HEMOSTASIA Y TROMBOSIS

Validación de una técnica de actividad de factor von Willebrand que utiliza glicoproteína Ib mutada

Validation of a method based on a mutant glycoprotein Ib for von Willebrand factor activity measure

Validação de uma técnica da atividade do fator de von Willebrand que usa mutante de glicoproteína Ib

 

Marta Elba Martinuzzo¹, Luis Horacio Barrera², Cecilia Ujhelly¹, María Angélica D'Adamo³, Juan Carlos Otaso², María Isabel Giménez¹, José Oyhamburu²

¹ Bioquímica.
² Bioquímico.
³ Técnica en Hemoterapia.
* Grupo Bioquímico, Laboratorio Central, Hospital Italiano de Buenos Aires, CABA, Argentina.

CORRESPONDENCIA DRA. MARTA MARTINUZZO Perón 4190, Planta Baja (C1181ACH) CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES, Argentina Tel. (54) (11) 49590200 ext. 8857/ Tel. mobile (54) (11) (1555245312). E-mail: marta.martinuzzo@hospitalitaliano.org; memartinuzzo@gmail.com

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Resumen

La medida de actividad del factor von Willebrand (vWF) es importante para el diagnóstico de la enfermedad de von Willebrand (vWD). El equipo Innovance®vWF Ac (Siemens Healthcare Diagnostics) utiliza un método inmunoturbidimétrico diseñado para coagulómetros Sysmex CA (Siemens). El objetivo del estudio fue desarrollar y validar la metodología del reactivo Innovance®vWF Ac para el coagulómetro ACL TOP 700 (Instrumentation Laboratory, IL) y realizar un estudio comparativo de su desempeño frente a la de la técnica vWF Activity (vWF Act, IL) y a la del cofactor de ristocetina (vWF:RCo) por agregación de transmisión de luz. Se desarrolló, calibró y validó la técnica mediante estudios de verificación de linealidad y precisión total para dos niveles de control. Se midió la actividad del vWF por los métodos Innovance®vWF Ac y vWF Act en 82 muestras consecutivas dentro del rango reportable. Para comparar métodos se utilizó la regresión de Deming. El análisis inicial de los resultados de Innovance®vWF Ac y vWF Act demostró que no eran estadísticamente comparables. Se observó un Bias negativo para Innovance®vWF Ac en muestras con vWF Act>150%. Excluyendo las mismas, se demostró que los resultados de ambas pruebas eran comparables, al igual que los de Innovance®vWF Ac y vWF:RCo en un subgrupo de 27 muestras. La adaptación del método Innovance®vWF Ac en el ACL TOP 700 fue exitosa, presentó linealidad y precisión acorde con los requerimientos de calidad del laboratorio, brindando resultados comparables a los de vWF Act y vWF:RCo en el rango de 5-150%, útil para el diagnóstico de vWD.

Palabras clave: Actividad de factor von Willebrand; Cofactor de ristocetina; Enfermedad de von Willebrand.

Summary

Measurement of vonWillebrand factor (vWF) activity is important for the diagnosis of von Willebrand disease (vWD). Innovance®vWF Ac assay was designed to Sysmex CA (Siemens) coagulometer. The aim of the study was to develop and validate a method for Innovance®vWF Ac in the ACL TOP 700 (Instrumentation Laboratory) coagulometer and to compare its performance against vWF Activity assay (Instrumentation Laboratory, vWF Act) and Ristocetin cofactor assay by light transmission aggregation (vWF:RCo). The method was designed, calibrated and validated through verification of linearity and total precision studies at two levels of control plasmas. vWF activity was measured by Innovance®vWF Ac and vWF Act in 82 consecutive samples with vWF Act values within the reportable range. For method comparison, Deming regression was used. The initial analysis of results showed that they were not statistically comparable with a negative Bias with Innovance®vWF Ac in samples with vWF Act>150%. Excluding these samples, Deming regression curve showed that both tests gave statistically comparable results, and also did Innovance®vWF Ac and vWF:RCo in a subset of 27 samples. The adaptation of the Innovance®vWF Ac method on the ACL TOP 700 coagulometer was successful, it met the quality requirements of the laboratory for linearity and accuracy, providing comparable results to vWF Act and vWF:RCo in the of 5-150% range, useful for vWD diagnosis.

Key words: Von Willebrand activity; Ristocetin cofactor; Von Willebrand disease.

Resumo

Medir a atividade do fator von Willebrand (vWF) é importante para o diagnóstico da doença de von Willebrand (vWD). A equipe Innovance®vWF Ac (Siemens Healthcare Diagnostics) utiliza um método imunoturbidimétrico projetado para coagulômetros Sysmex CA (Siemens). O objetivo do estudo foi desenvolver e validar a metodologia do reagente Innovance®vWF Ac para o coagulômetro ACL TOP 700 (laboratório de instrumentação, IL) e realizar um estudo comparativo do seu desempenho perante a técnica vWF Activity (vWF Act, IL) e a do cofator de ristocetina (vWF:RCo) por agregação de transmissão de luz. A técnica foi projetada, calibrada e validada através de testes de verificação da linearidade e total precisão para dois níveis de controle. Foi mensurada a atividade do vWF pelos métodos Innovance®vWF Ac e vWF Act em 82 amostras consecutivas dentro do intervalo reportável. Para comparar métodos foi utilizada a regressão de Deming. A análise inicial dos resultados da Innovance®vWF Ac e vWF Act demonstrou que eles não eram estatisticamente comparáveis. Observou-se um viés negativo para Innovance®vWF Ac em amostras com vWF Act> 150%. Excluindo as mesmas, foi demonstrado que os resultados de ambos os testes eram comparáveis, do mesmo modo que os Innovance®vWF Ac e vWF:RCo num subgrupo de 27 amostras. A adaptação do método Innovance®vWF Ac no ACL TOP 700 foi bem-sucedida, apresentou linearidade e precisão conforme os requisitos de qualidade do laboratório, fornecendo resultados comparáveis aos vWF Act e vWF:RCo na faixa de 5-150%, útil para o diagnóstico da vWD.

Palavras-chave: Atividade do fator de von Willebrand; Cofator de ristocetina; Doença de von Willebrand.

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Introducción

La enfermedad de von Willebrand (vWD) es el defecto hemostático más frecuente y es causada por la deficiencia cuanti y/o cualitativa de factor von Willebrand (vWF) plasmático. La molécula de vWF es una glicoproteína de muy alto peso molecular que interviene en la hemostasia primaria ya que es el iniciador indispensable de la adhesión plaquetaria al colágeno subendotelial en condiciones de altas fuerzas de cizallamiento ⁽¹⁾. Esta acción la lleva a cabo a través de su unión al colágeno y a la glicoproteína (GP) Iba del complejo Ib-IX-V. Además, el vWF actúa como transportador plasmático del cofactor VIII de la coagulación protegiéndolo de la degradación por enzimas proteolíticas. Para el diagnóstico básico de la vWD se necesita la medida de los niveles de Factor VIII, vWF antigénico y una medida de la actividad de vWF ⁽²⁾⁽³⁾. La técnica de cofactor de ristocetina (vWF:RCo), a través de la agregación plaquetaria por el método de transmisión de luz, es considerada como referencia para medir la actividad del vWF. No obstante, presenta problemas importantes de reproducibilidad y límite de detección, y su ejecución presenta cierta complejidad ⁽⁴⁾. Se han desarrollado métodos de actividad automatizables para tratar de reemplazar el ensayo original de vWF:RCo, entre ellos los inmunoturbidimétricos con anticuerpos monoclonales que detectan el epitope en el dominio A1 presente en la molécula de vWF, responsable de la unión a la GP Iba ⁽⁵⁾⁽⁶⁾. Estos ensayos han demostrado buena sensibilidad a valores bajos y reproducibilidad.
Un nuevo método inmunoturbidimétrico automatizable para cuantificar la actividad del vWF, Innovance®vWF Ac, ha sido desarrollado recientemente. En esta técnica, partículas de poliestireno recubiertas con un anticuerpo anti GP Ib son puestas en contacto con una GPIb mutada con ganancia de función ⁽⁷⁾ que es capaz de unirse al vWF en ausencia de ristocetina. Esta unión hace que la aglutinación se produzca y de esa forma aumente la densidad óptica. Este ensayo tiene técnicas descriptas para los coagulómetros Sysmex y Siemens y ha demostrado buenos resultados ⁽⁸⁾.
El objetivo del presente trabajo fue desarrollar y validar una técnica para el equipo Innovance®vWF Ac en el coagulómetro ACL TOP 700 y comparar su desempeño con el de las técnicas vWF Act y vWF:RCo.

Materiales y Métodos

Se diseñó la técnica del equipo Innovance®vWF Ac (Siemens Heathcare Diagnostics, Marburg, Germany), adaptándola de los protocolos establecidos por el fabricante para los coagulómetros Sysmex CA 560 y el BCS (Siemens). Las condiciones de la misma pueden verse en la Tabla I. Se calibró utilizando un plasma calibrador, HemosIL Calibration Plasma (Instrumentation Laboratory, IL, Milan, Italy), se verificó la linealidad a través de 6 diluciones (procesadas por duplicado) de un pool de plasmas de individuos sanos, considerando como requerimiento de calidad un error sistemático <5%. El coeficiente de variación (cv) interensayo fue calculado a través del procesamiento de los controles normal y patológico por duplicado en 10 jornadas de trabajo diferente. Como control normal se procesó el Normal Control Assayed (IL) y como control patológico el SAC-2 (Helena Laboratories, Team Valley Trading Estate, UK).

Tabla I. Condiciones del ensayo

Para la comparación de métodos se procesaron 82 muestras consecutivas que abarcaban todo el rango reportable, a lo largo de 10 jornadas de trabajo. A las mismas se le midió la actividad del vWF por los 2 métodos: vWF Act e Innovance®vWF Ac. Los valores de las muestras se distribuían: 19≤50%, 19>50≤80%, 32>80≤150% y 12≥150%.
Para la técnica de vWF Act de IL se utilizó la metódica diseñada para los coagulómetros de la familia ACL TOP y para la técnica de Innovance® vWF Ac se utilizó la metodología descripta en la Tabla I.
En un subgrupo de 27 muestras, además se determinó la actividad de vWF:RCo a través del método de agregación de transmisión de luz ⁽⁹⁾ utilizando plaquetas liofilizadas reconstituidas con buffer tris salino y Ristocetina (concentración final 1 mg/mL), todos reactivos provistos por el fabricante (Helena Laboratories). Esta técnica se realizó en un agregómetro bicanal, con procesamiento de datos a través de la interfase Aggrolink vWF:RCo (Chrono-Log, Havertowm, PA, EE.UU.).
En los tres métodos la curva de calibración fue realizada con el mismo lote de calibrador (HemosIL Plasma Calibrator), y se utilizó el valor asignado por el fabricante para la técnica de vWF Act.
Para la comparación del método Innovance®vWF Ac con vWF Act y vWF:RCo se utilizó la regresión de Deming. Tanto la regresión de Deming como el cálculo de linealidad se realizaron en el programa EP Evaluator versión 9.

Resultados

Precisión interensayo: el cv interensayo obtenido fue 4,55% para control normal que presentaba niveles medios de vWF Act de 82%. El cv del control patológico (media 32%) fue 2,92%.
Linealidad: El rango de concentraciones utilizadas para verificar la linealidad de la prueba fue de 5 a 135%. Se obtuvo una recta (Fig. 1) con pendiente 0,969 y ordenada al origen de 0,068, con un error de 1,8%. Por lo tanto, cuando se utilizó un requerimiento de calidad de 5% de error sistemático permitido, la linealidad fue verificada correctamente.

Figura 1. Se observa la curva de regresión que demuestra la linealidad del ensayo adaptado de Innovance®vWF Ac en el coagulómetro ACL TOP 700.

Comparación de métodos: En la comparación inicial de las 82 muestras procesadas en paralelo con la técnica vWF Act e Innovance®vWF Ac se obtuvo una curva de regresión de Deming (Fig. 2 a) con pendiente 0,819 (95% IC 0,758-0,881), ordenada al origen 9,83 (95% IC 3,53-16,13) y desvío estándar (DE) de 13,01. Esto demostraba que los resultados obtenidos con ambas metodologías no eran estadísticamente equivalentes. Analizando el gráfico de Blant Alman, se observó un Bias negativo (-7,68%) para Innovance®vWF Ac y esto se debía a las diferencias en las muestras con vWF Act>150% (Fig. 2b). Por lo tanto, se decidió descartar los resultados de las 12 muestras con valores de vWF Act>150%. Al analizar los resultados de las 70 muestras remanentes, se obtuvo una curva de regresión de Deming (Fig. 3 a) con pendiente 0,967 (95% IC 0,894-1,041), ordenada al origen 0,62 (95% IC -5,66 a 6,91) y DE de 10,84. De esta manera, en el gráfico de Blant Alman se observó una disminución del Bias (-2,48%), con distribución homogénea de los datos (Fig. 3 b). Los resultados obtenidos por ambas metodologías fueron estadísticamente equivalentes en el rango evaluado de 5 a 150%.

Figura 2. Curva de regresión de Deming entre los resultados obtenidos del total de las muestras evaluadas, con las técnicas Innovance®vWF Ac y vWF Act (a); curva de Blant Alman del Bias% de los resultados de la técnica Innovance®vWF Ac en función de los valores de vWF Act cuando se analizaron el total de las muestras, (b). Los puntos encerrados en el óvalo representan las muestras con valores de vWF Act>150%.

Figura 3. Curva de regresión de Deming entre los resultados obtenidos luego de excluir las muestras con vWF Act>150%, con las técnicas Innovance®vWF Ac y vWF Act (a); curva de Blant Alman del Bias % de los resultados de la técnica Innovance®vWF Ac en función de los valores de vWF Act cuando se analizaron solamente las muestras con valores de vWF Act<150% (b).

Cuando se analizaron los valores de Innovance®vWF Ac frente a los de vWF: RCo por agregometría, excluyendo los 3 valores de vWF: RCo>150%, se obtuvo una curva de regresión de Deming (Fig. 4) con pendiente 1,068 (95% IC 0,947-1,188), ordenada al origen -0,9 (95% IC -11,3 a 9,6) y DE de 10,2, demostrando que los resultados obtenidos eran estadísticamente comparables.

Figura 4. Curva de regresión de Deming entre los resultados obtenidos luego de excluir las muestras con vWF:RCo>150%, con las técnicas Innovance®vWF Ac y vWF:RCo.

Discusión y Conclusiones

La vWD es la patología hemorragípara más frecuente en la población general, por lo cual, la determinación de la cantidad y la funcionalidad del vWF es frecuentemente solicitada en los laboratorios clínicos de Hemostasia y Trombosis. Disponer de técnicas con precisión y exactitud adecuada, así como procedimientos preanalíticos controlados y estandarizados, es indispensable para abordar el diagnóstico de esta enfermedad de manera correcta y eficiente ⁽¹⁰⁾. La técnica de vWF:RCo por agregación de transmisión de luz es ampliamente utilizada y considerada de referencia para evaluar los niveles de actividad del vWF, sin embargo, tiene algunos problemas de precisión así como falta de sensibilidad para discriminar valores inferiores a 10% ⁽⁴⁾. Se desarrollaron técnicas de unión del vWF al colágeno, pero éstas están pobremente estandarizadas y varían mucho con el tipo de ensayo y de colágeno utilizado (11). En la década pasada se diseñaron técnicas inmunológicas, ELISA o inmunoturbidimétricas, que utilizan anticuerpos que detectan el epitope presente en la molécula de vWF Ac cuando tiene una estructura y composición multimérica adecuada, responsable de la unión a la GP Iba plaquetaria ⁽⁵⁾⁽⁶⁾. Estos métodos han demostrado buena sensiblidad a valores bajos y mejor precisión que el vWF:RCo ^(12)(13). En estudios previos, se comparó el desempeño de una técnica de este tipo, vWF Act, con la de vWF:RCo y se observó que ambas arrojaban resultados estadísticamente comparables ^(14)(15).
Recientemente, se ha desarrollado una nueva prueba inmunoturbidimétrica, Innovance®vWF Ac, que como fue descripto en la introducción, utiliza una GPIb mutada con ganancia de función ⁽⁷⁾ que es capaz de unirse al vWF en ausencia de ristocetina. Este ensayo ha demostrado correlacionar muy bien con la técnica de vWF:RCo, tener una muy baja imprecisión y muy buena sensibilidad a valores bajos (especialmente a través de una curva de rango bajo), con buena reproducibilidad cuando las muestras son procesadas en 2 diluciones ⁽⁸⁾.
Este método tiene descriptas técnicas para los coagulómetros Sysmex y Siemens, pero no para otro tipo de coagulómetro. En el presente artículo se presenta la adaptación realizada para su aplicabilidad en otra plataforma, la del coagulómetro ACL TOP 700. Esta adaptación fue realizada utilizando una longitud de onda diferente a las que están establecidas por las técnicas del fabricante para sus líneas de coagulómetros, así como proporciones de muestra y reactivos, tiempos de incubación y adquisición diferentes. La técnica adaptada demostró buena precisión y linealidad, además de resultados comparables a los de las técnicas vWF Act y vWF:RCo en niveles inferiores a 150%. Cuando la actividad de vWF fue superior, el método adaptado arrojó resultados inferiores a los de vWF Act y vWF:RCo. Esto podría explicarse por la falta de un protocolo de redilución establecido para valores > 150% en el ensayo adaptado, como sí está disponible en la técnica vWF Act.
Las distintas variantes de vWD se establecen a través del estudio del patrón multimérico de la proteína. No obstante, los niveles funcionales y los antigénicos son relacionados a través de una razón vWF:RCo/vWF:Ag para orientar al diagnóstico del subtipo de vWD tipo 1 (vWF:RCo/vWF:Ag≥0,7) o tipo 2 (vWF:RCo/vWF:Ag<0,7) ^(1)(3)(16). En estudios previos, al comparar el desempeño de la técnica vWF Act con la de vWF:RCo se observó que ambas arrojaban resultados comparables tanto en muestras con razón > o < 0,7. En el presente estudio, dentro de las 19 muestras con vWF Act< 50% los resultados de Innovance®vW Ac no mostraron diferencias importantes con los obtenidos por vWF Act, tanto en las muestras con vWF:RCo/vWF:Ag≥0.7 (n=13) como en las de vWF:RCo/vWF:Ag<0,7 (n=6), no modificando estas razones en ningún caso, si bien no se pudo llevar a cabo la regresión de Deming por el escaso número de muestras (datos no mostrados).
Otra utilidad importante de la medición de la actividad del vWF es evaluar la respuesta a una medicación muy frecuentemente utilizada para aumentar sus niveles en plasma, la desmopresina. Dentro de los datos evaluados, se midieron las muestras de 2 pacientes a los que se les estudiaron 3 puntos de la curva de desmopresina (basal, 60 y 120 min), uno respondedor y otro no respondedor, arrojando las dos técnicas vWF Act e Innovance® vWF Ac resultados similares (datos no mostrados).
En conclusión, el nuevo método de actividad de von Willebrand, Innovance®vWF Ac fue exitosamente adaptado y validado en el coagulómetro ACL TOP 700, para niveles entre 5 y 150%, con un desempeño analítico correcto y similar al vWF Act, técnica con diseño coagulómetro específico ampliamente utilizada. Futuros estudios deberían hacerse para verificar la experiencia presentada, especialmente fuera del rango verificado en el presente artículo.

DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran no tener conflicto de intereses para la confección de este manuscrito.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Dra. Alicia Banchero y a la empresa Siemens Health Care por haber provisto el reactivo Innovance®vWF Ac necesario para la realización del estudio.

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Recibido: 10 de enero de 2014
Aceptado: 6 de mayo de 2014