BIOQUÍMICA CLÍNICA

Estudio de la deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga con hipoglicemia

Study of very long chain acyl-CoA deshydrogenase with hypoglycemia

Estudo da deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia muito longa com hipoglicemia

 

José Henry Osorio^1a,b

Laboratorio de Investigación en Bioquímica Clínica y Patología Molecular, Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. Universidad de Manizales, Cra. 9ª N° 19-03. Manizales, Colombia.

 

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Resumen

La acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga (VLCAD, very long chain acyl-Co A dehydrogenase) es considerada una enzima limitante en el sistema de beta-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga. Con base en la clínica presentada en esta deficiencia se han informado 3 fenotipos: VLCAD-C por presentar cardiomiopatía dilatada, VLCAD-H caracterizada por episodios de hipoglicemia y VLCAD-M en la cual se presentan episodios de miopatía con rabdomiólisis. Los estudios in vitro, que buscan intermediarios de la degradación mitocondrial de ácidos grasos, facilitan el diagnóstico de alteraciones hereditarias o adquiridas de la actividad de esta enzima. En el presente trabajo se analiza la producción de metabolitos en fibroblastos de pacientes con deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga con hipoglicemia (VLCAD-H), incubados con ácido oleico deuterado. Se incubaron fibroblastos de cinco pacientes con deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga (VLCAD) con hipoglicemia y de diez controles en presencia de ácido oleico deuterado. Se encontró un perfil característico luego de la incubación de fibroblastos con esta deficiencia. Los valores de D²C_12:1 fueron similares entre los pacientes y los controles, mientras que los valores de D²C_14:1 y D²C_16:1 fueron encontrados significativamente más elevados en los fibroblastos de los pacientes. Este sustrato podría ser usado para realizar diagnóstico in vitro de la deficiencia de VLCAD-H.

Palabras clave: ácidos grasos ; metabolismo ; ß-oxidación mitocondrial

Summary

Very-long-chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD) is considered a rate-limiting enzyme in a very-long-chain fatty acid beta-oxidation system. Based on clinical presentation three phenotypes have been reported for this deficiency, as follows: VLCAD-C presenting cardiomiopathy, VLCAD-H characterized by episodes of hypoglycemia, and VLCAD-M including episodes of myopathy with rhabdomyolysis. In vitro studies, searching for intermediates of mitochondrial fatty acid degradation, are a tool for diagnosis of inherited or acquired alterations of this enzyme activity. The present work analizes the metabolite production in fbroblasts from patientes with VLCAD-H deficiency, incubated with deuterated oleic acid. Fibroblasts from ten controls and fve patients with VLCAD deficiency with hypoglycemia (VLCAD-H) were incubated in the presence of deuterated oleic acid. A characteristic profle was found after incubation of fbroblasts with this deficiency. D²C_12:1 values were similar between patients and controls, while values of D²C_14:1 and D²C_16:1 were significantly higher in the fbroblasts of patients. Therefore, this substrate could be used for in vitro diagnosis of VLCAD-H deficiency.

Key words: fatty acids ; metabolism ; mitochondrial ß-oxidation

Resumo

A acil-CoA desidrogenase de cadeia muito longa (VLCAD, very long chain acyl-Co A dehydrogenase) é considerada uma enzima limitante no sistema de beta-oxidação de ácidos graxos de cadeia muito longa. Com base na clínica apresentada nesta deficiência, foram informados três fenótipos: VLCAD-C por apre-sentar cardiomiopatia dilatada, VLCAD-H caracterizada por episódios de hipoglicemia e VLCAD-M em que ocorrem episódios de miopatia com rabdomiólise. Os estudos in vitro, em busca de intermediários da degradação mitocondrial de ácidos graxos, são uma ferramenta para o diagnóstico de alterações here-ditárias ou adquiridas da atividade desta enzima. O presente trabalho analisa a produção de metabólitos em fibroblastos de pacientes com deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia muito longa, com hipoglicemia (VLCAD-H), incubadas com ácido oleico deuterado. Foram incubados fibroblastos de cinco pacientes com deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia muito longa (VLCAD) com hipoglicemia, e de dez controles em presença de ácido oleico deuterado. Foi achado um perfil característico após a incubação de fibroblastos com esta deficiência. Os valores D²C_12:1 foram semelhantes entre os pacientes e os controles, ao passo que os valores de D₂C_14:1 e D²C_16:1 foram significativamente mais elevados nos fibroblastos dos pacientes. Este substrato poderia ser utilizado para realizar diagnóstico in vitro da deficiência VLCAD-H.

Palavras chave: ácidos graxos ; metabolismo ; beta-oxidação mitocondrial

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Introducción

El diagnóstico de la deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga (VLCAD), además de la clínica, involucra otros hallazgos, como el análisis por inmunohistoquímica para la enzima VLCAD en biopsias de músculo de estos pacientes, que muestran bajas cantidades de la enzima, así como una baja actividad enzimática de la misma. Los análisis bioquímicos en estos pacientes informan niveles elevados de C_14n-9 en el análisis de ácidos grasos libres en plasma, por cromatografía de gases; niveles elevados de ácidos dicarboxílicos desde C₆ hasta C₁₄ en el análisis de ácidos orgánicos en orina, por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM); y niveles altos de las acilcarnitinas C_14:1, C₁₄, C₁₆ en el análisis de sangre por espectrometría de masas en tándem (1).

Las acilcarnitinas producidas luego de la oxidación mitocondrial de ácidos grasos, pueden salir de la mitocondria y acumularse en el medio de cultivo, mientras que los tioésteres de acil-CoA formados quedan confinados en la mitocondria debido a su incapacidad para atravesar la membrana mitocondrial (2). A partir de ese precepto, Nada et al. (3) diseñaron un método para el diagnóstico de las deficiencias de la ß-oxidación mito-condrial de los ácidos grasos mediante la incubación de fibroblastos utilizando ácido [17,17,18,18-²H₄]-9,12-octadecadienoico (ácido linoleico deuterado), en presencia de L-carnitina, utilizando espectrometría de masas en tándem (EM-EM), para medir las acilcarnitinas deuteradas en el medio de cultivo.

Mediante ese procedimiento se consigue establecer el diagnóstico de varias deficiencias de la ß-oxidación mitocondrial, pero a pesar de ser una técnica altamente sensible y precisa, tiene el inconveniente de la accesibilidad para numerosos laboratorios en el mundo, dado los costos que implica, por lo que se han diseñado otras técnicas que determinan acilcarnitinas en medios de cultivo de fibroblastos por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas con monitoreo selectivo de un ion (CG-EM-MSI) (4). En este trabajo se presentan los resultados de la incubación de fibroblastos con ácido oleico deuterado, detectando metabolitos por CG-EM, en pacientes que sufren deficiencia de VLCAD caracterizada por episodios de hipoglicemia. El presente estudio analizó la producción de intermediarios por incubación de f-broblastos con ácido oleico deuterado como herramienta diagnóstica en pacientes con deficiencia de VLCAD.

Materiales y Métodos

El presente estudio es de tipo experimental. El material biológico empleado fue de 10 cultivos diferentes de fbro-blastos normales y de 5 pacientes con diagnóstico confrma-do de deficiencia de VLCAD que presentaban hipoglice-mia. Esta deficiencia se confrmó por estudios enzimáticos, moleculares o ambos. Como sustrato fue empleado el ácido oleico deuterado (ácido [9,10-²H₂]-oleico) (Cambridge Isotope Laboratories. Tewksbury, MA, USA). Fueron utilizados los siguientes compuestos deuterados para la preparación de la curva de calibración [8,8,8-d₃]-octanoil-L-carnitina. HCl, [10,10,10-d₃]-decanoil-L-carnitina.HCl, [12,12,12-d₃]-dodecanoil-L-carnitina.HCl, [14,14,14-d₃]-tetradecanoil-L-carnitina.HCl, [16,16,16-d₃] hexadecanoil-L-carnitina. HCl (Ten Brinx-Free University, Amsterdam). Como estándar interno fue adicionado ácido undecanodioico (Fluka, St. Gallen, Switzerland) durante el proceso de extracción de las muestras.

Los fibroblastos (4-20 pasajes) fueron cultivados en medio de cultivo similar al medio basal Eagle's con bicarbonato y HEPES (4-(2-hidroxietil)-1-ácido pipera-zinaetano sulfúrico), MEM (medio esencial mínimo) suplementado con suero de bovino recién nacido 10% (v/v) y gentamicina 1% (v/v) a 37 °C, en estufa con 5%CO₂/95% de aire. Después de alcanzar el punto de confuencia (80-100%), las células fueron lavadas dos veces con PBS (buffer fosfato salino). La solución se tripsi-nizó (1 mL de tripsina-EDTA a 37 °C) y posteriormente se neutralizó mediante la adición de 3-5 mL de MEM. Las células fueron transferidas y centrifugadas a 337 X g (5 min, 20 ^oC) en tubos cónicos de 10 mL (0,8-1,2 mg proteína), quedando listas para ser incubadas en presencia de sustratos deuterados. Se utilizó el método de Lowry et al. (5) para la determinación de proteínas. Para la oxidación de ácido oleico deuterado en fibroblastos fue utilizada la técnica diseñada por Osorio et al. (6); se preparó una solución de medio de cultivo con una concentración fnal de 0,15 mM de ácido oleico deuterado (ácido [9,10-²H₂]-oleico), 1 mM BSA y L-carnitina 0,2 mM. La incubación por los fibroblastos se llevó a cabo de la siguiente manera: después de la tripsinización, las células fueron resuspendidas en MEM enriquecido en frascos falcom de 2,5 mL (2 frascos por caso). Después de 72 h de incubación, el medio de cultivo fue recogido mediante centrifugación y almacenado a -20 °C hasta su análisis. Las células se resuspendieron en 1 mL de PBS1 para proceder a la determinación de proteínas.

El análisis cuantitativo se basó en el método del estándar interno. Se prepararon curvas de calibración para los ácidos grasos C₈, C₁₀, C₁₂ y C₁₄, en un rango de 0 a 150 nM, y C₁₆ en un rango de 0-1000 nM, utilizando acilcarnitinas deuteradas en el último carbono, diluidas en MEM (p<0,00001 para cada curva de calibración). El análisis de los ácidos grasos de los medios enriquecidos (curvas de calibración y productos de la incubación) fue realizado después de la hidrólisis con KOH. Las curvas de calibración se obtuvieron mediante el análisis de regresión lineal, representando la relación de concentraciones de cada ácido respecto al estándar interno frente a la relación de áreas.

Las condiciones de la cromatografía gas-líquido fueron las siguientes: fujo de gas portador (He): 1 mL/ min; división de fujo: 1:30; tiempo de inyección: 1min 5 segundos; temperatura del inyector: 250 °C; temperatura del horno y programación de temperaturas: T1 70 °C a 6 °C/min, T2 250 °C a 20 °C/min hasta T3 300 °C; volumen de inyección: 1 mL; tiempo total: 38,5 min. Las condiciones de la espectrometría de masas fueron las siguientes: el análisis cualitativo se realizó por CG-EM por impacto electrónico y monitorización selectiva de iones. Para cada ácido se monitorizó el ión M^+.-15, ya que es el ión selectivo y uno de los más abundantes; la ionización se realizó por impacto electrónico a 70 eV y la fuente de iones se mantuvo a una temperatura de 200 °C. La temperatura del analizador fue de 100 °C; para la adquisición de datos, el instrumento utilizó un scanning repetitivo en un rango de 40 a 600 unidades de masa atómica. Fue utilizado un cromatógrafo de gases 5890 Series II Plus - Espectrómetro de masas Hewlett Packard (serie 5972, Palo Alto, CA, año 2000).

Resultados

En todas las curvas de calibración se obtuvo un coeficiente de correlación superior a 0,99. La Figura 1 muestra el cromatograma CG-EM-MSI de ácidos grasos en fibroblastos incubados con ácido [9,10-²H₂]-oleico. Los ácidos grasos saturados intermediarios corresponden a la oxidación de ácido palmítico del medio de cultivo. Fueron observados solamente los metabolitos de 12 (D²C_12:1; ácido [9,10-²H₂]-9-dodecenoico), 14 (D²C_14:1; ácido [9,10-²H₂]-9-tetradecenoico) y 16 (D²C_16:1; ácido [9,10-²H₂]-9-hexadecenoico) átomos de carbono, como productos de la degradación del ácido oleico. Las concentraciones observadas para los diferentes ácidos grasos, permiten establecer un perfil para los ácidos grasos intermediarios mencionados en fibroblastos normales (Tabla I). Los valores de D²C_12:1 fueron similares entre los pacientes y los controles, mientras que los valores de D²C_14:1 y D²C_16:1 fueron encontrados significativamente más elevados en los fibroblastos de los pacientes.

Figura 1. Cromatograma CG-EM-MSI de ácidos grasos en fibroblastos incubados con ácido [9,10-²H₂]-oleico. Se observa la abundancia relativa vs. tiempo de elución (min). Los ácidos grasos saturados intermediarios corresponden a la oxidación de ácido palmítico del medio de cultivo.

Discusión y Conclusiones

La enzima acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga (VLCAD, sigla del inglés: very long chain acyl-CoA dehydrogenase) es un homodímero de 154-kDa (7) y su cADN consta de una región de 2.177 bp codificando un péptido líder de 40 aminoácidos y un polipéptido maduro de 615 aminoácidos, para un total de 655 aminoácidos en la proteína entera (8). Esta enzima es específica para acil-CoAs de 14-24 átomos de carbono y cataliza más del 90% de la deshidrogenación del palmitoíl-CoA (C₁₆) (9) (10). El gen se encuentra localizado en el cromosoma 17p13 (11) y esta enzima es considerada un paso limitante en la oxidación de ácidos grasos de cadena larga (12). Con base en la clínica presentada en esta deficiencia se han informado 3 fenotipos: una forma infantil severa (10), una forma de presentación más benigna que se presenta también en la niñez (13) y una forma muscular, la cual se manifesta después de la niñez (14). Más recientemente estas variantes han sido descritas respectivamente como VLCAD-C por presentar cardiomiopatía dilatada, VLCAD-H caracterizada por episodios de hipoglicemia y VLCAD-M en la cual se presentan episodios de miopatía con rabdomiólisis (15). La detección de metabolitos intermediarios de la ß-oxidación mitocondrial de los ácidos grasos ha sido ampliamente estudiada (16-18). La espectrometría de masas en tándem (EM-EM) sigue siendo el método más efectivo para detectar alteraciones en esta vía metabólica (19). Sin embargo, es una técnica que no está disponible para muchos laboratorios, por lo cual se deben buscar otras alternativas. El uso de fibroblastos para el análisis del funcionamiento de la ß-oxidación mitocondrial de los ácidos grasos mediante la incubación con diferentes sustratos ha sido plenamente documentada (20-22). La técnica de análisis de ácidos grasos mediante GC/MS ha probado ser efectiva para este tipo de análisis; en trabajos anteriores, trabajando con ácido palmítico deuterado, han sido encontrados elevados los niveles de diferentes ácidos grasos, después de hidrolizar las acilcarnitinas presentes en el medio de cultivo de los fibroblastos de los pacientes que presentaban deficiencias de la ß-oxidación mitocondrial de los ácidos grasos (6). En el presente estudio ha sido encontrado un perfil que muestra incremento en los niveles de varios ácidos grasos deuterados luego de realizar incubación de fibroblastos de pacientes con deficiencia de VLCAD-H con ácido oleico deuterado (ácido [9,10-²H₂]-oleico), principalmente, metabolitos de 14 (D²C_14:1; ácido [9,10-²H₂]-9-tetradecenoico) y 16 (D²C_16:1; ácido [9,10-²H₂]-9-tetradecenoico) átomos de carbono. Estos resultados refuerzan el diagnóstico, toda vez que en otros estudios in vitro de esta deficiencia, al ser incubados con ácido palmítico deuterado, se han encontrado elevados los niveles de C₈, C₁₀, C_12:1, C₁₂, C_14:1 C₁₄, C_16:1 (23).

Tabla I. Producción de ácidos grasos deuterados en fibroblastos incubados con ácido oleico deuterado

ÁCIDOS GRASOS INTERMEDIARIOS (nmol/mg proteína/72 h)	PROMEDIO CONTROLES	INTERVALO CONTROLES	PROMEDIO VLCAD-H
D2C 12:1	3,6	2,8-4,2	3,2
D2C 14:1	2,9	1,9-5,1	16,4
D2C 16:1	3,2	2,5-3,8	10,0

 

CORRESPONDENCIA

PhD JOSÉ HENRY OSORIO E-mail: jose.osorio_o@ucaldas.edu.co

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Aceptado para su publicación el 9 de agosto de 2013