores secretados por los osteoblastos (Fig. 5) ⁽³⁴⁾. Uno de dichos factores es el ligando del receptor activador NF-kB (RANKL) que al liberarse se une a su receptor específico RANK, presente en la membrana de progenitores osteoclásticos, e induce el reclutamiento, la diferenciación y la actividad de dichas células favoreciendo el proceso de resorción. En forma inversa, la osteoprotegerina (OPG), también liberada por el osteoblasto, se interpone en la unión de RANKL-RANK y reduce la diferenciación y actividad a la vez que aumenta la apoptosis del osteoclasto (Fig. 4).

Figura 4. Citoquinas involucradas en la actividad de las células óseas.

Figura 5. Efecto de las ERO y FoxOs sobre osteoblastos.

Los osteoclastos también liberan factores que regulan la proliferación, diferenciación y actividad del osteoblasto. Las Wnt son una gran familia de glucoproteínas secretadas por el osteoclasto que se unen a su receptor frizzled (fz) y a los correceptores constituidos por las proteínas relacionadas al receptor de lipoproteína de baja densidad 5 o 6 (LRP5 o 6), presentes en la membrana del osteoblasto, favoreciendo su proliferación, diferenciación y actividad y, en consecuencia, la formación ósea ^(35-39) (Fig. 4).
El estrés oxidativo está involucrado en los procesos de formación y resorción a través del efecto que ejercen las ERO sobre los osteoblastos y osteoclastos ⁽⁴⁰⁾. En este sentido, las ERO activan distintas vías y desarrollan un amplio espectro de respuestas que, dependiendo del tipo de célula ósea, puede desencadenar su proliferación y crecimiento, el arresto de su ciclo celular y por lo tanto su diferenciación, o su apoptosis ⁽⁴¹⁾.
El rol que ejercen FoxO1, 3 y 4 sobre el metabolismo esquelético ha sido recientemente revelado gracias al uso de ratones transgénicos. La acción de los FoxOs en la homeostasis esquelética es indispensable ya que ratones carentes del gen que codifica para FoxO 1, 3 y 4 evidencian un aumento del estrés oxidativo y apoptosis de osteoblastos ⁽⁴²⁾. Por otra parte, existen evidencias de que los FoxOs suprimen la proliferación y sobrevida de células endoteliales por lo cual restringen la angiogénesis, y con ello la llegada de progenitores celulares al sitio de remodelamiento óseo. Estos mecanismos estarían implicados en la supresión que se produce en la formación ósea por efecto del envejecimiento o por el exceso de glucocorticoides, ya que ambas situaciones aumentan la actividad de FoxOs ⁽¹⁷⁾. Se ha demostrado que los FoxOs ejercen funciones redundantes ya que se unen a una misma se cuencia en el ADN, regulan genes comunes y se comportan bioquímicamente en forma similar ⁽⁴³⁾. FoxO1 es indispensable durante el desarrollo ya que ratones carentes del gen que codifica para FoxO1 (knock-out) mueren durante la embriogénesis por un defecto en la angiogénesis ⁽⁴⁴⁾. FoxO3 es esencial para mantener el pool de células hematopoyéticas y al igual que FoxO1, participa en el metabolismo de la glucosa ^{(17) (45)}.
La expresión de FoxO1, 3 y 4 en hueso y células óseas ejerce efectos autónomos sobre osteoblastos y osteoclastos que incluyen la activación de los mecanismos de defensa de ambas células o la modulación en la actividad de la señal Wnt/b-catenina en el osteoblasto o RANK/ RANKL/OPG/NF-kB en el osteoclasto ⁽⁴⁶⁾.

Efecto de FoxO sobre osteoblastos

En respuesta a las ERO todas las células osteogénicas, a través de FoxOs, pueden regular la actividad de enzimas antioxidantes y activar genes como Gadd45 para reparar ADN y así protegerse del estrés oxidativo; sin embargo, la acción de las ERO dependerá del tipo de célula y del estadio de diferenciación celular. En base a ello se diferencia la acción que ejercen las ERO sobre osteoblastos maduros de aquella que ocurre sobre progenitores osteoblásticos y sobre precursores mesenquimales.

Osteoblastos maduros

Las ERO generadas dentro de las mitocondrias activan quinasas que fosforilan a la proteína de señalización p66shc. Esta proteína fosforilada convierte la señal oxidativa en apoptosis regulando factores proapoptóticos como Bcl2 y ligando de Fas pero, a su vez, presenta capacidad para generar ERO en la mitocondria y con ello amplificar la producción de H₂O₂ ⁽⁴⁷⁾. Mediante este mecanismo se incrementa el estrés oxidativo y se induce la apoptosis de varios tipos celulares incluyendo a los osteoblastos maduros. FOxO3 reduce el estrés oxidativo y promueve la sobrevida del osteoblasto ya que, bajo el promotor de osteocalcina, disminuye la fosforilación de p⁶⁶shc, lo que aumenta el número y disminuye la apoptosis de osteoblastos y osteocitos. FoxO1 ejerce el mismo efecto que FoxO3 a excepción de que no afecta la apoptosis del osteoblasto ⁽⁴⁸⁾. La acción que ejercen los FoxOs sobre osteoblastos maduros sugiere que estos mediadores son críticos para la defensa oxidante, contribuyendo a la homeostasis esquelética. Por ello, la edad y la deficiencia estrogénica conducen a un incremento del daño oxidativo aumentando la apoptosis osteoblástica y osteocítica. El factor de transcripción activante 4 (ATF4) cumple dos funciones importantes en osteoblastos maduros. Por un lado regula la expresión de osteocalcina y de RANKL y, por el otro, promueve la captación de aminoácidos asegurando el proceso de síntesis proteica en el osteoblasto. FoxO1 se une a AFT4, hecho que potencia ambas actividades transcripcionales favoreciendo la síntesis de glutatión y colágeno tipo I; al mismo tiempo, FoxO1 se une al promotor de osteocalcina, lo cual disminuye su producción y con ello la fosforilación de p⁶⁶shc ⁽⁴⁹⁾. Este mecanismo es además importante porque se ha determinado recientemente que el osteoblasto actuando como "célula endócrina" controla el metabolismo de la glucosa y el energético a través de la secreción de osteocalcina (Fig. 5).  La osteocalcina es una pequeña proteína sintetizada exclusivamente por el osteoblasto en forma vitamina K dependiente. Esa proteína contiene tres residuos de ácido glutámico, los cuales se carboxilan por acción de la vitamina D; la osteocalcina carboxilada se libera a circulación y rápidamente es captada por el Ca de la hidroxiapatita permaneciendo depositada en hueso ⁽³⁴⁾. Hasta hace unos años no se conocía exactamente cuál era la función de dicha proteína; en la actualidad se ha demostrado que la osteocalcina se decarboxila durante el proceso de resorción gracias a la disminución marcada del pH que genera el osteoclasto en la laguna de resorción. La osteocalcina no carboxilada es una hormona que, actuando sobre el páncreas, promueve la proliferación de las células b, la secreción y la sensibilidad a la insulina, y el gasto energético ⁽⁵⁰⁾. La bioactividad de la osteocalcina está regulada negativamente por la proteína tirosina fosfatasa (OST-PTP), producto del gen Esp, que se expresa en osteoblastos. El osteoblasto contiene un RIns del tipo quinasa. La OSTPTP inactiva al RIns por desfosforilación; este mecanismo desencadena señales intracelulares que estimulan la síntesis de OPG y reducen la de RANKL y con ello la actividad resortiva. FoxO1 incrementa la producción del gen Esp y con ello disminuye la bioactividad de la osteocalcina induciendo una disminución en la proliferación de las células b del páncreas y en la secreción y sensibilidad a la insulina ⁽⁴⁹⁾. Inversamente, la insulina actuando sobre su receptor activa la señal PI3/AKT con lo cual se fosforila y degrada FoxO1 promoviendo la bioactividad de osteocalcina y controlando la homeostasis de la glucosa ⁽⁵¹⁾. La presencia de FoxO1 en las células pancréaticas regula el metabolismo de los lípidos y de la glucosa. En respuesta al estrés oxidativo producto de hiperglucemia, el FoxO1 presente en las células b del páncreas activa la expresión de genes que la protegen de dicha situación, preservando la secreción de insulina y promoviendo la sobrevida celular ^(52-53). En osteoblastos maduros la proteína Sirt1 presenta una acción similar a FoxOs induciendo efectos positivos sobre la masa ósea ⁽⁵⁴⁾. Un aumento de ERO induce un incremento en Sirt1 debido a una elevada concentración de NAD+ con lo cual se estimula la defensa antioxidante aumentando la producción de MnSOD y CAT ⁽⁵²⁾.

Progenitores osteoblásticos

La â-catenina es un coativador transcripcional que presenta un rol fundamental en la diferenciación de progenitores pluripotenciales mesenquimáticos (células madre mesenquimáticas o MSCs) hacia el linaje osteoblástico ^(55)(56). En este sentido, cabe recordar que las MSCs que se localizan en médula ósea, músculo y grasa, de acuerdo a la activación de distintos factores de transcripción, pueden diferenciarse hacia una variedad de tejidos incluyendo hueso, cartílago, músculo y grasa.
La vía canónica de señalización Wnt/â-catenina es un determinante crítico de la masa ósea, ya que aumenta el número y previene la apoptosis de progenitores osteoblásticos ^{(3) (57)}. La unión de Wnt/fz/LRP5 o 6 inactiva a la glucógeno sintetasa-quinasa 3â (GSK-3â) evitando la degradación proteasomal de â-catenina, que se acumula en el citoplasma y puede traslocarse al núcleo. A nivel nuclear se asocia a la familia de factores de transcripción de células T/potenciador de unión linfoide (TCF/LE) regulando la expresión de varios genes implicados en la diferenciación celular ^(58-60) (Fig. 5). Al mismo tiempo que estimula la producción de varios marcadores osteoblásticos como Runx2 (core-binding factor 1: Cbfa1), osterix, colágeno tipo I, fosfatasa alcalina óseo-específica (FAO) y unidades de formación de colonias osteoprogenitoras (CFU-O), suprime la actividad de PPARã y con ello la diferenciación de preadipocitos (17). Por otra parte, la activación de â-catenina en osteoblastos estimula la producción de OPG, potente inhibidor de la diferenciación osteoclástica, con lo cual se induce la disminución de la osteoclastogénesis y de la resorción ósea ^(61)(62). Por lo tanto, la vía Wnt/â- catenina aumenta la masa ósea estimulando la osteoblastogénesis y suprimiendo la apoptosis osteoblástica pero también reduciendo la adipogénesis y la osteoclastogénesis ^{(3) (63)(64)}.
La señal Wnt/â-catenina participa también del mecanismo por el cual la parathormona (PTH) regula la actividad osteoblástica. La unión de PTH a su receptor PTH1R induce la asociación entre el correceptor LRP6 y el PTHR1, mecanismo por el cual se estabiliza la â-catenina y, consecuentemente, permite su transcripción que, mediante su unión a TCF/LE, favorece la osteoblastogénesis y el incremento en la formación ósea ⁽¹¹⁾.
Se conocen varios antagonistas de la vía canónica de señalización Wnt. Los factores solubles Dickkopfs (Dkks) liberados por osteoclastos y la esclerostina (Sost) secretada por los osteocitos se unen a los receptores de Wnt o se interponen entre ellos activando la fosforilación de la â-catenina y su degradación proteosomal ^{(3) (11) (65-67)}.
Las ERO intracelulares regulan negativamente la vía de las Wnt. En varias células, incluidos los osteoblastos, el H₂O₂ promueve la transcripción de FoxO, favoreciendo su asociación con â-catenina en el núcleo. Este mecanismo, debido a una competencia entre FoxOs y TCF por un pool limitado de â-catenina, compromete la transcripción mediada por â-catenina/ TCF y con ello la diferenciación osteoblástica ⁽⁶⁸⁾. Se sugiere que dicha interacción evitaría la proliferación osteoblástica en condiciones patológicas de estrés oxidativo y explicaría cómo durante el envejecimiento el aumento del estrés oxidativo lleva a un déficit en el número de osteoblastos. Por otra parte, la activación de FoxOs también permite evitar indirectamente la osteoblastogénesis activando genes implicados en la producción de inhibidores de la señal Wnt como son los factores de transcripción solubles de receptor frizzled 1 y 2 (FRP1, y sFRP2) ⁽⁶⁹⁾.
Por otra parte, un efecto importante que resulta de la interacción â-catenina/TCF es la supresión de la actividad de PPARã; cuando los ERO interfieren en dicha interacción, no sólo inducen una disminución en la expresión de los distintos marcadores de linaje osteoblástico sino que, además, incrementan los niveles PPARã. El resultado final es una disminución en la diferenciación osteoblástica, un incremento en la apoptosis de osteoblastos y un aumento de la lipogénesis.

Efecto sobre células mesenquimales y osteogénesis

Los precursores osteoblásticos tempranos también están sometidos a la acción de las ERO. El efecto de los mismos sobre la proliferación osteoblástica estaría dado por su habilidad para activar una cascada de señales a través del factor proteico p53, el cual se encuentra específicamente ligado al arresto del ciclo celular ⁽⁷⁰⁾. FoxO1, mediante su unión a AFT4, reprime la señalización por p53 y con ello mantiene la proliferación normal y la homeostasis ósea asegurando el aporte de aminoácidos y la síntesis proteica. Por otra parte, a diferencia de lo que ocurre en osteoblastos maduros, FoxO1 aumenta la producción de osteocalcina y FAO; este efecto es mediado por la inducción cooperativa de genes implicados en la diferenciación osteoblástica que surge de la unión de FoxO1 a Runx2 ⁽⁴⁹⁾. Por otra parte, al inhibir la actividad del promotor de PPARã, los FoxOs antagonizan la transcripción de dicho factor en preadipocitos, lo que favorece la adipogénesis a expensas de la osteogénesis ⁽⁷¹⁾. Por ello, los FoxOs controlan la generación de nuevos osteoblastos a partir de MSCs modulando tanto la proliferación y/o diferenciación a través de sus propiedades antioxidantes como la actividad de otros factores transcripcionales como bcatenina y PPARã.

Efecto sobre los osteoclastos

Los osteoclastos activos son células móviles multinucleares que presentan alta demanda energética y contienen una gran cantidad de mitocondrias. A través de la generación de H₂O₂, estas organelas juegan un rol importante en la proliferación, diferenciación y función del osteoclasto. Las ERO aumentan el número y la actividad de los osteoclastos aumentando la producción del factor de necrosis tumoral a (TNFa), citoquina proinflamatoria que no sólo causa daño celular sino que también inhibe a la SOD y con ello disminuye las defensas antioxidantes; asimismo, TNFa actuando sobre receptores presentes en la membrana del osteoblasto estimula la producción de RANKL y con ello la resorción ósea ^(17)(72). La unión de RANKL a RANK desencadena múltiples señales intracelulares mediante la unión a receptores de factores asociados a TNF (TRAFs). La asociación con TRAF2 activa a las JNK necesarias para la activación de pasos intracelulares que llevan a la formación del anillo de actina; la unión con TRAF6 activa al factor de transcripción NF-kB, lo que aumenta la actividad resortiva de los osteoclastos maduros al favorecer su reclutamiento, diferenciación, actividad y sobrevida ⁽⁷³⁾. Por otra parte, en forma de retroalimentación positiva el RANKL, a través de la vía TRAF6/Rac1/ oxidasa Nox1-NADPH asociada a membrana plasmática, estimula la producción extra-mitocondrial de ERO ⁽⁷⁴⁾. En osteoclastos, RANKL aumenta la expresión de GPx en los macrófagos de la medula ósea, mientras que los estrógenos lo hacen en osteoclastos maduros (Fig. 6).

Figura 6. Efecto de las ERO y FoxOs sobre osteoclastos.

Estrés oxidativo y osteoporosis

La caída estrogénica que se produce en la mujer postmenopáusica o en la rata ovariectomizada reduce la masa ósea debido a un aumento en la velocidad de remodelamiento óseo favoreciendo el proceso de la osteoclastogénesis en forma conjunta con una disminución en la sobrevida de los osteoblastos ⁽⁷⁵⁾. El efecto antiosteoporótico que ejercen los estrógenos se debe, al menos en parte, a su habilidad para proteger al hueso frente al estrés oxidativo, tanto en forma genómica como no genómica. Mediante la interacción entre el REa y el ADN, los estrógenos aumentan la actividad de receptor estrogénico (RE) y disminuyen la fosforilación de p66shc, con lo cual la generación de ERO disminuye. El efecto de los estrógenos sobre el estrés oxidativo no genómico es producido por la activación de ERK citoplasmáticas ⁽⁷⁶⁾.
Los estrógenos disminuyen la tasa de remodelamiento y mantienen un equilibrio entre los procesos de formación y resorción. Por un lado, controlan la formación ósea modificando la vía de la proteína morfogenética 2 (BMP-2), vía adicional a la de las Wnt en el proceso de diferenciación osteoblástica. Los estrógenos activan a las ERKs que al fosforilar a Smad 1 favorecen su degradación proteosomal y con ello la transcripción de la BMP-2 se atenúa. Como BMP-2 potencia el efecto de RANKL, esta atenuación disminuye la formación y sobrevida del osteoclasto. Los estrógenos, además, al inhibir la fosforilación de p66shc reducen la activación del factor de transcripción NF-kB y, en consecuencia, la producción de interleuquina 6 (IL-6) y de TNFa, dos citoquinas proinflamatorias que estimulan la osteoclastogénesis y que son las responsables de la pérdida de hueso por deficiencia estrogénica.
La pérdida de hueso que se produce normalmente por la edad, tanto en humanos como en animales, se evidencia por un afinamiento de las trabéculas debido a una disminución en el número de osteoblastos y no en su capacidad biosintética, producto de una osteoblastogénesis disminuida o una apoptosis incrementada ⁽¹¹⁾. En este sentido, con la edad se observan aumentos en la senescencia de la población de células MSCs y células osteoblásticas, en la acumulación de daños en el ADN y en la secreción del factor fenotípico secretor asociado a senescencia (SASP). Estos hechos conducen al incremento en la secreción de citoquinas proinflamatorias implicadas en la estimulación de la osteoclastogénesis ⁽⁷⁷⁾.
La disminución en la masa ósea asociada al envejecimiento está ligada al estrés oxidativo (78); modelos murinos de envejecimiento prematuro y signos de daño oxidativo muestran características osteoporóticas. En hueso de ratones adultos, la expresión de los genes que se producen por la interacción de â-catenina y, al mismo tiempo, TCF disminuye, al mismo tiempo, aumentan aquellos correspondientes a los factores de transcripción FoxO ^(68)(79). De manera similar, estudios clínicos en mujeres osteoporóticas demostraron una asociación entre el aumento del estrés oxidativo tanto con los menores niveles plasmáticos de antioxidantes como con una disminución de densidad mineral ósea (DMO) ^(80)(81). La consecuencia del aumento en los niveles de ERO, tanto por deficiencia esteroidea como por el envejecimiento se traduce en una menor actividad de la GSR en médula ósea con el consiguiente incremento en la fosforilación de p⁵³ y p⁶⁶shc ⁽⁸¹⁾.
Este proceso favorece la fosforilación de FoxO, vía Akt, y su degradación. Por otro lado, las ERO estimulan al factor de transcripción NF-kB con lo cual se inhibe a las quinasas IIkB que fosforilan y activan a FoxO3 con lo cual, al menos en parte, permiten su ubiquitinación y consiguiente degradación ^(78)(82-84).
El estrés oxidativo promueve el desarrollo de osteoporosis estimulando además la peroxidación lípidica, mecanismo por el cual se inhibe a la vía de señalización Wnt y con ello se induce una disminución en el número de osteoblastos y, por ende, en la formación ósea ⁽⁸⁵⁾. En este sentido, la pérdida de masa ósea con la edad se encuentra asociada al aumento en la expresión de lipoxigenasas; estas enzimas producen HO. que oxidan a los PUFAs generando moléculas prooxidantes como el 4-hidroxinanonal (4-HNE) ⁽⁸⁶⁾. El incremento de la oxidación lipídica y de la producción de 4-HNE, al igual que de H₂O₂, activa a los FoxOs atenuando la transcripción mediada por â-catenina/TCF ⁽⁸⁷⁾. Este mecanismo incrementa los niveles de PPARã que al asociarse con la â-catenina aumenta su degradación. La disminución en el pool de b-catenina desencadena a su vez un aumento en la expresión de PPARã y con ello un incremento en la adipogénesis a expensas de la osteoblastogénesis ⁽⁸⁸⁾. Este mecanismo explicaría el aumento de adipocitos que se observa en la médula ósea tanto de humanos como de ratones con osteoporosis evolutiva ⁽⁸⁶⁾ (Fig. 7). Finalmente, el 4-HNE no es sólo responsable de osteoporosis ya que se ha demostrado que se encuentra aumentado en pacientes con enfermedad de Alzheimer ^(89)(90).

Figura 7. Oxidación de ácidos grasos poliinsaturados y estrés oxidativo.

Conclusiones

Una serie de estudios recientes ha determinado la importancia fisiológica de las ERO sobre el remodelamiento óseo a través de su acción sobre las distintas células óseas. Las ERO desencadenan mecanismos de control homeostáticos indispensables para la salud ósea. El mecanismo más importante es la activación de los FoxOs, tendiente a evitar el estrés oxidativo y con ello el daño celular. La función de los FoxOs es ejercida mediante la regulación en la actividad de enzimas antioxidantes, de enzimas que reparan el ADN o de distintos genes involucrados en el ciclo celular, según el tipo de célula y su grado de diferenciación. Los FoxOs estimulan la producción de factores vitales para el osteoblasto como Runx2, AFT4 y b-catenina. Mediante dichas acciones FoxOs promueven la osteoblastogénesis o mantienen el pool de progenitores mesenquimales tempranos, regulan la proliferación/diferenciación de precursores osteoblásticos y protegen al osteoblasto maduro del estrés oxidativo. Además los FoxOs atenúan, por acciones directas o indirectas, la osteoclastogénesis.
Con la edad, el aumento del estrés oxidativo disminuye el número de osteoblastos debido a una competencia entre FoxOs y TCF/LE por un pool limitado de b-catenina. Este efecto produce a la vez un aumento en la actividad de los PPARã, con lo cual se acelera la adipogénesis a expensas de la osteoblastogénesis y al mismo tiempo la oxidación de los PUFAs. Este hecho genera una serie de compuestos pro-oxidantes como el 4-HNE que aumentan el estrés oxidativo. Asimismo, la caída estrogénica acelera la osteoclastogénesis por vía genómica o no genómica, aumentando la fosforilación de la proteína p66shc o activando al factor NF-kB.
Dada la importancia de FoxOs y ERO en la biología ósea y durante el envejecimiento, clarificar los eventos celulares y pasos moleculares involucrados en el control del estrés oxidativo sería vital para entender la regulación de la osteoporosis relacionada a la edad.

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Aceptado para su publicación el 2 de agosto de 2013