HEMATOLOGÍA

Estudio de eficiencia y sensibilidad de alarmas de dos analizadores hematológicos en un hospital pediátrico*

Study of efficiency and sensitivity of alarms of two hematology analyzers in a pediatric hospital

Estudo de eficiência e sensibilidade o alarmes de dois analisadores de hematologia em um hospital pediátrico

 

Viviana Osta¹, Celia Segura¹, Gladys Tissera¹, Claudia Ayuso¹

Sección Hemocitología. Laboratorio Central. Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez. Gallo 1330. (1425) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina

 

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Resumen

Con el objetivo de mejorar el flujo de trabajo en el Laboratorio de Hemoci-tología se evaluó el desempeño analítico y eficiencia del sistema de alarmas de dos contadores hematológicos de última generación, Coulter LH750 y Abbott CEL-DYN Ruby, para la resolución de muestras patológicas en una población de pacientes pediátricos, considerando como método de referencia la revisión microscópica y la realización del recuento diferencial leucocitario en forma manual de los extendidos de sangre periférica. Se procesaron 178 muestras seleccionadas de la carga de trabajo diario del Laboratorio en ambos contadores, se analizaron los reportes emitidos y se realizó el diferencial manual. Se encontró una excelente concordancia entre los dos instrumentos para el recuento de leucocitos, eritrocitos, hemoglobina, VCM y plaquetas, y entre el diferencial manual y el reportado por ambos equipos. La eficiencia de las alarmas en ambos analizadores fue similar, 77% para CELL-DYN Ruby y 71,3% para LH750. La tasa de falsos negativos fue de 3,4% y 4,0% respectivamente. La tasa de falsos positivos en ambos equipos fue 17%. Se puede concluir que los analizadores evaluados presentan un desempeño comparable. Cada laboratorio debe considerar las características de la población de pacientes que recibe para establecer criterios estrictos y sistemáticos para la revisión del frotis.

Palabras clave: contadores hematológicos ; alarmas ; eficiencia ; revisión microscópica

Summary

The goal of the hematology laboratory is to improve workflow efficiency by optimizing instrument results and flagging sensitivity with its daily manual blood smears requirements. Two hematology analyzers (Coulter LH750 and CEL-DYN Ruby Abbott) were evaluated to determine analytical performance and efficiency in daily work at the Central Laboratory of a Pediatric Hospital. Microscopic revision was considered the reference method. A total of 178 pathological blood samples randomly selected from ambulatory and in-patients were analyzed in both analyzers. An excellent correlation between both instruments for leukocytes, erythrocytes, hemoglobin, MCV and platelet count was observed; also close agreement of results between manual differential and automated count. The efficiency of alarms triggered by the automated hematology analyzer was similar. Total efficiency of Cell-Dyn Ruby was 77% and 71.3% in the LH750. The false negative rate was 3.4% and 4.0% for the LH750 and Ruby respectively. The false positive rate was 17% for both instruments. It can be concluded that the two analyzers tested have a comparable analytical performance and each clinical laboratory must consider the characteristics of their population in order to establish critical and systematic criteria for manual microscopic review.

Key words: hematology analyzers ; flags ; efficiency; microscopic review

Resumo

A fim de melhorar o fluxo de trabalho no Laboratòrio de Hematologia avaliou-se o desempenho analítico e a eficiencia do sistema de alarmes dos dois contadores de hematologia de última geragáo, Coulter LH750 e Abott CEL-DYN Ruby, para a resolugáo de amostras patológicas numa populagáo de pacientes pediatricos. Considerou-se como método de referencia a revisáo microscòpica e diferencial manual dos esfregagos de sangue periférico. Foram processadas 178 amostras seleccionadas da carga de trabalho diàrio do Laboratòrio em ambos contadores, foram analisados os relatórios emitidos e se realizou o diferencial manual. Encontrou-se uma excelente concordancia entre os dois instrumentos para a contagem de leucócitos, eritrocitos, hemoglobina, VCM e plaquetas, e entre el diferencial manual e o relatado por ambas equipes. A eficiencia dos alarmes em ambos os analisadores foi semelhante, 77% para CELL-DYN Ruby e 71,3% para LH750. A taxa de falsos negativos foi de 3,4% e 4,0%, respectivamente. A taxa de falsos positivos foi de 17% para ambos equipes. Pode-se concluir que os analisadores avaliados tem um desempenho comparàvel. Cada laboratòrio deve considerar as características da populagáo de pacientes que recebe para estabelecer critérios rigorosos e sistemáticos para a revisáo de esfregagos.

Palavras-chave: contadores hematológicos ; alarmes ; eficiencia ; revisáo microscópica

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Introducción

En las últimas décadas, el avance tecnológico de los autoanalizadores hematológicos permitió la introducción de nuevos principios físicos para el análisis celular, como así también mejoras en el software que utilizan, que han dado como resultado un incremento en la eficiencia analítica.

La realización del recuento diferencial de leucocitos tiene por objeto, por un lado, la búsqueda de anormalidades cuantitativas en células morfológicamente normales como, por ejemplo, el diagnóstico de un proceso infeccioso, de un estado alérgico, o para el monitoreo de terapias citotóxicas o mielotóxicas, que requieren bajos niveles de imprecisión e inexactitud en el recuento. Por otro lado, es fundamental para la búsqueda de anormalidades morfológicas como, por ejemplo, la identificación de células inmaduras o atípicas.

La realización del recuento diferencial leucocitario basado en el recuento de 100 células presenta 3 tipos de errores: un error estadístico, un error producido por la distribución desigual de las células en el extendido y un error en la identificación de las células relacionado con la subjetividad del observador. El error más importante es el estadístico debido a que está invariablemente relacionado al número total de células analizadas y es particularmente importante en el caso del recuento de ciertas poblaciones celulares como los monocitos y basófilos. Este tipo de error estadístico de muestreo implica esencialmente que los límites de confianza para el porcentaje observado de cualquiera de las poblaciones leucocitarias están directamente relacionados con el número de células contadas (1)(2).

Diferentes publicaciones confirman que, cuando las muestras de sangre periférica no presentan alteraciones significativas en ninguna de las tres series hematológi-cas, el desempeño analítico de la mayoría de los contadores hematológicos es altamente satisfactorio con diferencias mínimas entre los distintos instrumentos (1)(3)(4). Los parámetros tales como el recuento de leucocitos y hematíes, la concentración de hemoglobina, o el volumen corpuscular medio (VCM), presentan por lo general un desempeño analítico excelente, en tanto que otros parámetros, en particular ciertos componentes del diferencial leucocitario, reticulocitos o el recuento de plaquetas, especialmente a bajas concentraciones, evidencian un desempeño menos satisfactorio (5). El recuento de basófilos es el que presenta la mayor imprecisión e inexactitud debido a que los contadores automáticos tienden a subestimar el recuento en presencia de una basofilia verdadera, y en algunos casos suelen arrojar un recuento de basófilos elevado como resultado de artefactos producidos por la presencia de células anormales como blastos, células plasmáticas o células del linfoma (6-8).

Además de los parámetros tradicionales del recuento celular y del recuento diferencial leucocitario, los analizadores proveen una serie de alarmas o flags cualitativas. Estas alarmas pueden indicar la presencia de células que normalmente no se encuentran en el frotis de sangre periférica como blastos, linfocitos reactivos, células granulocíticas inmaduras (GIs) o glóbulos rojos nucleados (GRN), y también pueden ser generadas por interferencias analíticas debidas a la presencia de partículas que interfieren en el recuento automático de las células sanguíneas, o por problemas técnicos, lo que conduce a la necesidad de la revisión manual del frotis. Si bien estas alarmas son útiles, con frecuencia no son lo suficientemente sensibles, resultando en falsos negativos, o pueden clasificar en forma errónea ciertos tipos celulares resultando en falsos positivos. Esto hace que continuamente se perfeccionen las tecnologías para mejorar el sistema de alarmas, aumentando su sensibilidad y especificidad, disminuyendo así el número de frotis que deben ser revisados microscópicamente, con el objetivo de mejorar el flujo de trabajo y el tiempo de respuesta de los resultados (9).

Entre las alarmas que se presentan con mayor frecuencia en la tarea diaria y que requieren la revisión del frotis de sangre periférica se encuentra la presencia de GIs. Estas células están aumentadas en condiciones tales como infecciones bacterianas, enfermedades inflamatorias agudas, cáncer (particularmente con metástasis en médula ósea), necrosis tisular, rechazo agudo de trasplante, cirugía y trauma ortopédico, enfermedades mieloproliferativas, uso de esteroides, y en el embarazo (fundamentalmente durante el tercer trimestre). En estos casos, el aumento de GIs está acompañado generalmente por un aumento de neutrófilos, que son liberados del pool marginal y de la médula ósea. Sin embargo, en algunas circunstancias, especialmente en la vejez, neonatos y pacientes mielosuprimidos, el aumento de neutrófilos puede estar ausente y, en condiciones tales como la sepsis, puede detectarse neutropenia. En estas situaciones, el aumento de GIs (>2%), aún en forma aislada, puede ser útil para identificar una infección no sospechada (10)(11).

Otro aspecto a tener en cuenta, fundamentalmente en pacientes pediátricos, es el recuento de eritroblastos. Este presenta las limitaciones típicas en la imprecisión e inexactitud del recuento de una población de células poco frecuentes cuando se realiza el recuento total de células nucleadas. Su correcta enumeración es clínicamente importante ya que en la mayoría de las situaciones indican un desorden en la eritropoyesis o una eritropoyesis de estrés (12)(13).

En algunos laboratorios el recuento de GRN se realiza sólo ante la solicitud médica en situaciones clínicas específicas o cuando aparece una alarma en el recuento automatizado. En la actualidad 3 de los analizadores de última generación (Abbott Sapphire, Beckman Coulter LH 750 y Siemens ADVIA 2120) realizan el recuento de GRN en forma predeterminada en todas las muestras en las cuales se realiza el recuento diferencial leucocitario. En otros analizadores, la determinación de este parámetro debe ser especialmente programada.

Los resultados publicados sobre el recuento automático de eritroblastos muestran un excelente desempeño en términos de imprecisión (CV<10%) e inexactitud, aun cuando esta última es evaluada en base a la comparación con la microscopia o citometría de flujo con anticuerpos monoclonales, mostrando coeficientes de correlación entre 0,90 y 0,99 (12) (14-17). Los límites de detección, dependiendo del equipo utilizado varían entre 1 y 2 GRN/100 leucocitos. Hay que tener en cuenta que en aquellos analizadores que no realizan el recuento de GRN en forma predeterminada con el recuento diferencial leucocitario, cuando aparece la alarma de GRN se estaría sobrestimando el recuento total de leucocitos y se estaría también sobrestimando el recuento de linfocitos, ya que la mayoría de los contadores incluyen los GRN en forma total o parcial dentro de la población de linfocitos. Por lo tanto, en estos casos se debe hacer la corrección del recuento de leucocitos de acuerdo al número de eritroblastos contados al realizar el recuento diferencial leucocitario en forma manual siguiendo las recomendaciones publicadas por el Consejo Internacional para la Estandarización en Hematología y el CLSI (protocolo H20-A2) (18)(19).

El recuento de GRN es luego expresado como el número presente por cada 100 leucocitos y el recuento de leucocitos es subsecuentemente ajustado matemáticamente.

Otra alteración que puede conducir a una revisión microscópica del frotis es la pseudotrombocitopenia inducida por EDTA. En estos casos se obtiene un recuento falsamente disminuido de plaquetas, que se debería a la aglutinación in vitro por anticuerpos de tipo IgG, IgM o IgA dirigidos contra las glicoproteínas IIb/IIIa de las plaquetas (20)(21). En un estudio previo (22) realizado en este laboratorio sobre 3254 muestras de pacientes pediátricos procesadas, se encontró una prevalencia de trombocitopenia del 5,7% (186/3254). De éstas, el 54% (101/186) correspondió a pseudotrombocitopenias inducidas por EDTA confirmadas por la revisión del frotis y el resto de los casos (85/186) correspondió a trombocitopenias verdaderas.

Una alarma que siempre debe conducir a la revisión del frotis es aquella que sugiere la presencia de "células blásticas". Del mismo modo, dependiendo del contador que se esté utilizando y de las características de la población que concurre al laboratorio, la alarma de "linfocitos atípicos" o "linfocitos variantes" también debe ser una indicación para la observación microscópica del extendido, ya que esta alarma en algunos casos puede indicar la presencia de blastos.

El laboratorio central del Hospital de Niños Dr. R. Gutiérrez atiende una población de pacientes pediátricos con patologías complejas, que incluye tanto pacientes internados como ambulatorios. Cabe mencionar que, en el caso de muestras pediátricas, a la complejidad propia de la muestra debida a la alta frecuencia de aparición de células granulocíticas inmaduras, GRN y linfocitos atípicos o variantes, se suma el pequeño volumen de muestra del que se dispone. Se procesan aproximadamente 150 hemogramas diarios en los que se realiza el recuento diferencial leucocitario manual en el 100% de los frotis de sangre periférica. Esto hace que constantemente se intente mejorar la eficiencia del flujo de trabajo, analizando minuciosamente los resultados obtenidos del analizador y la sensibilidad clínica de las alarmas. Resulta por lo tanto fundamental que cada laboratorio conozca la eficiencia del sistema de alarmas del contador hematológico con que cuenta, para agilizar el proceso de observación microscópica de los extendidos.

El objetivo de este estudio fue comparar la eficiencia del contador hematológico LH750 con la de un equipo de características similares como el Cell-Dyn Ruby. Para ello se evaluó:

1. la concordancia entre los instrumentos,

2. la eficacia en la resolución de muestras patológicas (sensibilidad y especificidad clínicas de las alarmas) con respecto a la observación microscópica del extendido de sangre periférica, determinando así el número de revisiones innecesarias en cada uno de los instrumentos que podrían redundar en una mejora en el tiempo de respuesta de los resultados.

Materiales y Métodos

El contador LH750 (Beckman Coulter, Miami, FL) utiliza el método de impedancia para el recuento de glóbulos blancos, rojos y plaquetas, absorción espec-trofotométrica (525 nm) para la determinación de hemoglobina y la tecnología VCS -volumen, conductividad y dispersión de luz láser (scatter) -para el recuento celular completo, diferencial automático de 5 poblaciones y sus alarmas asociadas.

El Cell-Dyn Ruby (Abbott Diagnostic, Santa Clara, CA) utiliza métodos de detección por láser óptico en todas las facetas del análisis. El recuento de leucocitos y el diferencial de 5 sub-poblaciones son medidos a través de la tecnología MAPSS (Multi Angle Polarized Scatter Separation) que significa separación mediante dispersión ( scatter) lumínico polarizado en múltiples ángulos y se basa en la dispersión de la luz en cuatro dimensiones. Para clasificar las subpoblaciones leucocitarias y obtener las alertas morfológicas se combinan estas cuatro mediciones de forma diversa. Los diferentes detectores (0° - Tamaño; 10° - Complejidad; 90° - Lobularidad; 90° Despolarizado - Granularidad) analizan características especiales de cada elemento.

El recuento de glóbulos blancos y el recuento leucocitario diferencial se pueden procesar en un modo de lisis extendida y de recuento óptico de células nucleadas (NOC) para aquellas muestras que pueden mostrar interferencias por glóbulos rojos resistentes a la lisis. Para el análisis de los eritrocitos y plaquetas se utiliza la detección óptica de la dispersión de luz con esferi-zación de los glóbulos rojos evitando de esa manera variaciones en la medición de acuerdo a la posición en que la célula ingresa al sistema. Para la medición de hemoglobina utiliza absorción espectrofotométrica (LED a 555 nm).

Ambos analizadores fueron calibrados previamente al estudio de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. El programa de control de calidad incluyó la evaluación de 3 niveles del control de calidad interno provisto por los respectivos fabricantes que se procesaron diariamente y una muestra quincenal de un control de calidad externo internacional (RIQAS).

Se evaluaron 178 muestras de pacientes pediátricos, internados y ambulatorios, seleccionadas de la carga de trabajo diaria del laboratorio, que fue representativa de la población de pacientes que se atienden regularmente en el Hospital. El estudio se desarrolló durante un período de 4 días y se siguieron las recomendaciones del CLSI guía H20-A2 (19). Las muestras recogidas en tubos con EDTA-Kg (1,3 mL volumen final), que presentaban un volumen residual suficiente, fueron procesadas en los dos analizadores dentro de las 4 horas posteriores a la extracción, para evitar los efectos del envejecimiento de la muestra sobre los resultados y con menos de 2 horas de diferencia entre las corridas en ambos equipos. Siempre fueron procesadas en primer lugar en el contador LH750.

El análisis estadístico se realizó con el programa EP Evaluator Software, (Data Innovations, South Burlington, VT, EE.UU). La concordancia se evaluó a través del coeficiente de correlación de Pearson solamente en aquellos parámetros que son directamente medidos y calibrados (recuento de leucocitos, hematíes y plaquetas, hemoglobina y VCM), excluyendo de este análisis a aquellos índices calculados que se pueden ver afectados por los errores de medición que presentan los parámetros de los cuales derivan. Se consideró significativo un valor de p<0,05. La eficiencia clínica fue evaluada en base a los resultados de sensibilidad y especificidad clínicas obtenidos en el primer procesamiento de cada muestra en ambos equipos.

Se realizaron y colorearon con May Grunwald-Giem-sa dos extendidos de todas las muestras evaluadas, que fueron luego revisados por dos observadores experimentados, que contaron 200 elementos en cada frotis. Para obtener el recuento leucocitario diferencial de referencia se promediaron ambos recuentos. En los casos en que se detectó un recuento discrepante que excedía el intervalo de confianza del 95% alrededor de la línea de identidad para alguno de los tipos celulares entre los observadores, un tercer observador realizó un recuento de 200 elementos que se promedió con el recuento original concordante. Los observadores no contaban con el reporte de los equipos para no influenciar la observación.

Se consideraron patológicas aquellas muestras en las cuales se detectó al menos 1 de los siguientes criterios (modificados del International Consensus Group for Hema-tology Review) (23):

- >5% de neutrófilos en cayado

- >2% metamielocitos

- >1% promielocitos/mielocitos

- >1% blastos

- >5% linfocitos reactivos

- >1% glóbulos rojos nucleados

- Plaquetopenia<150x10³/mL

En este estudio no se consideraron positivas aquellas muestras con alarmas "definitivas" (por ejemplo linfoci-tosis o microcitosis) ya que éstas dependen de los límites de normalidad definidos en el equipo por el fabricante. Estos límites no tienen en cuenta las variaciones propias de la edad que presentan los parámetros del hemograma durante la edad pediátrica.

Para evaluar el recuento de glóbulos rojos nucleados se tomó como método de referencia el recuento manual en 200 elementos.

Para verificar la exactitud del recuento automatizado de plaquetas se utilizó el método de Fonio modificado que consiste en contar el número de plaquetas cada 1000 hematíes a partir del frotis de sangre periférica, y luego referirlo al número total de eritrocitos.

Resultados

Los coeficientes de correlación mostraron una fuerte concordancia entre ambos equipos, para leucocitos r=0,996, eritrocitos r=0,993, hemoglobina r=0,995, VCM r=0,975 y r=0,979 para plaquetas. Los coeficientes de correlación también fueron altamente significativos entre el recuento leucocitario diferencial manual y ambos equipos, siendo respectivamente para LH750 y Ruby de 0,995 y 0,900 para el porcentaje de neutrófilos, 0,924 y 0,913 para el porcentaje de linfocitos, y 0,920 y 0,915 para el porcentaje de eosinófilos. No se encontró correlación significativa entre el recuento manual para monocitos y basófilos con el recuento automatizado (Tabla I).

Tabla I. Coeficientes de correlación para leucocitos, glóbulos rojos, hemoglobina, volumen corpuscular medio y plaquetas entre ambos equipos, y para el porcentaje de neutrófilos, linfocitos, eosinófilos, monocitos y basófilos, entre el diferencial manual y los dos equipos.

Parámetro	Método de referencia	Método de comparación	Pendiente	Intersección	r
Leucocitos	LH750	Ruby	1,02	-0,290	0,996*
Eritrocitos	LH750	Ruby	1,03	-0,0663	0,993*
Hemoglobina	LH750	Ruby	0,975	-0,0395	0,995*
VCM	LH750	Ruby	0,955	3,97	0,975*
Plaquetas	LH750	Ruby	0,954	11,5	0,979*
%Neutróf¡los	Diferencial manual	LH750	1,02	0,0106	0,946*
%Linfocitos	Diferencial manual	LH750	0,972	-2,61	0,924*
%Monocitos	Diferencial manual	LH750	1,60	-1,64	0,519a
%Eosinófilos	Diferencial manual	LH750	0,949	0,270	0,920*
%Basófilos	Diferencial manual	LH750	6,25	0,0392	0,0994a
%Neutrófilos	Diferencial manual	Ruby	1,02	-3,45	0,900*
%Linfocitos	Diferencial manual	Ruby	0,959	0,959	0,913*
%Monocitos	Diferencial manual	Ruby	2,64	-7,11	0,351a
%Eosinófilos	Diferencial manual	Ruby	0,975	0,406	0,915*
%Basófilos	Diferencial manual	Ruby	4,23	0,447	0,160a

* p <0,01
a p >0,05 (no significativo).

De las 178 muestras evaluadas 42 resultaron patológicas durante la observación del frotis, presentando al menos una alteración en el recuento diferencial leucocitario y/o en el recuento de plaquetas.

El analizador LH750 presentó resultados inválidos del diferencial en el 9,6% (17/178) de las muestras analizadas, definiendo como inválido un reporte en el cual el analizador no reporta valores absolutos o relativos para las diferentes poblaciones leucocitarias e informa sólo el símbolo "::::" o informa el recuento leucocitario diferencial con la leyenda "verificar diferencial". De estas 17 muestras, en 11 no informó el diferencial y en 6 casos lo informó con el mensaje de "verificar diferencial". El analizador Ruby arrojó el diferencial leucocitario en todas las muestras, detectándose en el 2,8% de las muestras (5/178) resultados del recuento diferencial leucocitario con algún tipo de alarma.

En el caso del recuento de plaquetas el analizador LH750 reportó recuentos falsamente disminuidos en el 11,8% (21/178) de las muestras que por el frotis presentaban recuentos de plaquetas mayores a 150x10³/vxL. El analizador Ruby reportó 10,7% (19/178) de recuentos no válidos de plaquetas en muestras con recuentos superiores a 150x10³/viL.

Para evaluar sensibilidad y especificidad clínicas de las alarmas se tuvo en cuenta la detección de células granulocíticas inmaduras, la presencia de glóbulos rojos nucleados, la presencia de linfocitos reactivos y la presencia de plaquetopenia. En la Tabla II se presentan los falsos positivos y falsos negativos para cada una de las alteraciones evaluadas.

La eficiencia total del LH750 [(verdaderos normales+ verdaderos patológicos) x 100/total de muestras] fue del 71,3% y para el Cell-Dyn Ruby fue de 77,0% (Tabla lll).

Ambos instrumentos presentaron una tasa aceptable de falsos negativos (<5% de acuerdo a las recomendaciones del ICGHR) siendo de 3,4% para el LH750 y de 4,0% para Ruby. Cabe mencionar que una muestra con un recuento de leucocitos de 18,5x10³/mL y 5% de blastos en el extendido no fue identificada por el Ruby y fue señalada con la alarma "inmaduros 1" por el LH750. La tasa de falsos positivos en ambos equipos fue del 17%. En el caso del LH750 la mayor parte de los falsos positivos se debió a la alarma de granulocitos inmaduros y en el caso del Ruby a la de linfocitos variantes (Tabla II).

En 11 de las 178 muestras evaluadas se detectó la presencia de eritroblastos en la revisión microscópica, siendo el rango de 1 a 13 GRN/100 leucocitos. De estas 11 muestras positivas para GRN el LH750 detectó 8, mientras el Ruby identificó correctamente 6 de las muestras. Las muestras que no fueron detectadas presentaron recuentos entre 2 y 4 eritroblastos/100 leucocitos en el recuento diferencial manual. Para determinar la exactitud del recuento de GRN se compararon los recuentos automatizados con el método manual como método de referencia. No se encontró correlación significativa entre el recuento manual de eritroblastos y el de los analizadores, mientras que se encontró significación estadística en la correlación entre el recuento de eritroblastos del equipo LH750 vs el recuento del contador Ruby (r=0,701, p<0,05).

Discusión y Conclusiones

Con la mejora en el rendimiento de los contadores hematológicos, el rol de los analizadores y de la revisión microscópica del frotis ha ido cambiando. Los sistemas automáticos son superiores en cuanto al recuento de leucocitos, hematíes, plaquetas y al recuento diferencial leucocitario de los tipos celulares bien caracterizados (células maduras), mientras que el examen microscópico es superior en la identificación de células inmaduras, ya que se basa en la observación de diversas características citológicas como el patrón de la cromatina, la presencia de nucléolos, inclusiones citoplasmáticas, etc.

El recuento leucocitario diferencial manual sigue siendo el método de referencia frente al cual se deben evaluar los contadores hematológicos, ya que es la única forma de identificar y/o confirmar falsos positivos y falsos negativos.

Tabla II. Resumen de las alteraciones detectadas en la observación microscópica de las muestras y de la proporción de falsos positivos y falsos negativos que resultan del análisis de las alarmas informadas por los analizadores.

	Manual	LH750		Ruby
		Falsos positivos	Falsos negativos	Falsos positivos	Falsos negativos
Presencia de GIs	37	22	10	15	15
Presencia de GRN	11	6	3	5	4
Plaquetopenia	3	21	0	19	0
Presencia de linfocitos reactivos	2	6	0	21	1

GIs: Células granulocíticas inmaduras. GRN: Glóbulos rojos nucleados.

Tabla III. Sensibilidad, especificidad y eficiencia clínica de los analizadores Coulter LH750 y CEL-DYN Ruby para detectar muestras patológicas tomando como método de referencia la revisión manual del frotis.

Analizador	N	Sensibilidad (%)	Especificidad (%)	Eficiencia (%)
LH750	178	83,8	67,9	71,3
Ruby	178	81,0	75,9	77,0

Muchos laboratorios, con el objetivo de optimizar costos y el tiempo de entrega de los resultados, tratan de disminuir al máximo el número de muestras que deben ser revisadas, sin afectar la calidad de los resultados ni poner en riesgo la seguridad del paciente al informar un resultado erróneo, especialmente los falsos negativos. Con el devenir de los contadores hematológicos, la proporción de muestras de sangre periférica que requieren revisión microscópica del frotis ha disminuido notoriamente hasta ser de solo el 10-15% en algunos centros. Sin embargo, se puede observar una gran diversidad de criterios entre laboratorios ya que también existen reportes de una tasa de revisión microscópica mayor al 50% (24). Esto podría ser explicado solo en parte por las diferencias en las características de los pacientes y en el desempeño de los diferentes analizadores. El consenso publicado por la Sociedad Internacional de Laboratorios de Hematología en 2003 (23) fija criterios para realizar la revisión del extendido de sangre periférica en base a los resultados y alarmas que proporcionan los contadores hematológicos. Estas reglas tienen en cuenta además de la edad del paciente, si existen diferencias significativas con respecto a resultados previos del mismo. Por lo tanto, es fundamental conocer el desempeño analítico y la eficiencia clínica del analizador que se utiliza, para determinar qué muestras deben ser revisadas, estableciendo criterios de acción estrictos y sistemáticos para la revisión microscópica de los extendidos, teniendo en cuenta las características de la población que es atendida en cada Laboratorio. La revisión del frotis puede no solo proveer información adicional o identificar alteraciones no detectadas por el analizador, sino que es fundamental para confirmar ciertos resultados reportados por el equipo.

Existen controversias en cuanto a la utilidad del recuento de los elementos inmaduros de la progenie mieloide, especialmente de células en banda o cayados. Mientras algunos autores consideran que es clínicamente útil para el diagnóstico de infecciones, especialmente de la sepsis neonatal, otros no recomiendan su uso en la práctica clínica diaria debido a que, si bien existe una definición morfológica de estas células, la variabilidad inter-observador es tan alta que hace que este parámetro sea considerado de poca utilidad (25-27). Otras células inmaduras como los metamielocitos, mielocitos y promielocitos, incluidos en el grupo de GIs, están mejor definidas morfológicamente y dado que también se ha demostrado que su aumento es potencialmente útil para el diagnóstico de la sepsis neonatal, se los ha propuesto como una herramienta alternativa al recuento de cayados (1). Estudios publicados concuerdan en que el recuento de GIs presenta una alta especificidad para la detección de infecciones que va del 83% al 97%, habiéndose reportado una asociación significativa entre el recuento elevado de GIs y la presencia de hemocultivos positivos. Sin embargo, la baja sensibilidad del recuento microscópico de GIs que va del 35% al 40%, sumada a la imprecisión debida en parte a que se encuentran en bajas concentraciones (<10%), hace que para algunos autores su recuento no sea considerado como prueba de screening para el diagnóstico de un proceso infeccioso (1)(10).

Otro aspecto a tener en cuenta en pediatría es el efecto de la presencia de eritroblastos sobre el recuento leucocitario diferencial.

Los eritroblastos están normalmente presentes a bajas concentraciones en los extendidos de sangre periférica del neonato y pueden estar elevados en la enfermedad hemolítica neonatal, en neonatos prematuros, o en aquellos afectados por hipoxia en el periodo perinatal (28)(29). También pueden ser detectados en pacientes adultos en condiciones tales como los síndromes talasémicos, enfermedades mieloproliferativas como la mielofibrosis, en la metástasis en médula ósea de tumores sólidos, la hematopoyesis extramedular y en todas las condiciones que impliquen una eritropoyesis de estrés como en la septicemia, hemorragia masiva o hipoxia severa (8)(30). En estas situaciones, su presencia se correlaciona con el pronóstico o la severidad de la enfermedad de base. El recuento de GRN también puede ser útil para evaluar la eficacia de una transfusión, como es el caso de los síndromes talasémicos en los cuales es recomendable mantener un recuento de GRN menor a 5/100 leucocitos (31). Se ha reportado también la existencia de asociación entre el incremento de la tasa de mortalidad y el aumento del recuento de GRN (32) (33). En un estudio realizado en pacientes hospitalizados luego de una cirugía general o cardiotorácica y otras enfermedades no hematológicas, se registró un incremento en la tasa de mortalidad con el aumento en el recuento de GRN, siendo de 21,1% en aquellos pacientes en los que se observaban GRN en el extendido y del 1,2% para pacientes que no presentaban GRN en el extendido de sangre periférica (32).

El recuento de eritroblastos también tiene valor en el paciente trasplantado. La persistencia de GRN en el extendido de sangre periférica en sujetos que han sido sometidos a un trasplante de células progenitoras ha demostrado ser un factor de mal pronóstico, detectándose un incremento de la tasa de mortalidad con el aumento del recuento de GRN, siendo del 100% entre sujetos con un recuento de GRN mayor a 0,2x10⁹/L (34). Esto remarca la importancia de detectar no solamente la presencia de eritroblastos, sino la estimación de su recuento.

Se ha mencionado que la morfología heterogénea de los eritroblastos puede conducir a un error significativo cuando se realiza el recuento de leucocitos con método de impedancia. La presunción de que todos los GRN hayan sido incluidos dentro del recuento total de leucocitos puede no ser completamente cierta debido a que los GRN de menor tamaño que el umbral para leucocitos, podrían no ser incluidos en el recuento. Por lo tanto, la corrección manual del recuento de leucocitos en función del número de GRN observados en la revisión microscópica podría conducir a un resultado erróneo del recuento de leucocitos debido a que se estarían restando elementos que no fueron contados por el analizador (9).

Los resultados del presente estudio sugieren que los analizadores evaluados (Coulter LH750 y Cell-Dyn Ruby Abbott) presentan desempeños altamente aceptables para resolver las muestras patológicas que se procesan en el Laboratorio. El contador LH750 mostró una mayor sensibilidad clínica para la detección de muestras anormales. Por su parte, el analizador Ruby mostró una mayor especificidad clínica, es decir que presentó un mayor número de muestras correctamente identificadas como patológicas, disminuyendo el número de falsos positivos.

Como ventaja del analizador LH750 se puede mencionar que realiza el recuento total de glóbulos rojos nu-cleados en forma predeterminada junto con el recuento diferencial leucocitario, mientras que en el Ruby el recuento de eritroblastos surge como un test reflejo que debe programarse en aquellas muestras que presentan la alarma de GRN y que necesitan por lo tanto ser identificadas y reprocesadas en el modo de lisis extendida. Esto puede enlentecer el flujo de trabajo dependiendo de las características de la población estudiada. Por otra parte, el analizador Ruby reporta el recuento de bandas y de células granulocíticas inmaduras mientras que el LH750 solo informa la alarma de "inmaduros 1/inmaduros 2" e incluye estas células en el recuento final de neutrófilos.

En laboratorios donde se atienden pacientes pediátricos con patologías complejas es particularmente importante la observación microscópica del frotis que continúa siendo una herramienta única en el diagnóstico de patologías específicas como por ejemplo las leucemias, linfomas y anemias hemolíticas.

CORRESPONDENCIA

DRA. VIVIANA OSTA Zapata 31-2°A 1426 CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES Tel/Fax: 011-4962-6770 E-mail viviosta@yahoo.com.ar

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Aceptado para su publicación el 21 de octubre de 2013